Pontificia Universidad Javeriana Facultad de ciencias basicas Departamento de Microbiologia Informe curvas patron para la determinar azucares reductores

(DNS), cuantificacion de proteinas (Bradford) y cuantificacion de almidon (yodatoyoduro) Viernes – Grupo 7 Nicolas Martinez Aldana, Luis miguel chaves

RESUMEN Objetivo: Realizar una serie de curvas patrón por los métodos de DNS, Bradford y yodo-yoduro, para la cuantificación de azúcares reductores, proteínas totales y almidón, respectivamente. Materiales y métodos: Para la cuantificación de azúcares reductores se utilizaron soluciones de glucosa con concentraciones entre un rango de 0,5 a 1,7 g/L, y esto se realizó con la técnica del ácido 3,5 Dinitrosalicílico (DNS), para la cuantificación de proteínas se utilizo la técnica de Bradford y solución de albúmina en un rango de concentración de 100 a 700 μg/mL, para cuantificar la cantidad de almidón se utilizó una solución de este a concentraciones entre 300 y 1000 μg/mL, para esto se utilizó espectrofotometría, con los datos que se obtuvieron en cada etapa del procedimiento se realizo una regresión lineal donde se obtuvo una ecuación que describe la absorbancia en términos de la concentración. Resultados: La ecuación que describe la relación entre la absorbancia y la concentración de azucares reductores fueY= 0,5105x0,0149 con un r2 = 0,9982, la ecuación que describe esta relación con proteínas es Y=0,0953x+0,0439 con un r2 = 0,9952 yla que describe la concentración de almidón es Y=0,0004x+0,1251 con un r2= 0,9845. Conclusión: Con el uso de las curvas patrón se pudo determinar ecuaciones que nos permiten identificar la concentración de proteínas extracelulares, azucares reductores y el almidón.

PALABRAS CLAVES: Curva Patrón, azucares reductores, ácido 3,5 dinitrosalicílico, proteínas, Bradford, almidón, yodato-yoduro, absorbancia

INTRODUCCION

Cada sustancia. proteínas totales y almidón. MATERIALES Y METODOS: . uno de los más usuales es el método de Bradford. El yodo por fuerzas de Van der vals se une a los enlace α 1-4 del almidón formando un complejo de inclusión que forman un color violeta (5). para la cuantificación de azúcares reductores. pero sin duda. Se dice que la respuesta de la muestra puede ser cuantificada y.Una curva patrón. proteínas y almidón. del ácido bicincónico. el cual se basa en la reducción del DNS (de color amarillo) por la glucosa u otro azúcar reductor al ácido 3-amino-5-nitrosalicílico (de color rojo ladrillo). Se basa principalmente en una relación lineal entre un carácter medible. en un medio débilmente ácido.5 di-nitrosalicílico o llamado también DNS. si se emplea la curva de calibración. o curva de calibración es una herramienta de la química analítica que se emplea para medir la concentración de una sustancia en una muestra. por ejemplo para el desarrollo de este laboratorio se utilizaron dos variables como lo son la absorción que guiados por la teoría cuántica que dice que si hay una “colisión” entre un fotón y un receptor (átomo. requiere de diferentes métodos para su cuantificación. tras la unión a las proteínas torna a color azul (4). en condiciones fuertemente ácidas el colorante suele ser más estable. para la cuantificación del almidón se utilizó la técnica yoduro – yodato esta prueba se basa en la reacción donde. hay una probabilidad finita de que su energía pueda ser transferida al receptor en un proceso discontinuo. entre otros. Para cuantificar azúcares reductores se utiliza el método del ácido 3. método de Lowry. en términos simples el receptor puede absorber energía o no(1). por su composición química. que se basa en un equilibrio entre las tres formas del azul de Commassie (colorante). respectivamente.La otra variable que se utilizo fue la concentración de la sustancia o elemento que se quería determinar. Bradford y yodo-yoduro. ion o molécula). El objetivo de esta introducción es ilustrarnos para cumplir el objetivo de la practica el cual es realizar una serie de curvas patrón por los métodos de DNS. Finalmente. el siguiente paso es establecer una relación matemática con los datos obtenidos. existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas como reacciones de biuret. Estos métodos suelen tener una respuesta lineal sobre la que se le realiza un análisis estadístico de regresión para evaluar la confiabilidad de los datos (2). se puede interpolar el dato de la muestra problema hasta encontrar la concentración del analito. En la practica de laboratorio se llevaron a cabo tres curvas patrón. azúcares reductores. por asimilación de los elementos de una concentración conocida. por otro lado. ocurre rápidamente liberando yodo el cual se detecta fácilmente con almidón. Para realizar la curva de calibración se realizo una serie de diluciones a partir de una muestra cuya concentración se conocía previamente. tornando a un color rojo. cuya presencia puede detectarse por lectura de la Absorbancia en la longitud de onda de 540nm (3).

