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PRCTICA 1

Separacin de aminocidos por tcnicas de cromatografa de capa fina. Reacciones coloreadas de


aminocidos: prueba de ninhidrina.
Introduccin.
Con la siguiente prctica conseguimos conocer los aminocidos de una muestra problema y su identificacin
gracias a la reaccin coloreada con ninhidrina.
Tenemos una serie de muestras patrn con diferentes aminocidos.
La cromatografa es una tcnica que permite la separacin y purificacin de mezclas complejas en las
biomolculas que la componen.
Reactivas.
Glutamato, glicina, lisina, prolina y leucina al 1% en npropanol al 10% en agua destilada.
Solucin problema de aminocidos.
Eluyente: etanol: hidrxido amnico al 34% en una proporcin 7:3.
Resultados y discusin.
1. Separacin de aminocidos por cromatografa en capa fina sobre gel de slice.
Una vez revelada la placa hay que medir la distancia que separa el frente de avance de la lnea de aplicacin
de los patrones y de la muestra problema, a lo que denominamos Df (12,7).
Despus calculamos la Rf de cada uno de los aminocidos de la siguiente forma: Rf=D/Df siendo D la
distancia recorrida por cada muestra y Df la distancia del frente de avance.
MUESTRA

D(cm)

Rf

Lisina

0.5

0.03

Glicina
Glutamato

03.5
12

0.27
0.94

Prolina

0.31

Leucina

0.70

Al variar Rf segn los distintos aminocidos, nos permite distinguir ms fcilmente los aminocidos que
constituyen el problema. Esta variacin se produce debido a que las fuerzas de avance ejercidas por la fase
mvil en su desplazamiento sobre la estacionaria son diferentes. Hay que tener en cuenta la absorcin del
material utilizado.
1

Los compuestos ms solubles seguirn el camino del eluyente con ms velocidad lo que nos permite de
terminar las distintas alturas alcanzadas por las manchas de los diferentes patrones.

2. Identificacin de los aminocidos que componen la molcula.


Ya revelada la muestra observamos que tiene dos manchas, debido a que la muestra se compone de dos
aminocidos. Observando la similitud que guarda la muestra problema con los patrones, determinamos los
aminocidos que componen la muestra (glutamato y leucina)
PRACTICA 2
Reacciones coloreadas para la determinacin cualitativa de azcares. Prueba de la antrona y fehling.
Introduccin.
La prueba de la antrona se basa en determinar la naturaleza de un azcar problema mediante esta sustancia.
Llegaremos a una conclusin contrastando el problema con los patrones.
La prueba del fehling se basa en determinar si el azcar posee poder reductor ya que los azcares reductores
tienen una coloracin rojiza debido al oxido cuproso que es forma por oxidacin del azcar por medio del
catin Cu 2+.
Los azcares utilizados son la glucosa, fructosa, xilosa y sacarosa.
Resultados.
1. Prueba de fehling.
Ponemos en tubos de ensayo 2 ml de solucin de azcares y solucin problema. El blanco se obtiene con 2 ml
de agua destilada. Despus se aaden 5 gotas de fehling a los tubos. Una vez agitados se sitan al bao mara
observando los cambios de color de cada compuesto. Si hay cambio de color el azcar es reductor (maltesa), y
si no, no es reductor (sacarosa).

5 min.

BLANCO

SACAROSA

GLUCOSA

XILOSA FRUCTOSA

PROBLEMA

azul

azul

Azul

Azul

amari.

azul

azul claro

azul claro

Naranja claro

Naranja
oscuro

naranja claro

azul claro

"

"

"

"

"

"

1 min.
100*C
5 min.

De esta tabla se deduce que los azcares reductores son la glucosa, la xilosa y la fructosa, dado que cambian
de color.
2. Prueba de la antrona.

Preparamos el blanco con dos gotas de agua destilada y 2 ml de antrona, 4 tubos con las muestras patrn con
una gota de cada azcar y 2 ml de antrona, y otro tubo con una gota de la muestra problema y 2 ml de antrona,
ponindolos a continuacin al bao mara.

Se obtuvieron los siguientes resultados:

5 min.

BLANCO

SACAROSA

GLUCOSA

XILOSA

FRUCTOSA

PROBLEMA

Amarillo

Verde oscuro

Verdeazul

Verdeazul verde oscuro

verde oscuro

Amarilloverde negro

Negro

Negro

negro

negro

"

"

"

"

"

1 min.
100*C
5 min.

