Jesús Vega Herrera.

Curso: Cultivos Celulares

ACTIVIDADES TEMA 4

1.- ¿Qué función tiene el hecho de congelar alícuotas?

Es importante disponer de alícuotas congeladas de las células con el fin de minimizar la
acumulación de cambios genéticos en las líneas celulares debido a los sucesivos subcultivos,
evitar la fase de senescencia, la transformación de las líneas finitas y evitar la pérdida
accidental de líneas celulares por muerte o contaminación del cultivo.

2.- ¿En qué dos principios se basa el proceso de congelación?

- Principio de descenso crioscópico.
- Principio de ósmosis.

3.- Explica cómo se lleva a cabo la congelación de las células.

Cuando se tiene un conjunto de células que se quiere conservar en frío inicialmente las
células se tienen sumergidas en el interior de un recipiente que contiene una solución salina
isotónica, es decir, con la misma concentración que el interior celular.
Cuando se empieza a enfriar el preparado celular, el frío alcanza antes la solución exterior
que el interior celular. Esto trae como consecuencia que se empiece a formar hielo en el
medio extracelular cuando no se ha formado aún hielo dentro de la célula. A medida que se
forma el hielo extracelular el agua líquida va desapareciendo. Al disminuir la cantidad de
agua exterior, en base al principio de ósmosis antes enunciado, empezará a salir agua de la
célula para compensar la posible diferencia entre las concentraciones intra y extracelulares.
Al salir agua de la célula, la sal que estaba disuelta en su interior empezará a estar más
concentrada: tanto más concentrada cuanto más agua se expulsa; es aquí cuando interviene el
principio de descenso crioscópico dado que a pesar de estar más concentrada la disolución
salina intracelular, la temperatura a la que se formará hielo desciende: será más difícil que el
agua de dentro de la célula se congele y dañe sus estructuras. Así, mientras se enfríe poco a
poco, el proceso continuará indefinidamente: crecerá el hielo extracelular, saldrá agua de la
célula para compensar las concentraciones salidas dentro y fuera, se concentrará la sal dentro
de la célula y descenderá aún más la temperatura necesaria para que se forme hielo dentro.
Por ello, con una velocidad de enfriamiento suficientemente lenta podemos evitar por
completo la formación del dañino hielo intracelular.

4.- ¿Cuáles son los distintos métodos de criopreservación con los que contamos?
- Método lento.
- Método rápido (vitrificación y ultrarrápido).

5.- Nombra los daños más importantes que les puede ocurrir a las células al congelarlas.
- Hielo intracelular
- Excesiva toxicidad del crioprotector
- Incremento de la presión osmótica
- Reducción de la presión osmótica
- Daño de fractura

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- Hielo extracelular

6.- ¿Cuál es el motivo por el cual la vitrificación evita la formación de hielo tanto dentro
como fuera de la célula?
Se basa en la congelación rápida en una mezcla de altas concentraciones de crioprotectores,
que a bajas temperaturas aumentan su viscosidad formando un sólido amorfo, sin formación
de hielo que al enfriarse parece vidrio en el interior de las células. En este caso no se
producirán daños por formación de cristales de hielo.

7.- ¿Cuál es la función principal de un crioprotector?

Sus funciones principales son promover una rápida deshidratación celular,y amortiguar el
efecto de la alta concentración de solutos en el interior de la célula u organismo a
criopreservar.

8.- ¿Cuántos tipos de crioprotectores hemos visto?. Di las diferencias entre ellos y pon
ejemplos de cada uno.
– Crioprotectores no penetrantes: Son sustancias de alto peso molecular, efectivas a
velocidades altas de congelación, caracterizadas por ejercer su acción protectora
promoviendo la rápida deshidratación celular, por lo que suelen utilizarse asociados a los
agentes penetrantes. Los más utilizados son: sacarosa, dextrosa, glucosa, polivinilpirrolidona
(PVP), dextrano y polietilenglicol.
– Crioprotectores penetrantes: Son sustancias de bajo peso molecular que penetran en el
interior de la célula y actúan deshidratando la célula por sustitución del agua intracelular,
amortiguando el incremento de concentración de solutos en el medio extracelular, impidiendo
la formación de cristales en el interior y evitando el estrés osmótico. Los más empleados son
el 1-2 propanodiol, dimetilsúlfóxido (DMSO), etilenglicol y glicerol.

9.- Comenta el tiempo que puede conservarse una muestra de células en función de la
temperatura.
- Congelación a -20ºC: Las células pueden conservarse periodos de una semana.
- Congelación a -80ºC: Las células pueden permanecer varias semanas y/o meses
viables, aunque se empieza a detectar deterioro.
- Congelación con Nitrógeno líquido (-196ºC): Las células pueden permanecer
preservadas durante años.

10.- ¿Es lo mismo viabilidad celular que recuperabilidad celular? ¿por qué?
No, la viabilidad celular es la proporción de células vivas y funcionales existentes en una
población celular, mientras que la recuperabilidad celular se determina según la capacidad
proliferativa que poseen las células después de la descongelación, evaluando la viabilidad
celular después de varios días en cultivos y viendo la velocidad de proliferación que presenta
la línea celular descongelada.

11.- ¿Cómo debe ser el calentamiento, de forma general, cuando queremos descongelar
células? Explica el procedimiento.

