Pontificia Universidad Javeriana Facultad de ciencias basicas Departamento de Microbiologia Informe curvas patron para la determinar azucares reductores

(DNS), cuantificacion de proteinas (Bradford) y cuantificacion de almidon (yodatoyoduro) Viernes – Grupo 7 Nicolas Martinez Aldana, Luis miguel chaves

RESUMEN Objetivo: Realizar una serie de curvas patrón por los métodos de DNS, Bradford y yodo-yoduro, para la cuantificación de azúcares reductores, proteínas totales y almidón, respectivamente. Materiales y métodos: Para la cuantificación de azúcares reductores se utilizaron soluciones de glucosa con concentraciones entre un rango de 0,5 a 1,7 g/L, y esto se realizó con la técnica del ácido 3,5 Dinitrosalicílico (DNS), para la cuantificación de proteínas se utilizo la técnica de Bradford y solución de albúmina en un rango de concentración de 100 a 700 μg/mL, para cuantificar la cantidad de almidón se utilizó una solución de este a concentraciones entre 300 y 1000 μg/mL, para esto se utilizó espectrofotometría, con los datos que se obtuvieron en cada etapa del procedimiento se realizo una regresión lineal donde se obtuvo una ecuación que describe la absorbancia en términos de la concentración. Resultados: La ecuación que describe la relación entre la absorbancia y la concentración de azucares reductores fueY= 0,5105x0,0149 con un r2 = 0,9982, la ecuación que describe esta relación con proteínas es Y=0,0953x+0,0439 con un r2 = 0,9952 yla que describe la concentración de almidón es Y=0,0004x+0,1251 con un r2= 0,9845. Conclusión: Con el uso de las curvas patrón se pudo determinar ecuaciones que nos permiten identificar la concentración de proteínas extracelulares, azucares reductores y el almidón.

PALABRAS CLAVES: Curva Patrón, azucares reductores, ácido 3,5 dinitrosalicílico, proteínas, Bradford, almidón, yodato-yoduro, absorbancia

INTRODUCCION

Cada sustancia. cuya presencia puede detectarse por lectura de la Absorbancia en la longitud de onda de 540nm (3). respectivamente. del ácido bicincónico. Para cuantificar azúcares reductores se utiliza el método del ácido 3. En la practica de laboratorio se llevaron a cabo tres curvas patrón. proteínas y almidón. en términos simples el receptor puede absorber energía o no(1). hay una probabilidad finita de que su energía pueda ser transferida al receptor en un proceso discontinuo. si se emplea la curva de calibración. el siguiente paso es establecer una relación matemática con los datos obtenidos. o curva de calibración es una herramienta de la química analítica que se emplea para medir la concentración de una sustancia en una muestra. requiere de diferentes métodos para su cuantificación. se puede interpolar el dato de la muestra problema hasta encontrar la concentración del analito. proteínas totales y almidón. por ejemplo para el desarrollo de este laboratorio se utilizaron dos variables como lo son la absorción que guiados por la teoría cuántica que dice que si hay una “colisión” entre un fotón y un receptor (átomo. por asimilación de los elementos de una concentración conocida.La otra variable que se utilizo fue la concentración de la sustancia o elemento que se quería determinar. por su composición química. Para realizar la curva de calibración se realizo una serie de diluciones a partir de una muestra cuya concentración se conocía previamente. Bradford y yodo-yoduro. por otro lado. tras la unión a las proteínas torna a color azul (4). método de Lowry. Se dice que la respuesta de la muestra puede ser cuantificada y. el cual se basa en la reducción del DNS (de color amarillo) por la glucosa u otro azúcar reductor al ácido 3-amino-5-nitrosalicílico (de color rojo ladrillo). uno de los más usuales es el método de Bradford. en condiciones fuertemente ácidas el colorante suele ser más estable. azúcares reductores. entre otros. pero sin duda. Estos métodos suelen tener una respuesta lineal sobre la que se le realiza un análisis estadístico de regresión para evaluar la confiabilidad de los datos (2). tornando a un color rojo. en un medio débilmente ácido. existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas como reacciones de biuret. MATERIALES Y METODOS: .Una curva patrón. El objetivo de esta introducción es ilustrarnos para cumplir el objetivo de la practica el cual es realizar una serie de curvas patrón por los métodos de DNS. Se basa principalmente en una relación lineal entre un carácter medible. ocurre rápidamente liberando yodo el cual se detecta fácilmente con almidón.5 di-nitrosalicílico o llamado también DNS. Finalmente. ion o molécula). que se basa en un equilibrio entre las tres formas del azul de Commassie (colorante). para la cuantificación del almidón se utilizó la técnica yoduro – yodato esta prueba se basa en la reacción donde. para la cuantificación de azúcares reductores. El yodo por fuerzas de Van der vals se une a los enlace α 1-4 del almidón formando un complejo de inclusión que forman un color violeta (5).

