Problema propuesto Mtodos Enzimticos, 06/05/2010

El carbaril (1-naftil-metilcarbamato) es un pesticida ampliamente utilizado en agricultura. Este compuesto es txico para el hombre debido a su accin inhibidora (reversible) sobre la enzima acetilcolinesterasa (ACE). Para determinar carbaril en diferentes muestras se buscan mtodos selectivos, que minimicen los procesos de tratamiento previo de las mismas. Un mtodo estndar para determinar carbaril es un mtodo enzimtico, basado precisamente en el efecto inhibidor del txico sobre ACE. Se utiliza en este mtodo un sustrato no-natural de la enzima ACE, como el 4-aminofenilacetato, que permite seguir la reaccin enzimtica amperomtricamente: ACE 4-aminofenilacetato (PAPA) + H2O a.

4-aminofenol + acetato

(1)

Qu tipo de mtodo enzimtico se utilizar? : Cintico, de equilibrio, ambos tipos de mtodos seran vlidos. Razona la respuesta. Qu tipo de inhibidor de ACE es el carbaril? Razona la respuesta. Para responder a esta ltima cuestin se realiz un estudio cintico de la reaccin enzimtica (1) en un medio de fosfato 0.1 M de pH 7.5, con 1 U de ACE, en ausencia de carbaril y en presencia de una concentracin de carbaril 2.6 M. Los datos obtenidos se resumen en la siguiente tabla: -5 -4 -4 -3 -3 [PAPA] / M 6 10 1.8 10 3.5 10 1.1 10 2.5 10 vo (sin pesticida)/ mol 0.023 0.060 0.132 0.221 0.329 -1 min vo (con pesticida)/ mol 0.015 0.042 0.070 0.169 0.220 -1 min Obtn una expresin general que relacione el grado de inhibicin (ei = vo-vi / vo) con la concentracin de inhibidor (vo es la velocidad de reaccin en ausencia del pesticida y vi en presencia de una determinada concentracin de carbaril). b. Para obtener las caractersticas de calibracin del mtodo enzimtico se midi la velocidad inicial de la reaccin enzimtica (1) en un medio de pH 7.5 con 1 U de ACE, 10 mM de PAPA y cantidades crecientes de carbaril, obtenindose los siguientes resultados: [carbaril]/M 0 1 10 2 10 5 10 8 10 1 10 -1 v0 / mol min 0.480 0.390 0.335 0.224 0.172 0.150 Obtn la ecuacin de la recta de calibracin. (Se puede partir para ello de la expresin obtenida para el grado de inhibicin en el apartado a). c. Se utiliz el mtodo descrito para determinar carbaril en muestras de kiwi que han sido tratadas con el pesticida hace 21 das. Para ello se pelan las muestras y 8.2053 g de kiwi pelado y triturado se mezclan con 50 mL de metanol en un bao de ultrasonidos durante 2 minutos. La mezcla se filtra, lavando dos veces con 10 mL de etanol. Se recogen los filtrados, evaporando parte del disolvente en un rotavapor a 50 C, hasta obtener unos 20 mL, y finalmente, con metanol, se lleva la muestra a un volumen de 25 mL en un matraz. 10 mL de esta muestra se llevan a 25 mL con fosfato de pH 7.5. Una alcuota de esta disolucin se somete al mismo tratamiento que los patrones, midindose una velocidad de reaccin enzimtica de 0.211 mol -1 min . Indica si los kiwis sometido a tratamiento con carbaril son aptos para el consumo humano transcurridos 21 das despus del tratamiento. De acuerdo a la legislacin este tipo de fruta debe contener menos de 10 mg/Kg del pesticida. DATOS: Peso molecular del carbaril: 201.22
-6 -6 -6 -6 -5

Lidia Freije Fuente, 4A

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4
Esta reaccin est catalizada por la enzima acetilcolinesterasa(ACE). El carbaril inhibe la actividad de esta enzima.

a)

Para hacer la determinacin utilizaremos un mtodo cintico basado en la medida de las velocidades iniciales(Vo).

TIPO DE INHIBIDOR
[P] M 6,00E-05 1,80E-04 3,50E-04 1,10E-03 2,50E-03 Vo(sin) Vo(con) 1/[P] 1/Vo(sin) 1/Vo (con) mol/min mol/min 1/M min/mol min/mol 0,023 0,015 1,67E+04 43,478 66,667 0,060 0,042 5,56E+03 16,667 23,810 0,132 0,070 2,86E+03 7,576 14,286 0,221 0,169 9,09E+02 4,525 5,917 0,329 0,220 4,00E+02 3,040 4,545 1 Tabla 1

Como se observa en la tabla 1. la velocidad inicial de la reaccin disminuye en presencia del carbaril, es decir, acta como inhibidor. Para saber qu tipo de inhibidor es hacemos la representacin de Lineweaver-Burk para los dos casos:

70,000 60,000 50,000 40,000 1/Vo 30,000 20,000 10,000 0,000 0,00E+00 5,00E+03 1,00E+04 1,50E+04 2,00E+04 1/[P] Sin inhibidor con inhibidor

[P]=[PAPA]= concentracin del sustrato

Lidia Freije Fuente, 4A

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Ajustando los datos a dos rectas por mnimos cuadrados :

. . .

Sin inhibidor

. Con inhibidor .

. .

Por tanto, teniendo en cuenta que la pendiente ha de ser ordenada en el origen, 1 :

Vmax Sin Con 0,542 0,351 Km 1,30E-03 1,33E-03 2

, y la

Por tanto, con los resultados obtenidos estamos ante un inhibidor competitivo simple.

GRADO DE INHIBICIN

1 1 1 1 1
2

Unidades de Km son mol/L y las unidades de Vmax son mol/min

Lidia Freije Fuente, 4A

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b)

[I] M 0 1,00E-06 2,00E-06 5,00E-06 8,00E-06 1,00E-05

Vo 1/[I] mol/min 1/M 0,480 0,390 0,335 0,224 0,172 0,150

Grado inhibicin( E) 1/E 1,00E+06 5,00E+05 2,00E+05 1,25E+05 1,00E+05 0,0000 0,1875 0,3021 0,5333 0,6417 0,6875 5,333 3,310 1,875 1,558 1,455

Tabla 2 Representamos el inverso del grado de inhibicin3 frente al inverso de la concentracin de inhibidor (datos resaltados en azul).

6,000 5,000 4,000 1/ 3,000 2,000 1,000 0,000 0,00E+00 5,00E+05 1/[I] 1,00E+06 1,50E+06

Para calcularlo, tomamos como Vo el primer valor (sin inhibidor) y como Vi las siguientes (con inhibidor presente)

Lidia Freije Fuente, 4A

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4.34

0.09

10 0.999 0.998

1.03

0.04

Tratamiento c) 8.2053g kiwi 25ml

10 ml

25ml Alcuota: 0.211mol/min

. .

.
.

Metiendo este valor en el calibrado obtenemos una concentracin de 5.82 . . . . . . . . . . Cumple la legislacin. .

M.

Lidia Freije Fuente, 4A