Pontificia Universidad Javeriana Facultad de ciencias basicas Departamento de Microbiologia Informe curvas patron para la determinar azucares reductores

(DNS), cuantificacion de proteinas (Bradford) y cuantificacion de almidon (yodatoyoduro) Viernes – Grupo 7 Nicolas Martinez Aldana, Luis miguel chaves

RESUMEN Objetivo: Realizar una serie de curvas patrón por los métodos de DNS, Bradford y yodo-yoduro, para la cuantificación de azúcares reductores, proteínas totales y almidón, respectivamente. Materiales y métodos: Para la cuantificación de azúcares reductores se utilizaron soluciones de glucosa con concentraciones entre un rango de 0,5 a 1,7 g/L, y esto se realizó con la técnica del ácido 3,5 Dinitrosalicílico (DNS), para la cuantificación de proteínas se utilizo la técnica de Bradford y solución de albúmina en un rango de concentración de 100 a 700 μg/mL, para cuantificar la cantidad de almidón se utilizó una solución de este a concentraciones entre 300 y 1000 μg/mL, para esto se utilizó espectrofotometría, con los datos que se obtuvieron en cada etapa del procedimiento se realizo una regresión lineal donde se obtuvo una ecuación que describe la absorbancia en términos de la concentración. Resultados: La ecuación que describe la relación entre la absorbancia y la concentración de azucares reductores fueY= 0,5105x0,0149 con un r2 = 0,9982, la ecuación que describe esta relación con proteínas es Y=0,0953x+0,0439 con un r2 = 0,9952 yla que describe la concentración de almidón es Y=0,0004x+0,1251 con un r2= 0,9845. Conclusión: Con el uso de las curvas patrón se pudo determinar ecuaciones que nos permiten identificar la concentración de proteínas extracelulares, azucares reductores y el almidón.

PALABRAS CLAVES: Curva Patrón, azucares reductores, ácido 3,5 dinitrosalicílico, proteínas, Bradford, almidón, yodato-yoduro, absorbancia

INTRODUCCION

tornando a un color rojo. hay una probabilidad finita de que su energía pueda ser transferida al receptor en un proceso discontinuo. por asimilación de los elementos de una concentración conocida. Se dice que la respuesta de la muestra puede ser cuantificada y. Para cuantificar azúcares reductores se utiliza el método del ácido 3. entre otros. Cada sustancia.5 di-nitrosalicílico o llamado también DNS. en términos simples el receptor puede absorber energía o no(1). cuya presencia puede detectarse por lectura de la Absorbancia en la longitud de onda de 540nm (3). Finalmente. El yodo por fuerzas de Van der vals se une a los enlace α 1-4 del almidón formando un complejo de inclusión que forman un color violeta (5). si se emplea la curva de calibración. El objetivo de esta introducción es ilustrarnos para cumplir el objetivo de la practica el cual es realizar una serie de curvas patrón por los métodos de DNS. pero sin duda. en un medio débilmente ácido. Estos métodos suelen tener una respuesta lineal sobre la que se le realiza un análisis estadístico de regresión para evaluar la confiabilidad de los datos (2). por otro lado. para la cuantificación del almidón se utilizó la técnica yoduro – yodato esta prueba se basa en la reacción donde. Para realizar la curva de calibración se realizo una serie de diluciones a partir de una muestra cuya concentración se conocía previamente. MATERIALES Y METODOS: . por ejemplo para el desarrollo de este laboratorio se utilizaron dos variables como lo son la absorción que guiados por la teoría cuántica que dice que si hay una “colisión” entre un fotón y un receptor (átomo. ocurre rápidamente liberando yodo el cual se detecta fácilmente con almidón. respectivamente. existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas como reacciones de biuret. ion o molécula). azúcares reductores. para la cuantificación de azúcares reductores. se puede interpolar el dato de la muestra problema hasta encontrar la concentración del analito. proteínas y almidón. en condiciones fuertemente ácidas el colorante suele ser más estable. el cual se basa en la reducción del DNS (de color amarillo) por la glucosa u otro azúcar reductor al ácido 3-amino-5-nitrosalicílico (de color rojo ladrillo). En la practica de laboratorio se llevaron a cabo tres curvas patrón. método de Lowry.Una curva patrón. por su composición química. Se basa principalmente en una relación lineal entre un carácter medible. el siguiente paso es establecer una relación matemática con los datos obtenidos. proteínas totales y almidón. o curva de calibración es una herramienta de la química analítica que se emplea para medir la concentración de una sustancia en una muestra. que se basa en un equilibrio entre las tres formas del azul de Commassie (colorante). requiere de diferentes métodos para su cuantificación. Bradford y yodo-yoduro. del ácido bicincónico. uno de los más usuales es el método de Bradford. tras la unión a las proteínas torna a color azul (4).La otra variable que se utilizo fue la concentración de la sustancia o elemento que se quería determinar.

