Pontificia Universidad Javeriana Facultad de ciencias basicas Departamento de Microbiologia Informe curvas patron para la determinar azucares reductores

(DNS), cuantificacion de proteinas (Bradford) y cuantificacion de almidon (yodatoyoduro) Viernes – Grupo 7 Nicolas Martinez Aldana, Luis miguel chaves

RESUMEN Objetivo: Realizar una serie de curvas patrón por los métodos de DNS, Bradford y yodo-yoduro, para la cuantificación de azúcares reductores, proteínas totales y almidón, respectivamente. Materiales y métodos: Para la cuantificación de azúcares reductores se utilizaron soluciones de glucosa con concentraciones entre un rango de 0,5 a 1,7 g/L, y esto se realizó con la técnica del ácido 3,5 Dinitrosalicílico (DNS), para la cuantificación de proteínas se utilizo la técnica de Bradford y solución de albúmina en un rango de concentración de 100 a 700 μg/mL, para cuantificar la cantidad de almidón se utilizó una solución de este a concentraciones entre 300 y 1000 μg/mL, para esto se utilizó espectrofotometría, con los datos que se obtuvieron en cada etapa del procedimiento se realizo una regresión lineal donde se obtuvo una ecuación que describe la absorbancia en términos de la concentración. Resultados: La ecuación que describe la relación entre la absorbancia y la concentración de azucares reductores fueY= 0,5105x0,0149 con un r2 = 0,9982, la ecuación que describe esta relación con proteínas es Y=0,0953x+0,0439 con un r2 = 0,9952 yla que describe la concentración de almidón es Y=0,0004x+0,1251 con un r2= 0,9845. Conclusión: Con el uso de las curvas patrón se pudo determinar ecuaciones que nos permiten identificar la concentración de proteínas extracelulares, azucares reductores y el almidón.

PALABRAS CLAVES: Curva Patrón, azucares reductores, ácido 3,5 dinitrosalicílico, proteínas, Bradford, almidón, yodato-yoduro, absorbancia

INTRODUCCION

pero sin duda.La otra variable que se utilizo fue la concentración de la sustancia o elemento que se quería determinar. Para realizar la curva de calibración se realizo una serie de diluciones a partir de una muestra cuya concentración se conocía previamente. por ejemplo para el desarrollo de este laboratorio se utilizaron dos variables como lo son la absorción que guiados por la teoría cuántica que dice que si hay una “colisión” entre un fotón y un receptor (átomo. en condiciones fuertemente ácidas el colorante suele ser más estable. en términos simples el receptor puede absorber energía o no(1). tornando a un color rojo. respectivamente. uno de los más usuales es el método de Bradford. Finalmente. ion o molécula). se puede interpolar el dato de la muestra problema hasta encontrar la concentración del analito. método de Lowry. para la cuantificación del almidón se utilizó la técnica yoduro – yodato esta prueba se basa en la reacción donde. El objetivo de esta introducción es ilustrarnos para cumplir el objetivo de la practica el cual es realizar una serie de curvas patrón por los métodos de DNS. Cada sustancia. el cual se basa en la reducción del DNS (de color amarillo) por la glucosa u otro azúcar reductor al ácido 3-amino-5-nitrosalicílico (de color rojo ladrillo). Para cuantificar azúcares reductores se utiliza el método del ácido 3. proteínas y almidón. existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas como reacciones de biuret. En la practica de laboratorio se llevaron a cabo tres curvas patrón. por otro lado. Se dice que la respuesta de la muestra puede ser cuantificada y. MATERIALES Y METODOS: . Estos métodos suelen tener una respuesta lineal sobre la que se le realiza un análisis estadístico de regresión para evaluar la confiabilidad de los datos (2). si se emplea la curva de calibración. hay una probabilidad finita de que su energía pueda ser transferida al receptor en un proceso discontinuo. El yodo por fuerzas de Van der vals se une a los enlace α 1-4 del almidón formando un complejo de inclusión que forman un color violeta (5). proteínas totales y almidón. o curva de calibración es una herramienta de la química analítica que se emplea para medir la concentración de una sustancia en una muestra. por asimilación de los elementos de una concentración conocida. el siguiente paso es establecer una relación matemática con los datos obtenidos. Se basa principalmente en una relación lineal entre un carácter medible.Una curva patrón.5 di-nitrosalicílico o llamado también DNS. entre otros. del ácido bicincónico. tras la unión a las proteínas torna a color azul (4). que se basa en un equilibrio entre las tres formas del azul de Commassie (colorante). ocurre rápidamente liberando yodo el cual se detecta fácilmente con almidón. por su composición química. requiere de diferentes métodos para su cuantificación. Bradford y yodo-yoduro. en un medio débilmente ácido. azúcares reductores. cuya presencia puede detectarse por lectura de la Absorbancia en la longitud de onda de 540nm (3). para la cuantificación de azúcares reductores.