0. Curva patrón para la determinación de azúcares reductores.400. Para la determinación de la concentración de proteínas mediante la técnica de Bradford se preparo un blanco con 0. 1. al terminar este tiempo se pasaron los tubos a un recipiente que contenía hielo para frenar la reacción.5ml de agua destilada y luego se realizó una medición en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 540nm.25ml de reactivo DNS y 0.7. se midió la absorbancia de estas soluciones a una longitud de onda de 595nm CURVA PATRON PARA LA DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE ALMIDON: Con la ecuación de la volumetría se prepararon soluciones con las siguientes concentraciones de almidón 300.7) g/L se preparo una solución que contenía 0.5. Para la determinación de la concentración de glucosa mediante la técnica de DNS se preparo un blanco con 0.5. 0. 1. Una vez que se enfriaron los tubos se les agregó 2. RESULTADOS 1. . 1ml de solución de yodo-yoduro y 2 ml de agua destilada y a partir de las diluciones preparadas se preparan soluciones con 1ml de estas mas 1ml de reactivo yodo-yoduro y 2ml de gua destilada.0.7.25ml de la dilución mas 0. 300.25ml de agua. se homogenizan y se leen en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 650nm. 1.400.1ml de NaCl y 5ml de reactivo de Bradford y se prepararon soluciones que contenían 0. CURVA PATRON PARA LA DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE PROTEINAS: Con la ecuación de la volumetría se prepararon soluciones con las siguientes concentraciones de albumina 100.1ml de cada dilución con 5ml del reactivo de Bradford. Para la determinación de la concentración de almidón mediante la técnica de yodo-yoduro se preparo un blanco con 1ml de solución de sales. 600.600.7) g/L. 0.500.25ml de DNS. con las concentraciones de glucosa (0. 1.700.5. 1. al cabo de esto se llevaron estos tubos a una temperatura de ebullición por 5 minutos. 1. 700 μg/ml.CURVA PATRON PARA LA DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES: Con la ecuación de la volumetría se prepararon soluciones con las siguientes concentraciones de glucosa (0.800 y1000 μg/ml. 200.5.

64373 25.837 0.811 0.754 0.La curva patrón para cuantificación de azúcares reductores se obtuvo producto de los resultados del experimento llevados a cabo por las monitoras y por los estudiantes del laboratorio.025 0.316 0.251 0.792 0.068 4 0.808 1.962 2 0.454 0.89211 29.480 0.323 0. Resultados de la curva patrón de glucosa por DNS (estudiantes) Concentración de azúcar en g/L Vs.094927 0. .060 1.139 0.077 3 0.304 0.750 0.933 5 0.261 0. Los resultados se consignan a continuación en la tabla número 1 y en la tabla número 2.318 0.028 0.300 0.7 2 1 0. los cuales se encuentran fuera del rango de un estudio químico (máximo 5%).5 1.328 0.693 0.139 3.712 0. Concentración de azúcar en g/L Vs.154546 0.006 8 0.16797 10.33974 30.470 0.831 1.498 0.755 0.785 0.758 1.7 2 1 0.051 0.240 0. Abs a 540nm GRUPOS Concentraciones (g/L) 0.362 0.871 3 0.523 0.879 0.419 0. en la que se observa un aumento de las absorbancias conforme aumentan las concentraciones de azúcar.932 7 0.532 0.947 Promedio 0.5 1.5 0. así como los coeficientes de variación.130 6 0.7 1 1.011 DS 0.130 1. Tabla 2.856 0.290 0.697 0.212 0.632 0.876 1.254 11.827 0. Abs a 540nm (monitoría) Réplica Concentraciones g/L 0.699 1.026 0.214 11.250809 0. Tabla 1.949 1.490 0. Resultados de la curva patrón de glucosa por DNS (monitoría).418 0.488 0.211 0.085 7.352 0.896 1.207 0.241 0.367 0.071 CV (%) 10.079942 0.995 DS 0.293 0.817 0.233 0.261 0.379 0.084 0.7 1 1.221332 0.17516 En la tabla número 2 se registran los datos de los 8 grupos de laboratorio tomados para cada una de las concentraciones de glucosa.240 0.374 0.984 Promedio 0.727 0.424 0. Se puede observar que el coeficiente de variación es alto.655 0.52879 29.005 8.304 0.146 La tabla 1 muestra los resultados obtenidos por las monitoras al efectuar el ensayo de DNS sobre las muestras de glucosa.166 2 0.027 0.102896 CV 30.280 0.5 0.