700 μg/ml. al terminar este tiempo se pasaron los tubos a un recipiente que contenía hielo para frenar la reacción.5.1ml de NaCl y 5ml de reactivo de Bradford y se prepararon soluciones que contenían 0. Curva patrón para la determinación de azúcares reductores. CURVA PATRON PARA LA DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE PROTEINAS: Con la ecuación de la volumetría se prepararon soluciones con las siguientes concentraciones de albumina 100. 1. Una vez que se enfriaron los tubos se les agregó 2.800 y1000 μg/ml.CURVA PATRON PARA LA DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES: Con la ecuación de la volumetría se prepararon soluciones con las siguientes concentraciones de glucosa (0.25ml de reactivo DNS y 0. con las concentraciones de glucosa (0.7) g/L se preparo una solución que contenía 0.400. RESULTADOS 1. 600.25ml de la dilución mas 0. 1.25ml de agua. .5.7. 200.400. Para la determinación de la concentración de proteínas mediante la técnica de Bradford se preparo un blanco con 0. 1.0.0. 1ml de solución de yodo-yoduro y 2 ml de agua destilada y a partir de las diluciones preparadas se preparan soluciones con 1ml de estas mas 1ml de reactivo yodo-yoduro y 2ml de gua destilada. 0. 0.1ml de cada dilución con 5ml del reactivo de Bradford.5.5. Para la determinación de la concentración de glucosa mediante la técnica de DNS se preparo un blanco con 0. al cabo de esto se llevaron estos tubos a una temperatura de ebullición por 5 minutos. se midió la absorbancia de estas soluciones a una longitud de onda de 595nm CURVA PATRON PARA LA DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE ALMIDON: Con la ecuación de la volumetría se prepararon soluciones con las siguientes concentraciones de almidón 300. 1.25ml de DNS. se homogenizan y se leen en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 650nm. 1.700. 300. 1.600.500. Para la determinación de la concentración de almidón mediante la técnica de yodo-yoduro se preparo un blanco con 1ml de solución de sales.7) g/L.5ml de agua destilada y luego se realizó una medición en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 540nm.7.

16797 10.837 0.64373 25.051 0.932 7 0.166 2 0.233 0.754 0.130 1.240 0. en la que se observa un aumento de las absorbancias conforme aumentan las concentraciones de azúcar.154546 0.211 0.498 0.367 0.304 0. Abs a 540nm (monitoría) Réplica Concentraciones g/L 0.318 0.146 La tabla 1 muestra los resultados obtenidos por las monitoras al efectuar el ensayo de DNS sobre las muestras de glucosa. así como los coeficientes de variación.240 0.094927 0.316 0.027 0.933 5 0.077 3 0.025 0.379 0.876 1.811 0.879 0.028 0.7 1 1.808 1.419 0. los cuales se encuentran fuera del rango de un estudio químico (máximo 5%).221332 0.085 7.084 0.655 0.827 0.418 0.697 0.374 0.817 0.5 1.792 0.856 0.251 0. Concentración de azúcar en g/L Vs.632 0. Resultados de la curva patrón de glucosa por DNS (monitoría).755 0.7 2 1 0.984 Promedio 0.102896 CV 30.758 1.871 3 0.011 DS 0.362 0.250809 0.261 0.280 0.328 0.5 1.89211 29. Tabla 2.5 0.33974 30. Se puede observar que el coeficiente de variación es alto.323 0.750 0.488 0.261 0.995 DS 0.207 0.290 0.5 0. Tabla 1.454 0.727 0.947 Promedio 0.241 0.005 8.La curva patrón para cuantificación de azúcares reductores se obtuvo producto de los resultados del experimento llevados a cabo por las monitoras y por los estudiantes del laboratorio.693 0.214 11.212 0.026 0.300 0.470 0.006 8 0.254 11.7 2 1 0.352 0.071 CV (%) 10.17516 En la tabla número 2 se registran los datos de los 8 grupos de laboratorio tomados para cada una de las concentraciones de glucosa.304 0. Resultados de la curva patrón de glucosa por DNS (estudiantes) Concentración de azúcar en g/L Vs.060 1. Abs a 540nm GRUPOS Concentraciones (g/L) 0. Los resultados se consignan a continuación en la tabla número 1 y en la tabla número 2.785 0.139 3.480 0.949 1.532 0.079942 0.831 1.139 0.490 0.7 1 1.293 0.424 0.130 6 0.523 0.699 1. .068 4 0.896 1.962 2 0.712 0.52879 29.