Para la determinación de la concentración de glucosa mediante la técnica de DNS se preparo un blanco con 0. 300. Para la determinación de la concentración de almidón mediante la técnica de yodo-yoduro se preparo un blanco con 1ml de solución de sales. 1.800 y1000 μg/ml.700.7.5.1ml de cada dilución con 5ml del reactivo de Bradford. 1. . 1. al terminar este tiempo se pasaron los tubos a un recipiente que contenía hielo para frenar la reacción.7) g/L se preparo una solución que contenía 0. RESULTADOS 1. se homogenizan y se leen en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 650nm. Curva patrón para la determinación de azúcares reductores.500.1ml de NaCl y 5ml de reactivo de Bradford y se prepararon soluciones que contenían 0. 1.600.400. CURVA PATRON PARA LA DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE PROTEINAS: Con la ecuación de la volumetría se prepararon soluciones con las siguientes concentraciones de albumina 100. 0.25ml de agua. con las concentraciones de glucosa (0.7.7) g/L. 0. se midió la absorbancia de estas soluciones a una longitud de onda de 595nm CURVA PATRON PARA LA DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE ALMIDON: Con la ecuación de la volumetría se prepararon soluciones con las siguientes concentraciones de almidón 300.5.400. 200.5ml de agua destilada y luego se realizó una medición en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 540nm. 1. 700 μg/ml.0. 1.5. 1ml de solución de yodo-yoduro y 2 ml de agua destilada y a partir de las diluciones preparadas se preparan soluciones con 1ml de estas mas 1ml de reactivo yodo-yoduro y 2ml de gua destilada.5.25ml de DNS.25ml de la dilución mas 0. al cabo de esto se llevaron estos tubos a una temperatura de ebullición por 5 minutos.25ml de reactivo DNS y 0. Para la determinación de la concentración de proteínas mediante la técnica de Bradford se preparo un blanco con 0.0. 600.CURVA PATRON PARA LA DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES: Con la ecuación de la volumetría se prepararon soluciones con las siguientes concentraciones de glucosa (0. Una vez que se enfriaron los tubos se les agregó 2.

207 0.079942 0.632 0.871 3 0. Abs a 540nm (monitoría) Réplica Concentraciones g/L 0.028 0.7 1 1.146 La tabla 1 muestra los resultados obtenidos por las monitoras al efectuar el ensayo de DNS sobre las muestras de glucosa.250809 0.655 0.454 0.817 0.374 0.697 0.221332 0.154546 0.233 0.051 0.33974 30. los cuales se encuentran fuera del rango de un estudio químico (máximo 5%).5 0.323 0.17516 En la tabla número 2 se registran los datos de los 8 grupos de laboratorio tomados para cada una de las concentraciones de glucosa.102896 CV 30.754 0.240 0.085 7.293 0.827 0.488 0. Abs a 540nm GRUPOS Concentraciones (g/L) 0.214 11.005 8.240 0.071 CV (%) 10.424 0.470 0.808 1.011 DS 0.084 0.316 0.837 0.876 1. . Concentración de azúcar en g/L Vs.52879 29. en la que se observa un aumento de las absorbancias conforme aumentan las concentraciones de azúcar. Tabla 2. Tabla 1.699 1.130 1.758 1.480 0.130 6 0. Resultados de la curva patrón de glucosa por DNS (monitoría).947 Promedio 0.241 0.7 2 1 0.498 0.025 0.89211 29.7 2 1 0.La curva patrón para cuantificación de azúcares reductores se obtuvo producto de los resultados del experimento llevados a cabo por las monitoras y por los estudiantes del laboratorio.027 0.166 2 0.5 1.896 1.523 0.362 0.712 0.006 8 0.16797 10.290 0.755 0.379 0.367 0.7 1 1.318 0.532 0.068 4 0.792 0.419 0. Resultados de la curva patrón de glucosa por DNS (estudiantes) Concentración de azúcar en g/L Vs.060 1.261 0.026 0.251 0.300 0.352 0.077 3 0.879 0.785 0.139 0.64373 25.962 2 0.727 0.211 0.304 0.856 0. Los resultados se consignan a continuación en la tabla número 1 y en la tabla número 2.304 0.094927 0.5 1.750 0.490 0.139 3.995 DS 0.5 0.933 5 0.984 Promedio 0. así como los coeficientes de variación.328 0.212 0.280 0. Se puede observar que el coeficiente de variación es alto.831 1.693 0.254 11.932 7 0.949 1.811 0.261 0.418 0.