879 0. según lo obtenido por las monitoras del laboratorio.532 0.7 1 1.518 8. Figura 1.932 7 0.774 0.365 5. para cada una de las muestras.792 0.074 0.500 0.328 0. debido a que el mismo era demasiado alto y se encontraron réplicas que se encontraban demasiado desviadas de los datos experimentales de control interno.028 0.579 11.379 0. . Se eliminaron grupos de datos para obtener un menor coeficiente de variación entre las absorbancias medidas.7 2 1 2 3 0.304 0.238 6.693 0.237 0.758 1.337 0.5 0.038 0.261 0.211 0.240 0.Tabla 2a.069 0.837 0.5 1. Gráfico representativo de la curva patrón de glucosa (monitoría).025 0.876 1.600 9.006 8 Promedio 0. Resultados de la curva patrón de glucosa por DNS RECORTADO (autores) Concentración de azúcar en g/L Vs.002 DS 0.068 4 5 6 0. Abs a 540nm (recortado) GRUPOS Concentraciones (g/L) 0.795 La tabla 2a registra las réplicas que más se acomodan a la tendencia de los datos de absorbancia.480 0.838 1.488 0.068 CV (%) 10.

262 0.178 0.3893333 0. 2.036 0. respectivamente.226 0. Figura 2.557 0.763 0. de absorbancias Vs.422 0.361 0.733 2 0.En la figura 1 se puede apreciar la relación casi lineal entre las concentraciones de glucosa y las absorbancias de cada una. Gráfico representativo de la curva patrón de glucosa (autores).387 0.415 0.491 0. Resultados de la curva patrón de proteínas por el método de Bradford (monitoría) Concentraciones de Albúmina de suero bovino Vs. En la figura 2 se observa la representación gráfica de los datos obtenidos por los estudiantes.0376430 .262 3 7 0.0295691 0.758 Promedi 0.4426666 o 0.684 3 0. En las tablas 3 y 4 se registran los datos obtenidos de proteínas totales (albúmina de suero bovino) por el método de Bradford. realizado por las monitoras del laboratorio y por los estudiantes. Abs a 595nm (monitoría) 200 Réplica 100 µg/mL µg/mL 300 µg/mL 400 µg/mL 600 µg/mL 700 µg/mL 1 0.082 0.298 0.725 DS 0.1039278 0.9962. de las 3 réplicas que más se ajustaron a los resultados del control.684 0.42 0.175 0. Tabla 3.668 0.145 0.0545802 0. Concentraciones.0420039 0. Curva patrón para la cuantificación de proteínas. y la regresión lineal de los datos con la ecuación de dicha regresión y su r2 de 0.

Concentraciones de Albúmina de suero bovino Vs.1921462 4 8 9 1 8 7 En la tabla 3 se consignan los resultados obtenidos por las monitoras del laboratorio en la prueba.082 0.658 8 0. Se puede observar que el coeficiente de variación es alto.363 0. se encontraron problemas en el muestreo de uno o más puntos.165 0.399 0.092 0.266 0.555 5 0.165 0.514 0.609 Promedio 0. Se pudo observar que al ser el coeficiente de variación tan alto.399 0.558062 5.216 0.763 25.041 0.112 0.377 0. Tabla 4.170 0.208 0.282 0. Tabla 4a.112 0.515 0.426 0.CV (%) 2 3 7 6 6 37.239 0.377 0.226 11.112 0.221 0.237 0.141 0.553 15. Resultados de la curva patrón de proteínas por el método de Bradford (autores). Abs a 595nm (recortado) 100 200 300 400 600 700 Grupo µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL 1 2 3 4 0.237 0.049 0.171 En la tabla 4 se consignan los resultados obtenidos por cada uno de los grupos de laboratorio en la prueba.280 0.342 0.279 0.658 8 .035 0.207 0.485 0.239 0.5948102 9.318 0.265 0.530 7 0.089 0.124 0.339 0.216 0.714 24.585 6 7 0.374 0.401 0.078 0.147 0.467 2 0.585 6 0.558 3 0.514 0.045 0.579 0.532 0. Concentraciones de Albúmina de suero bovino Vs.115 0.082 0.410 0.532 0.523 4 0.289 34.174 0. Abs a 595nm 100 200 300 400 600 700 Grupo µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL 1 0.401 0.072 0.74045 7.641528 13.561 DS 0.485 0.060 0.609 0.141 0. Resultados de la curva patrón de proteínas por el método de Bradford (estudiantes).4888482 15.528 0.318 0.399 0.555 5 0.579 0.282 0.063 CV (%) 53.