025 0.Tabla 2a.7 1 1.600 9.774 0.006 8 Promedio 0.500 0.837 0.379 0.261 0.068 CV (%) 10.518 8.211 0.838 1.480 0. .365 5.5 1. Se eliminaron grupos de datos para obtener un menor coeficiente de variación entre las absorbancias medidas.879 0.758 1. debido a que el mismo era demasiado alto y se encontraron réplicas que se encontraban demasiado desviadas de los datos experimentales de control interno. Figura 1.579 11.304 0.932 7 0.7 2 1 2 3 0.068 4 5 6 0.038 0.028 0.795 La tabla 2a registra las réplicas que más se acomodan a la tendencia de los datos de absorbancia.069 0.532 0.237 0.002 DS 0.328 0.074 0.488 0.876 1. para cada una de las muestras.337 0. Abs a 540nm (recortado) GRUPOS Concentraciones (g/L) 0. según lo obtenido por las monitoras del laboratorio. Gráfico representativo de la curva patrón de glucosa (monitoría).693 0.792 0. Resultados de la curva patrón de glucosa por DNS RECORTADO (autores) Concentración de azúcar en g/L Vs.5 0.238 6.240 0.

En la figura 2 se observa la representación gráfica de los datos obtenidos por los estudiantes.262 3 7 0.733 2 0. de absorbancias Vs.422 0.En la figura 1 se puede apreciar la relación casi lineal entre las concentraciones de glucosa y las absorbancias de cada una.9962.491 0. Abs a 595nm (monitoría) 200 Réplica 100 µg/mL µg/mL 300 µg/mL 400 µg/mL 600 µg/mL 700 µg/mL 1 0.42 0.3893333 0.0376430 . realizado por las monitoras del laboratorio y por los estudiantes.145 0.036 0. y la regresión lineal de los datos con la ecuación de dicha regresión y su r2 de 0.0420039 0.178 0.0295691 0. Figura 2. Tabla 3.763 0. Concentraciones.226 0. 2.361 0.298 0.415 0.387 0. Gráfico representativo de la curva patrón de glucosa (autores).0545802 0.684 3 0.725 DS 0. Curva patrón para la cuantificación de proteínas.082 0. En las tablas 3 y 4 se registran los datos obtenidos de proteínas totales (albúmina de suero bovino) por el método de Bradford. Resultados de la curva patrón de proteínas por el método de Bradford (monitoría) Concentraciones de Albúmina de suero bovino Vs.758 Promedi 0.668 0.262 0.175 0. de las 3 réplicas que más se ajustaron a los resultados del control.684 0.557 0.1039278 0. respectivamente.4426666 o 0.

Se puede observar que el coeficiente de variación es alto.558062 5.221 0.124 0. Concentraciones de Albúmina de suero bovino Vs.045 0. Resultados de la curva patrón de proteínas por el método de Bradford (autores). Resultados de la curva patrón de proteínas por el método de Bradford (estudiantes).282 0.089 0. Tabla 4.041 0.112 0.399 0.115 0.658 8 0.265 0.585 6 7 0.528 0. Abs a 595nm 100 200 300 400 600 700 Grupo µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL 1 0.318 0. Concentraciones de Albúmina de suero bovino Vs.339 0.216 0.174 0.426 0.485 0.318 0.485 0.141 0. Abs a 595nm (recortado) 100 200 300 400 600 700 Grupo µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL 1 2 3 4 0.208 0.530 7 0.279 0.377 0.532 0.171 En la tabla 4 se consignan los resultados obtenidos por cada uno de los grupos de laboratorio en la prueba.092 0.515 0.399 0.237 0.112 0.170 0.165 0.363 0.401 0.147 0.078 0.561 DS 0.141 0.763 25.658 8 . Se pudo observar que al ser el coeficiente de variación tan alto.399 0.514 0.266 0.374 0.1921462 4 8 9 1 8 7 En la tabla 3 se consignan los resultados obtenidos por las monitoras del laboratorio en la prueba.237 0.609 Promedio 0.553 15.410 0.072 0.467 2 0.082 0.082 0.401 0.112 0.216 0.555 5 0.523 4 0.5948102 9. se encontraron problemas en el muestreo de uno o más puntos.514 0.035 0.282 0.289 34.377 0.342 0.239 0.4888482 15.060 0.165 0.226 11.049 0.207 0.558 3 0.714 24.579 0.280 0.585 6 0. Tabla 4a.74045 7.532 0.555 5 0.063 CV (%) 53.609 0.579 0.239 0.641528 13.CV (%) 2 3 7 6 6 37.