069 0. Gráfico representativo de la curva patrón de glucosa (monitoría).379 0.480 0.693 0. Se eliminaron grupos de datos para obtener un menor coeficiente de variación entre las absorbancias medidas. según lo obtenido por las monitoras del laboratorio.879 0.304 0.532 0.5 0.774 0.028 0.025 0.002 DS 0.579 11.238 6. Figura 1.328 0.068 4 5 6 0. debido a que el mismo era demasiado alto y se encontraron réplicas que se encontraban demasiado desviadas de los datos experimentales de control interno.500 0.337 0.837 0.758 1. Abs a 540nm (recortado) GRUPOS Concentraciones (g/L) 0.876 1.240 0.7 1 1.261 0.074 0. Resultados de la curva patrón de glucosa por DNS RECORTADO (autores) Concentración de azúcar en g/L Vs.518 8.211 0.7 2 1 2 3 0.792 0.006 8 Promedio 0.068 CV (%) 10. .600 9.237 0.838 1.Tabla 2a. para cada una de las muestras.488 0.5 1.932 7 0.795 La tabla 2a registra las réplicas que más se acomodan a la tendencia de los datos de absorbancia.365 5.038 0.

036 0.0420039 0.0545802 0.145 0.262 0. de absorbancias Vs.758 Promedi 0.082 0. Curva patrón para la cuantificación de proteínas.668 0.0376430 .422 0.226 0.178 0. de las 3 réplicas que más se ajustaron a los resultados del control.725 DS 0.684 3 0. y la regresión lineal de los datos con la ecuación de dicha regresión y su r2 de 0.684 0.42 0.733 2 0.557 0.361 0. 2. Gráfico representativo de la curva patrón de glucosa (autores). Figura 2. Tabla 3. respectivamente. Concentraciones.9962.1039278 0.3893333 0.298 0.0295691 0. En las tablas 3 y 4 se registran los datos obtenidos de proteínas totales (albúmina de suero bovino) por el método de Bradford.262 3 7 0.175 0. Abs a 595nm (monitoría) 200 Réplica 100 µg/mL µg/mL 300 µg/mL 400 µg/mL 600 µg/mL 700 µg/mL 1 0. En la figura 2 se observa la representación gráfica de los datos obtenidos por los estudiantes. realizado por las monitoras del laboratorio y por los estudiantes.En la figura 1 se puede apreciar la relación casi lineal entre las concentraciones de glucosa y las absorbancias de cada una.4426666 o 0.387 0.415 0.491 0.763 0. Resultados de la curva patrón de proteínas por el método de Bradford (monitoría) Concentraciones de Albúmina de suero bovino Vs.

558062 5.74045 7. Se puede observar que el coeficiente de variación es alto.141 0.CV (%) 2 3 7 6 6 37.485 0.266 0.658 8 0.165 0.082 0. Resultados de la curva patrón de proteínas por el método de Bradford (autores).112 0.553 15.714 24.226 11.658 8 .282 0.579 0.528 0. Concentraciones de Albúmina de suero bovino Vs.4888482 15.112 0.165 0.485 0.282 0.279 0.265 0.401 0.289 34.060 0.041 0. Concentraciones de Albúmina de suero bovino Vs.342 0.399 0.585 6 0.280 0.401 0.082 0.089 0.523 4 0.641528 13.763 25.374 0.063 CV (%) 53.555 5 0. se encontraron problemas en el muestreo de uno o más puntos.558 3 0.035 0.170 0.174 0.514 0.363 0.045 0.377 0. Abs a 595nm (recortado) 100 200 300 400 600 700 Grupo µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL 1 2 3 4 0.467 2 0.216 0.399 0.514 0.532 0.171 En la tabla 4 se consignan los resultados obtenidos por cada uno de los grupos de laboratorio en la prueba.115 0.237 0.609 Promedio 0.239 0. Tabla 4a.530 7 0.112 0.426 0.239 0.072 0.585 6 7 0.1921462 4 8 9 1 8 7 En la tabla 3 se consignan los resultados obtenidos por las monitoras del laboratorio en la prueba.609 0.049 0.221 0.141 0.532 0.078 0.124 0.579 0.216 0.377 0.339 0.318 0.208 0.410 0.515 0.561 DS 0.237 0.147 0.207 0.5948102 9.318 0. Abs a 595nm 100 200 300 400 600 700 Grupo µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL 1 0.555 5 0.092 0. Se pudo observar que al ser el coeficiente de variación tan alto.399 0. Resultados de la curva patrón de proteínas por el método de Bradford (estudiantes). Tabla 4.