1ml de NaCl y 5ml de reactivo de Bradford y se prepararon soluciones que contenían 0.400.5ml de agua destilada y luego se realizó una medición en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 540nm. 1. al cabo de esto se llevaron estos tubos a una temperatura de ebullición por 5 minutos. Para la determinación de la concentración de proteínas mediante la técnica de Bradford se preparo un blanco con 0. 1. Para la determinación de la concentración de almidón mediante la técnica de yodo-yoduro se preparo un blanco con 1ml de solución de sales.5.25ml de DNS. . 700 μg/ml. 200.25ml de la dilución mas 0.7) g/L se preparo una solución que contenía 0.500.400. Para la determinación de la concentración de glucosa mediante la técnica de DNS se preparo un blanco con 0. 0. se homogenizan y se leen en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 650nm. Una vez que se enfriaron los tubos se les agregó 2.0.700. 0.5. con las concentraciones de glucosa (0. CURVA PATRON PARA LA DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE PROTEINAS: Con la ecuación de la volumetría se prepararon soluciones con las siguientes concentraciones de albumina 100.1ml de cada dilución con 5ml del reactivo de Bradford.5.25ml de reactivo DNS y 0. 1.800 y1000 μg/ml. Curva patrón para la determinación de azúcares reductores.7. se midió la absorbancia de estas soluciones a una longitud de onda de 595nm CURVA PATRON PARA LA DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE ALMIDON: Con la ecuación de la volumetría se prepararon soluciones con las siguientes concentraciones de almidón 300.7) g/L. 300. 1. 1. 600.0.5. 1.7.CURVA PATRON PARA LA DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES: Con la ecuación de la volumetría se prepararon soluciones con las siguientes concentraciones de glucosa (0.600. al terminar este tiempo se pasaron los tubos a un recipiente que contenía hielo para frenar la reacción. RESULTADOS 1.25ml de agua. 1ml de solución de yodo-yoduro y 2 ml de agua destilada y a partir de las diluciones preparadas se preparan soluciones con 1ml de estas mas 1ml de reactivo yodo-yoduro y 2ml de gua destilada.