"

Discusin.
En la prueba de antrona todas las muestras dieron positivo porque utilizamos azcares en forma de hexosa o
pentosa, sin embargo, en la prueba de fehling la sacarosa no dio positivo porque tiene carcter no reductor
debido al enlace glucosdico (12) donde estn situados los hidroxilos de los carbonos anomricos de la
glucosa y de la fructosa.
PRCTICA 3
Determinacin cuantitativa de pnitrofenol por espectrofotometra visible
Introduccin.
La espectrofotometra visible consiste en una Tcnica analtica basada en la capacidad de absorcin de
determinadas molculas para determinadas radiaciones.
Obtencin del espectro de absorcin del pnitrofenol.
Preparamos una disolucin con 2,5 ml de solucin de pnitrofenol 0,2 mM con 1 ml de NaOH 0,5N y 4 ml de
agua destilada, y otra disolucin (blanco) con 1 ml de NaOH 0,5N y 4 ml de agua destilada.
Llevamos las disoluciones al espectrofotmetro y medimos la absorbancia de la primera disolucin con
distintas longitudes de onda, sirvindonos el blanco para calibrar la mquina.

360

380

390

395

400

405

415

440

460

Llevando los datos a una grfica.


Observando la curva vemos que la mxima absorbancia se da a una longitud de onda de aproximadamente
400 nm.
3

Curva de calibrado de pnitrofenol.


Preparamos seis disoluciones a partir de la de pnitrofenol 0,2 mM indicadas en la tabla, y de cada una
tomamos 2,5 ml, aadindole 1 ml de NaOH 0,5N y 1,5 ml de agua destilada.
A continuacin determinamos la absorbancia de las muestras fijando la longitud de onda mxima (400 nm),
utilizando el blanco para calibrar el espectrofotmetro.

MUESTRA
0
1
2
3
4
5
6

[PNITROFENOL] (mM)
0
10
20
40
50
100
200

ABSORBANCIA
0.054
0.156
0.247
0.448
0.526
0.562
1.180

Llevando los datos a una grfica obtenemos:


Clculo del coeficiente de extincin molar del pnitrofenol en su longitud de onda mxima y la ecuacin de
LambertBeer.
La ecuacin de dicha ley es: A=EmdC
siendo:
Em= coeficiente de extincin molar
d= longitud del medio (cubeta de d=1 cm)
C= concentracin
A, cuando d=1 cm, se denomina densidad ptica y se representa como DO .
Esta ley dice que cuando una radiacin pasa a travs de una sustancia que absorbe luz, parte de esa radiacin
es absorbida,
y parte sale con menor intensidad de la que llega, con base a esta ley conociendo la absorbancia de la
disolucin podremos hallar su concentracin, pero cuando una disolucin demasiado concentrada se produce
un apantallamiento de la luz que llega.
Utilizando los datos del tubo 2:
Em=A/dxC=0,25/1x20mM=12500 1/cmxM
Determinacin de la concentracin de una solucin problema de pnitrofenol.

La solucin problema de pnitrofenol se obtiene mezclando en un tubo de ensayo 2,5 ml de solucin


problema con 1 ml de NaOH 0,5N y 1,5 ml de agua destilada. Medimos la absorbancia a 400nm y fue 0,315.
Llevando este dato a la curva obtenemos que tenemos una concentracin de 24 mM.

Despejando la concentracin de la frmula de LambertBeer obtenemos: C=A/12500=0,315/12500=25,2mM


El NaOH es muy necesario porque neutraliza la acidez a la que queda la disolucin de pnitrofenol que es un
cido dbil, y es una molcula polar que aumenta, la salida de iones H+, y por lo tanto, la acidez.
PRCTICA 4
Extraccin y ensayo de actividades glicosidasas de girasol. Efecto de la concentracin de enzimas, pH,
temperatura y concentracin de sustrato sobre la actividad enzimtica.
Introduccin.
Estudiaremos la reaccin:
pnitrofenol Dmanopiransido > pnitrofenol + manosa
catalizada por la omanosidasa.
Resultado y discusin.
1. Determinacin de las velocidades iniciales.

TIEMPO (min.)