839 En la tabla 4a se consignan los resultados de las réplicas que presentaron mayor igualdad a los datos obtenidos por las monitoras en la prueba.048 14.Promedio DS CV (%) 0. En la figura se puede apreciar la ecuación de la linealización y el r2 de 0.034 6.428 0.727 0.9768.049 11.139 0. . Gráfico representativo de la curva patrón de proteínas (monitoría) En la figura 3 se puede apreciar la relación de las absorbancias y las concentraciones de proteína de las muestras analizadas.460 0. Figura 4.196 0. Gráfico representativo de la curva patrón de proteínas (autores). Se puede apreciar que los coeficientes de variación son mucho más bajos que tomando todo el grupo de gatos completo.326 0.231 0.047 0.542 0.013 5.524 0.027 19. Figura 3.053 8.599 0.

Tabla 6. .338 En la tabla 5 se consignan los datos experimentales obtenidos por las monitoras del laboratorio en la práctica.301 0.015 0.246 0.894 3.012 0.465 0.En la figura 4 se puede apreciar la representación de los datos obtenidos y su relación casi lineal (Abs vs.245 0. Resultados de la curva patrón de almidón por el método de Lugol (estudiantes). así como la ecuación de la linealización y el r2 de 0. En las tablas 5 y 6 se consignan los datos obtenidos experimentalmente por las monitoras del laboratorio y por los estudiantes durante la práctica.254 3.475 0.002 0. Concentración).439 0. Se puede observar que el coeficiente de variación de dichos datos es relativamente bajo.858 2.246 0.9952.686 3.016 0. Réplica 1 2 3 Promedio DS CV (%) Concentración de almidón en µg/mL Vs.357 0.403 0. Curva patrón para la cuantificación de almidón. Tabla 5. Abs a 650nm 300 400 500 600 700 800 0.011 0.436 0.398 0.169 1000 0.567 0.467 0.429 0. 3.015 0.349 0.030 5.420 0.452 0.248 0.310 0.336 0.620 4.354 0.309 0.557 0. Resultados de la curva patrón de almidón por el método de Lugol (monitoría).492 0.284 0.390 0.601 0.543 0.

393 0.420 0.310 0.331 0.238 0. incluyendo su ecuación de la recta y el r 2 de 0.419 0.534 0.534 0.364 0.Grupo 1 2 3 4 5 6 7 8 Promedio DS CV (%) Concentración de almidón en µg/mL Vs.386 0.303 0.475 0.577 0. Figura 6.237 0.326 0. Gráfico representativo de la curva patrón de almidón (estudiantes).271 0.505 0.500 0.015 0. Se puede apreciar que el coeficiente de variación no es muy alto. Gráfico representativo de la curva patrón de almidón (monitoría). En la figura 5 se pueda apreciar la representación de los datos en una gráfica.385 0.393 0.548 0.401 0.499 0.014 0. así como de la linealización de los mismos.287 0.535 0.472 0.287 0.415 0.013 0.227 0.360 0.9957.292 3.284 0.386 0.292 0.024 2.027 5.093 1000 0.234 0.457 0.430 0.417 0.467 0.365 0.946 5.467 0.099 En la tabla 6 se consignan los resultados obtenidos por los 8 grupos de laboratorio.373 0.397 0.465 0.887 4.285 0.430 0.411 0.237 0.014 0.348 0.522 0.446 0.242 0.007 0.559 0.310 0. Figura 5.794 4.425 0.222 0.493 2. Abs a 650nm 300 400 500 600 700 800 0.427 0. .478 0.236 0.359 0.358 0.442 0.351 0.229 0.