053 8.428 0.034 6.013 5.048 14.524 0.027 19.139 0. En la figura se puede apreciar la ecuación de la linealización y el r2 de 0.839 En la tabla 4a se consignan los resultados de las réplicas que presentaron mayor igualdad a los datos obtenidos por las monitoras en la prueba.9768. .326 0.049 11.196 0. Figura 4.460 0. Gráfico representativo de la curva patrón de proteínas (autores).727 0.Promedio DS CV (%) 0. Se puede apreciar que los coeficientes de variación son mucho más bajos que tomando todo el grupo de gatos completo.542 0.231 0.599 0. Gráfico representativo de la curva patrón de proteínas (monitoría) En la figura 3 se puede apreciar la relación de las absorbancias y las concentraciones de proteína de las muestras analizadas. Figura 3.047 0.

030 5.686 3.248 0. Resultados de la curva patrón de almidón por el método de Lugol (monitoría).894 3.467 0. Curva patrón para la cuantificación de almidón.858 2.301 0.015 0. Tabla 5.390 0.475 0.357 0. .015 0. así como la ecuación de la linealización y el r2 de 0.9952.246 0.439 0.336 0. Tabla 6.338 En la tabla 5 se consignan los datos experimentales obtenidos por las monitoras del laboratorio en la práctica.601 0.310 0. Abs a 650nm 300 400 500 600 700 800 0.452 0.012 0.246 0. 3. Resultados de la curva patrón de almidón por el método de Lugol (estudiantes). Concentración).543 0.011 0. Réplica 1 2 3 Promedio DS CV (%) Concentración de almidón en µg/mL Vs.349 0. En las tablas 5 y 6 se consignan los datos obtenidos experimentalmente por las monitoras del laboratorio y por los estudiantes durante la práctica.245 0.016 0.354 0.420 0.284 0.398 0.169 1000 0.En la figura 4 se puede apreciar la representación de los datos obtenidos y su relación casi lineal (Abs vs. Se puede observar que el coeficiente de variación de dichos datos es relativamente bajo.465 0.567 0.309 0.492 0.620 4.557 0.254 3.429 0.436 0.002 0.403 0.

411 0.9957.093 1000 0.386 0.Grupo 1 2 3 4 5 6 7 8 Promedio DS CV (%) Concentración de almidón en µg/mL Vs.385 0.478 0.535 0.310 0.475 0.099 En la tabla 6 se consignan los resultados obtenidos por los 8 grupos de laboratorio.887 4.014 0.419 0.430 0.472 0.326 0. Gráfico representativo de la curva patrón de almidón (estudiantes).446 0.227 0. así como de la linealización de los mismos.522 0.499 0. Gráfico representativo de la curva patrón de almidón (monitoría). Abs a 650nm 300 400 500 600 700 800 0.359 0.284 0. En la figura 5 se pueda apreciar la representación de los datos en una gráfica.351 0.401 0.222 0.493 2.420 0. Se puede apreciar que el coeficiente de variación no es muy alto.548 0.365 0.425 0. Figura 5.534 0.348 0.285 0.015 0.358 0.393 0.242 0.467 0.505 0.027 5.577 0.559 0.442 0.794 4.417 0.500 0.397 0.467 0.236 0.014 0.393 0.430 0.292 3.946 5.303 0.292 0.229 0.237 0.287 0. .237 0.465 0. Figura 6.287 0.427 0.234 0.415 0.310 0.024 2.364 0.534 0.238 0.271 0.007 0.457 0.331 0.360 0.373 0.013 0. incluyendo su ecuación de la recta y el r 2 de 0.386 0.