10

20

30

ABSORB. 400nm

0,8

1,54

2,86

3,4

68,3

131,62

244,4

290,6

[PNITROF]
(mM)

Pte de la grfica (K)=(yiyo)/(xixo)=(244,4131,62)/(2010)= 11,28 t.


v=d[pnitrofenol Dmanopiransido]/dt=Kt=11,28
siendo esta la ecuacin aproximada de la grfica, ya que hay imperfecciones en la medicin, observndose
que la concentracin aumenta con el tiempo.
2. Efecto de la concentracin de enzimas sobre la actividad enzimtica.

DILUCIN

[PNITROFENOL]

ML DE ESTRACTO

ABSORBANCIA

1/1

136,75

0,25

1,6

1/10

42,73

0,025

0,5

1/50

8,54

0,005

0,1

1/100

4,27

0,0025

0,05

La actividad enzimtica son los moles de producto por segundo que se forman de sustrato. Vo=[p]/t nKat

DILUCIN

1/1

1/10

1/50

1/100

ACTIVIDAD
ENZIMTICA

75,97

23,73

4,74

2,37

La recta responde a la ecuacin siguiente: V=Kcat[E]


Kcat=Pte=tg =(23,73x10 4,74x10 )Kat/(0,0250,005)ml= 9,5x10 Kat/ml
entonces: V=9,5x10 Kat/ml [volumen enzima]
[ Dmanosidasa]
La ecuacin responde a la primera parte de la grfica, cuando hay una cantidad de enzimas.
3. Efecto del pH sobre la actividad enzimtica.

pH
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
6,0

ABSORBANCIA
400 nm
0,4
0,6
0,8
1,4
0,7
0,3

[PNITROFENOL]
34,2 mM
51,3
68,4
119,6
52,8
25,6

ACTIVIDAD
ENZIMTICA
19 nKat
28,5
38
66,4
33,2
14,2
6

7,0

0,1

8,5

4,7

El pH ptimo de la reaccin est alrededor de 4,5.


4. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica.

TEMPERATURA

ABSORBANCIA

[P/NITROFENOL]

ACT.ENZIMTICA

20C

0,4

34,2

19 nKat

30

1,3

111,1

61,7

40

1,6

136,7

75,9

50

2,0

170,9

94,9

60

2,5

213,6

118,6

70

0,4

34,2

19

La temperatura ptima est alrededor de los 50C. A partir de esta temperatura se observa una cada muy
brusca de la velocidad debido a que a temperaturas altas los enzimas se desnaturalizan.
Qio es el aumento de la velocidad con un incremento de 10C.
Qio entre 30 y 40C=14,2 nKat |
Qio entre 40 y 50C=19 |> Qio=18,97 nKat
Qio entre 50 y 60C=23,7 |

Representacin de Arrhenius

1/T (K )

log[Vo/(VmaxVo)]

3,09x10

0,6

3,19x10

0,249

3,3x10

0,035

3,41x10

0,72

Pte recta=tg =Ea/R=(0,60,249)/[(3,193,09)x x10 ]=3510 K Ea=6,97 Kcal/mol


log [Vo/(VmaxVo)]=log K(Ea/R)(1/T)
7

5.Efecto de concentracin de sustrato sobre la actividad enzimtica.

SUSTRATO
10 mM
20
40
60
80
100
200
400
600

ABSORBANCIA
0,25
0,46
0,71
0,87
1,00
1,10
1,30
1,42
1,43

[PNITROFENOL]
21
39,3
60,7
74,3
85,4
94,0
111,1
121,4
121,9

ACT.ENZIMTICA
11,6 nKat
21,8
33,7
41,2
47,4
52,2
61,7
67,4
67,6

V=Vmax[S]/(Km+[S]) siendo Km la cte. de Michaelis que nos da la afinidad del enzima por el sustrato.
Observando la grfica vemos primero un aumento de velocidad rpido para despus ir aumentando ms
lentamente.
Ecuacin de LinewearerBurk (clculo Vmax)
1/[S]
1/Vo

0,0116
0,024

0,0125
0,021

0,0100
0,019

0,005
0,016

0,0025
0,014

Representacin de EadieHafstee.
Vo
11,6
21,8
33,7
41,2
47,4
52,2
61,7
67,4

[S]
10
20
40
60
80
100
200
400

Vo/[S]
1,16
1,099
0,8425
0,680
0,5925
0,522
0,3085
1,168