.326 0.049 11. Gráfico representativo de la curva patrón de proteínas (autores).027 19.013 5.231 0.542 0.048 14.Promedio DS CV (%) 0.524 0.139 0.839 En la tabla 4a se consignan los resultados de las réplicas que presentaron mayor igualdad a los datos obtenidos por las monitoras en la prueba. Se puede apreciar que los coeficientes de variación son mucho más bajos que tomando todo el grupo de gatos completo.047 0.196 0. Gráfico representativo de la curva patrón de proteínas (monitoría) En la figura 3 se puede apreciar la relación de las absorbancias y las concentraciones de proteína de las muestras analizadas.460 0.428 0.727 0. En la figura se puede apreciar la ecuación de la linealización y el r2 de 0.053 8.9768.599 0. Figura 3.034 6. Figura 4.

030 5.436 0.254 3.011 0.9952.248 0.357 0.309 0.En la figura 4 se puede apreciar la representación de los datos obtenidos y su relación casi lineal (Abs vs.354 0.310 0. Curva patrón para la cuantificación de almidón.429 0.620 4.557 0.338 En la tabla 5 se consignan los datos experimentales obtenidos por las monitoras del laboratorio en la práctica.246 0.858 2.002 0. Concentración).601 0.686 3. Resultados de la curva patrón de almidón por el método de Lugol (monitoría).452 0.336 0. 3.398 0.543 0.284 0. Tabla 5.015 0.246 0.492 0.894 3.403 0. Resultados de la curva patrón de almidón por el método de Lugol (estudiantes). En las tablas 5 y 6 se consignan los datos obtenidos experimentalmente por las monitoras del laboratorio y por los estudiantes durante la práctica.169 1000 0. Se puede observar que el coeficiente de variación de dichos datos es relativamente bajo.420 0. Réplica 1 2 3 Promedio DS CV (%) Concentración de almidón en µg/mL Vs.015 0. . Abs a 650nm 300 400 500 600 700 800 0.390 0.567 0.012 0.467 0.439 0. así como la ecuación de la linealización y el r2 de 0.349 0.016 0.245 0.475 0.465 0.301 0. Tabla 6.

534 0.024 2.446 0.285 0. Gráfico representativo de la curva patrón de almidón (monitoría).027 5.397 0.348 0.401 0.007 0.237 0.430 0.534 0.386 0.358 0.331 0.234 0.419 0. .577 0. Abs a 650nm 300 400 500 600 700 800 0.303 0.236 0.887 4.393 0. Gráfico representativo de la curva patrón de almidón (estudiantes).326 0.946 5.467 0.351 0. incluyendo su ecuación de la recta y el r 2 de 0.522 0.794 4.242 0.427 0.475 0.535 0.292 3.222 0.271 0.310 0.359 0. Figura 6.238 0.415 0.385 0. En la figura 5 se pueda apreciar la representación de los datos en una gráfica.292 0.465 0.417 0.287 0.364 0.Grupo 1 2 3 4 5 6 7 8 Promedio DS CV (%) Concentración de almidón en µg/mL Vs.393 0.365 0.499 0.500 0.099 En la tabla 6 se consignan los resultados obtenidos por los 8 grupos de laboratorio.310 0.373 0. Figura 5.360 0.442 0.013 0.425 0.287 0.559 0.284 0. así como de la linealización de los mismos.493 2.229 0.227 0.9957.467 0.420 0.014 0. Se puede apreciar que el coeficiente de variación no es muy alto.411 0.472 0.093 1000 0.505 0.386 0.237 0.430 0.457 0.015 0.014 0.548 0.478 0.