1 hasta 1 unidades . se debe tener en cuenta que.En la figura 6 se puede apreciar la representación de los datos en un gráfico. para luego obtener. mediante la ayuda de un programa de hoja de cálculo o CAS.9845. tomando en base las mediciones de absorbancia realizadas a muestras de concentración conocida. En la práctica se construyeron 3 curvas patrón para distintos propósitos. con la ecuación de la recta y el r 2 de 0. empleando métodos colorimétricos (DNS. Bradford. a las que se les halla una determinada Absorbancia. graficándose finalmente cada pareja de puntos en un sistema cartesiano y así lograr obtener una línea recta que relacione dichas concentraciones con el parámetro medido. para la construcción de curvas patrón. así como de la linealización de los mismos. DISCUSIÓN La elaboración de una curva patrón es un paso muy importante para la determinación de las concentraciones de una muestra a analizar. respecto a los datos de absorbancia solo se cumple desde 0. En general. se utilizan soluciones de concentración conocida. A la hora de trabajar con absorbancias. Lugol). como el diámetro. una linealización de dichos puntos y poder así predecir qué concentración tendrá una muestra de determinada absorbancia. por ejemplo u otro parámetro. según la ley de Lambert-Beer. teniendo un parámetro con el que se relaciona dicha concentración por medio de la curva patrón. el comportamiento lineal de los datos de concentración.

que permiten hacer cálculos cinéticos para los microorganismos involucrados en un proceso fermentativo. Dicho proceso es un método ampliamente utilizado en microbiología para la detección de sustratos iniciales de un medio específico. el correcto procedimiento y la importancia de las técnicas de DNS. el cual es un método bastante fiable y preciso para la determinación de dichos azúcares (6). el cual se basa en la detección del almidón debido a la interacción del yodo con las hélices del almidón. Dicha situación no se presentó en los datos de la tercera curva. presentando un coeficiente de variación muy alto (mayor al 5%). por lo que se empleó todo el conjunto de datos (8 réplicas) para hacer las mediciones de la curva patrón. con el colorante azul de Coomasie. se encontraban bastante dispersos. el comportamiento de los datos empieza a ser polinómico y por ende la relación 1 a 1 se pierde. La tercera curva realizada fue la curva patrón para la cuantificación de almidón según el método de Lugol. se pudo observar que los datos de las réplicas. CONCLUSIONES - De acuerdo al procedimiento de la práctica se pudo conocer los fundamentos químicos. a la calibración incorrecta de los equipos o a fallas de manejo de los grupos de laboratorio. para dar lugar a una reacción colorimétrica (7). así como de sustratos residuales. con las que se procedió a realizar cada una de las curvas. más allá de éste rango. Estos resultados tan diferentes pueden deberse a la sensibilidad de los reactivos.de absorbancia. un mínimo de réplicas aceptable (3 réplicas). En los datos obtenidos en las 2 primeras practicas correspondientes a las curvas patrón de azúcares reductores y proteínas. el cual se basa en la interacción de ciertos aminoácidos como la Histidina y la arginina. . La primera curva realizada fue la curva patrón para la determinación de azúcares reductores por el método de DNS. formando un complejo yodoalmidón y rindiendo un color violeta que indica la presencia de almidón positiva (8). por lo que se debió proceder a recortar el número de réplicas que se tomaron para efectuar dichas curvas patrón obteniendo al final. Bradford y yodo-yoduro. La segunda curva realizada fue la curva patrón para la cuantificación de proteínas según el método de Bradford. cada una correspondiente a un grupo de trabajo del laboratorio. la de almidón.

Miller GL. 5. 31. 426. Fundamentos de química. Madrid (2003) 3. 7. Ed. 31. Primera edición. Laxmi Publications. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Universidad Nacional de Colombia. pg 805 2. Fundamentos de química analítica. . Anal.Gonzales C. PEARSON. 2003 6. año 2005. 1959. Principles and reactions of protein extraction.. 426. Chem. Mediante una previa investigación y en las practicas se identificaron los factores que pueden llegar a interrumpir o dar falsos positivos en las técnicas utilizadas. Cuarta edición. CRC Press.Alfonso Clavijo Diaz. McGraw-Hill. Chem.Harisha S. proteínas y azucares reductores.Burns R. - - BIBLIOGRAFÍA 1. Primera edición (2002). 540p. 410p..Miller GL. 1959. México. An introduction to practical biotechnology. Anal Biochem. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. purification and characterization. Introducción a los métodos instrumentales de análisis.Bradford MM (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. año 2006. 8. 4. Anal.Ahmed H. México DF. Utilizando el conocimiento aprendido en estas practicas se pueden hallar diferentes ecuaciones para cuantificar diferentes compuestos que están presentes en una gran cantidad de reacciones. Sede Bogota. 72: 248-254.- Con el uso de las curvas patrón se pudo determinar y se hallaron ecuaciones que nos permiten saber o cuantificar las concentraciones de almidón.

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