empleando métodos colorimétricos (DNS.En la figura 6 se puede apreciar la representación de los datos en un gráfico. según la ley de Lambert-Beer. A la hora de trabajar con absorbancias. se debe tener en cuenta que. a las que se les halla una determinada Absorbancia. Bradford. teniendo un parámetro con el que se relaciona dicha concentración por medio de la curva patrón. DISCUSIÓN La elaboración de una curva patrón es un paso muy importante para la determinación de las concentraciones de una muestra a analizar. Lugol). En la práctica se construyeron 3 curvas patrón para distintos propósitos. así como de la linealización de los mismos. tomando en base las mediciones de absorbancia realizadas a muestras de concentración conocida. En general. una linealización de dichos puntos y poder así predecir qué concentración tendrá una muestra de determinada absorbancia.1 hasta 1 unidades . graficándose finalmente cada pareja de puntos en un sistema cartesiano y así lograr obtener una línea recta que relacione dichas concentraciones con el parámetro medido. con la ecuación de la recta y el r 2 de 0. respecto a los datos de absorbancia solo se cumple desde 0. el comportamiento lineal de los datos de concentración. para luego obtener. para la construcción de curvas patrón.9845. por ejemplo u otro parámetro. mediante la ayuda de un programa de hoja de cálculo o CAS. se utilizan soluciones de concentración conocida. como el diámetro.

por lo que se debió proceder a recortar el número de réplicas que se tomaron para efectuar dichas curvas patrón obteniendo al final. se encontraban bastante dispersos. así como de sustratos residuales. con las que se procedió a realizar cada una de las curvas. .de absorbancia. cada una correspondiente a un grupo de trabajo del laboratorio. para dar lugar a una reacción colorimétrica (7). más allá de éste rango. se pudo observar que los datos de las réplicas. el correcto procedimiento y la importancia de las técnicas de DNS. formando un complejo yodoalmidón y rindiendo un color violeta que indica la presencia de almidón positiva (8). Bradford y yodo-yoduro. En los datos obtenidos en las 2 primeras practicas correspondientes a las curvas patrón de azúcares reductores y proteínas. Estos resultados tan diferentes pueden deberse a la sensibilidad de los reactivos. a la calibración incorrecta de los equipos o a fallas de manejo de los grupos de laboratorio. el cual es un método bastante fiable y preciso para la determinación de dichos azúcares (6). presentando un coeficiente de variación muy alto (mayor al 5%). un mínimo de réplicas aceptable (3 réplicas). La segunda curva realizada fue la curva patrón para la cuantificación de proteínas según el método de Bradford. por lo que se empleó todo el conjunto de datos (8 réplicas) para hacer las mediciones de la curva patrón. que permiten hacer cálculos cinéticos para los microorganismos involucrados en un proceso fermentativo. el cual se basa en la interacción de ciertos aminoácidos como la Histidina y la arginina. la de almidón. con el colorante azul de Coomasie. Dicho proceso es un método ampliamente utilizado en microbiología para la detección de sustratos iniciales de un medio específico. CONCLUSIONES - De acuerdo al procedimiento de la práctica se pudo conocer los fundamentos químicos. La tercera curva realizada fue la curva patrón para la cuantificación de almidón según el método de Lugol. el comportamiento de los datos empieza a ser polinómico y por ende la relación 1 a 1 se pierde. Dicha situación no se presentó en los datos de la tercera curva. el cual se basa en la detección del almidón debido a la interacción del yodo con las hélices del almidón. La primera curva realizada fue la curva patrón para la determinación de azúcares reductores por el método de DNS.

Chem.Alfonso Clavijo Diaz. 8. PEARSON. .- Con el uso de las curvas patrón se pudo determinar y se hallaron ecuaciones que nos permiten saber o cuantificar las concentraciones de almidón. 31. 5. 7. Utilizando el conocimiento aprendido en estas practicas se pueden hallar diferentes ecuaciones para cuantificar diferentes compuestos que están presentes en una gran cantidad de reacciones. proteínas y azucares reductores. 540p. Fundamentos de química. año 2006.Harisha S. Mediante una previa investigación y en las practicas se identificaron los factores que pueden llegar a interrumpir o dar falsos positivos en las técnicas utilizadas. México. Cuarta edición. An introduction to practical biotechnology. Chem. CRC Press. Universidad Nacional de Colombia. Principles and reactions of protein extraction. México DF. Anal Biochem.Miller GL.. 72: 248-254. - - BIBLIOGRAFÍA 1. Anal. McGraw-Hill. Laxmi Publications. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Sede Bogota.. purification and characterization. 4.Miller GL. Fundamentos de química analítica. Anal. 1959.Burns R. 426. 2003 6. Ed. 31. 410p. año 2005. 1959. pg 805 2. Primera edición. Introducción a los métodos instrumentales de análisis.Bradford MM (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Primera edición (2002). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. 426.Gonzales C.Ahmed H. Madrid (2003) 3.

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