Bradford. empleando métodos colorimétricos (DNS. En la práctica se construyeron 3 curvas patrón para distintos propósitos. mediante la ayuda de un programa de hoja de cálculo o CAS. A la hora de trabajar con absorbancias. para la construcción de curvas patrón. así como de la linealización de los mismos.9845. por ejemplo u otro parámetro. Lugol). En general. como el diámetro. para luego obtener. se debe tener en cuenta que. tomando en base las mediciones de absorbancia realizadas a muestras de concentración conocida. graficándose finalmente cada pareja de puntos en un sistema cartesiano y así lograr obtener una línea recta que relacione dichas concentraciones con el parámetro medido. a las que se les halla una determinada Absorbancia. se utilizan soluciones de concentración conocida.1 hasta 1 unidades . teniendo un parámetro con el que se relaciona dicha concentración por medio de la curva patrón. el comportamiento lineal de los datos de concentración. DISCUSIÓN La elaboración de una curva patrón es un paso muy importante para la determinación de las concentraciones de una muestra a analizar. respecto a los datos de absorbancia solo se cumple desde 0.En la figura 6 se puede apreciar la representación de los datos en un gráfico. con la ecuación de la recta y el r 2 de 0. según la ley de Lambert-Beer. una linealización de dichos puntos y poder así predecir qué concentración tendrá una muestra de determinada absorbancia.

La tercera curva realizada fue la curva patrón para la cuantificación de almidón según el método de Lugol. por lo que se empleó todo el conjunto de datos (8 réplicas) para hacer las mediciones de la curva patrón. La primera curva realizada fue la curva patrón para la determinación de azúcares reductores por el método de DNS. Bradford y yodo-yoduro. En los datos obtenidos en las 2 primeras practicas correspondientes a las curvas patrón de azúcares reductores y proteínas. el cual es un método bastante fiable y preciso para la determinación de dichos azúcares (6). así como de sustratos residuales. que permiten hacer cálculos cinéticos para los microorganismos involucrados en un proceso fermentativo. Dicha situación no se presentó en los datos de la tercera curva. un mínimo de réplicas aceptable (3 réplicas). cada una correspondiente a un grupo de trabajo del laboratorio. se encontraban bastante dispersos. la de almidón.de absorbancia. el cual se basa en la interacción de ciertos aminoácidos como la Histidina y la arginina. el correcto procedimiento y la importancia de las técnicas de DNS. Estos resultados tan diferentes pueden deberse a la sensibilidad de los reactivos. formando un complejo yodoalmidón y rindiendo un color violeta que indica la presencia de almidón positiva (8). a la calibración incorrecta de los equipos o a fallas de manejo de los grupos de laboratorio. con el colorante azul de Coomasie. . más allá de éste rango. por lo que se debió proceder a recortar el número de réplicas que se tomaron para efectuar dichas curvas patrón obteniendo al final. La segunda curva realizada fue la curva patrón para la cuantificación de proteínas según el método de Bradford. el cual se basa en la detección del almidón debido a la interacción del yodo con las hélices del almidón. Dicho proceso es un método ampliamente utilizado en microbiología para la detección de sustratos iniciales de un medio específico. presentando un coeficiente de variación muy alto (mayor al 5%). el comportamiento de los datos empieza a ser polinómico y por ende la relación 1 a 1 se pierde. para dar lugar a una reacción colorimétrica (7). se pudo observar que los datos de las réplicas. CONCLUSIONES - De acuerdo al procedimiento de la práctica se pudo conocer los fundamentos químicos. con las que se procedió a realizar cada una de las curvas.

Introducción a los métodos instrumentales de análisis. Anal Biochem. - - BIBLIOGRAFÍA 1. 426. 31. 426. Utilizando el conocimiento aprendido en estas practicas se pueden hallar diferentes ecuaciones para cuantificar diferentes compuestos que están presentes en una gran cantidad de reacciones.. proteínas y azucares reductores. McGraw-Hill. Mediante una previa investigación y en las practicas se identificaron los factores que pueden llegar a interrumpir o dar falsos positivos en las técnicas utilizadas.Miller GL. 410p.Miller GL. México DF.. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. 1959. Primera edición.Harisha S. Anal. Fundamentos de química. PEARSON. Laxmi Publications. 31.Ahmed H. Chem. pg 805 2. Universidad Nacional de Colombia. An introduction to practical biotechnology. Principles and reactions of protein extraction. Anal.Alfonso Clavijo Diaz. 1959. 4.Burns R. purification and characterization. 72: 248-254. año 2006.Gonzales C. Primera edición (2002).- Con el uso de las curvas patrón se pudo determinar y se hallaron ecuaciones que nos permiten saber o cuantificar las concentraciones de almidón. 2003 6. Fundamentos de química analítica. . Ed.Bradford MM (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. 7. 540p. CRC Press. 8. Chem. Sede Bogota. Madrid (2003) 3. año 2005. México. 5. Cuarta edición.

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