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En la mayoría de las situaciones, el calentamiento rápido es esencial para una buena

supervivencia celular, con tasas subóptimas que aumentan la probabilidad de formación de
hielo intracelular a medida que la muestra se descongela, con la pérdida inevitable de la
viabilidad. Los recipientes de muestra más pequeños, como los crioviales, pueden sumergirse
en agua a 37 ° C y monitorearse visualmente hasta que los últimos cristales de hielo se hayan
derretido. Pequeñas variaciones del perfil de calentamiento requerido pueden causar una
pérdida significativa de viabilidad, por lo que las muestras deben transferirse directamente
desde nitrógeno líquido al baño de calentamiento.

12.- ¿Cuáles son los datos mínimos cuando hemos congelado un vial de células?
- Fecha de congelación
- Pase
- Código
- Posición de almacenamiento, etc
13.- Describe una cámara de Neubauer.
La cámara de Neubauer es una cámara de contaje adaptada al microscopio de campoclaro o al
de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo
del cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se ve en la
imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación entre dos líneas consecutivas de
0.25 mm. Así pues, el área redondeada y marcada le corresponde a 1 milímetro cuadrado. La
depresión central del cubreobjetos está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que
cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1 milímetro, y el
volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milímetro cúbico, es
decir 0.1uL. Si contamos las cuatro áreas sombreadas (L) observando un total de “x” células
entre las cuatro áreas, la concentración en la suspensión celular será: Concentración en la
suspensión (células / mL) = 10000 (x/4).Se puede observar con más detalle el aspecto de una
de las regiones marcadas como L y que en el microscopio se ven como una cuadrícula de 16
pequeños cuadrados de 0.25 milímetros de lado.

14.- ¿Con qué tipo de colorante debemos teñir la célula para realizar un conteo celular
con cámara de Neubauer? ¿Cuál es la característica de este colorante?
Entre los colorantes orgánicos más empleados para los ensayos de exclusión están: azul
tripán, eosina, rojo Congo y eritrosina B, siendo el azul tripán el colorante que más se ha
utilizado hasta el momento. En concreto, el azul de tripano o azul tripán,es un colorante que
se utiliza en histología para ensayos de viabilidad que permiten diferenciar células vivas de
células muertas. En las células viables, con membrana intacta, no se incorpora el azul de
tripán; por el contrario, si atraviesa la membrana de las células muertas. Por lo tanto, las
células muertas se muestran de un distintivo color azul bajo el microscopio(normalmente
empleando una “camara de Neubauer” para contarlas). Debido a que las células vivas
excluyen al colorante y no se tiñen. Este método también se llama método de tinción por
exclusión.

15.- ¿Cuáles son las situaciones más idóneas para usar un contador automático en vez
de una cámara de Neubauer ?

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Cuando el número de recuento es muy elevado o la concentración celular es muy elevada

16.- Resumen el funcionamiento de un contador Coulter.

Un contador Coulter típico posee uno o más microcanales que conectan dos cámaras
conteniendo una solución electrolítica sobre las cuales hay aplicada una diferencia de
potencial. La solución es forzada a fluir de una cámara a otra, arrastrando consigo las
partículas en suspensión que al atravesar el microcanal producen un breve cambio en la
resistencia del líquido. El contador detecta estos cambios en la resistencia eléctrica.
Las células, al tratarse de partículas muy poco conductoras, alteran la sección conductiva del
microcanal, causando que la resistencia entre los extremos del microcanal aumente y por lo
tanto provocando que la corriente eléctrica que atraviesa el canal disminuya por un breve
periodo de tiempo.
Al llevar un registro de los pulsos que ocurren en la corriente eléctrica, se puede contar el
número de partículas presentes en un determinado volumen
de fluido. La amplitud del cambio en la corriente que atraviesa el microcanal se encuentra
directamente relacionado al volumen de la partícula, permitiendo medir la distribución del
tamaño de las partículas contadas.

17.- ¿Cuáles son los métodos que podemos usar para determinar la viabilidad celular?

NOMBRE C. VIVAS C. MUERTAS FUNDAMENTO

COLORANTE Azul de Tripán Transparente Azul Estabilidad de la

membrana
plasmática

Calceína AM y Azul intenso Azul muy débil Actividad

Diacetato de catalítica de la
Fluoresceína esterasa

Ioduro de No emite Rojo - Estabilidad de la

Propidio membrana plasmática
- Unión a ADN y
ARN

Homodímero de No emite Rojo - Estabilidad de la

Etidio membrana plasmática
- Unión a ADN y
MOLÉCULA ARN
FLUORESCENTE
Homodímero de Verde intenso Rojo - Estabilidad de la
etidio + Calceína membrana plasmática
- Unión a ADN y
ARN
- Actividad catalítica
de la esterasa

Naranja de Verde (ADN) Mitosis No emite - Integridad de la

Acridina Rojo (ARN) G1/S/G2 membrana plasmática
interfase - Unión a ADN y
ARN selectiva

Naranja de Verde (ADN) Mitosis Rojo - Integridad /

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Acridina + Ioduro Rojo (ARN) G1/S/G2 estabilidad de la

de Propidio interfase membrana plasmática
- Unión a ADN y
ARN selectiva

Azul de Alamar Rojo o rosa No emite Actividad

(resazurina) catalítica de una
hidrolasa

COLORANTE MTT Violeta e Amarillo y Actividad

insoluble soluble catalítica de una
reductasa