084 0.750 0.261 0.811 0.La curva patrón para cuantificación de azúcares reductores se obtuvo producto de los resultados del experimento llevados a cabo por las monitoras y por los estudiantes del laboratorio.304 0.532 0.33974 30.871 3 0.984 Promedio 0. Resultados de la curva patrón de glucosa por DNS (monitoría).207 0.085 7.16797 10.077 3 0.424 0. Abs a 540nm (monitoría) Réplica Concentraciones g/L 0.470 0.212 0.240 0. Se puede observar que el coeficiente de variación es alto. los cuales se encuentran fuera del rango de un estudio químico (máximo 5%).051 0.7 2 1 0.211 0.221332 0.094927 0.454 0.418 0.699 1. Concentración de azúcar en g/L Vs.808 1.318 0.241 0.102896 CV 30.89211 29.005 8.068 4 0.523 0.323 0.712 0.896 1.827 0.367 0.52879 29.146 La tabla 1 muestra los resultados obtenidos por las monitoras al efectuar el ensayo de DNS sobre las muestras de glucosa.250809 0.632 0.498 0.251 0.026 0.154546 0.655 0.5 0.304 0.792 0. Resultados de la curva patrón de glucosa por DNS (estudiantes) Concentración de azúcar en g/L Vs.876 1.5 1.7 1 1.293 0. Abs a 540nm GRUPOS Concentraciones (g/L) 0.328 0.261 0.316 0.488 0.079942 0.697 0.233 0. en la que se observa un aumento de las absorbancias conforme aumentan las concentraciones de azúcar.831 1.962 2 0.947 Promedio 0.837 0.254 11.006 8 0. así como los coeficientes de variación.025 0.758 1.817 0. Los resultados se consignan a continuación en la tabla número 1 y en la tabla número 2.727 0.480 0.785 0.949 1. Tabla 1.130 1.932 7 0.490 0.374 0.300 0.362 0.214 11.027 0.379 0.166 2 0.754 0.64373 25. Tabla 2.028 0.060 1.139 0.7 1 1.071 CV (%) 10.011 DS 0.139 3.995 DS 0.130 6 0.933 5 0.755 0.856 0.290 0.7 2 1 0.17516 En la tabla número 2 se registran los datos de los 8 grupos de laboratorio tomados para cada una de las concentraciones de glucosa.693 0. .5 0.280 0.352 0.419 0.879 0.240 0.5 1.

792 0.028 0.379 0.328 0.7 2 1 2 3 0.7 1 1.074 0.600 9. Se eliminaron grupos de datos para obtener un menor coeficiente de variación entre las absorbancias medidas.025 0.304 0.Tabla 2a.500 0. Figura 1.932 7 0.238 6.488 0.5 0.365 5.774 0.480 0.069 0.579 11.5 1.240 0.518 8.795 La tabla 2a registra las réplicas que más se acomodan a la tendencia de los datos de absorbancia. Resultados de la curva patrón de glucosa por DNS RECORTADO (autores) Concentración de azúcar en g/L Vs.002 DS 0. debido a que el mismo era demasiado alto y se encontraron réplicas que se encontraban demasiado desviadas de los datos experimentales de control interno. según lo obtenido por las monitoras del laboratorio. para cada una de las muestras. Gráfico representativo de la curva patrón de glucosa (monitoría).261 0.038 0.758 1.693 0. Abs a 540nm (recortado) GRUPOS Concentraciones (g/L) 0.006 8 Promedio 0.876 1.838 1.532 0.237 0.068 4 5 6 0.837 0.337 0. .211 0.879 0.068 CV (%) 10.

Concentraciones.178 0.En la figura 1 se puede apreciar la relación casi lineal entre las concentraciones de glucosa y las absorbancias de cada una.4426666 o 0.422 0.3893333 0.387 0. Curva patrón para la cuantificación de proteínas.0376430 .0545802 0.684 0.763 0.668 0. Abs a 595nm (monitoría) 200 Réplica 100 µg/mL µg/mL 300 µg/mL 400 µg/mL 600 µg/mL 700 µg/mL 1 0.0420039 0. Figura 2.725 DS 0. 2.557 0.42 0.036 0. Tabla 3. Gráfico representativo de la curva patrón de glucosa (autores).415 0. y la regresión lineal de los datos con la ecuación de dicha regresión y su r2 de 0.082 0.262 0.491 0.0295691 0. realizado por las monitoras del laboratorio y por los estudiantes. de las 3 réplicas que más se ajustaron a los resultados del control.684 3 0. En las tablas 3 y 4 se registran los datos obtenidos de proteínas totales (albúmina de suero bovino) por el método de Bradford. Resultados de la curva patrón de proteínas por el método de Bradford (monitoría) Concentraciones de Albúmina de suero bovino Vs.145 0.9962. de absorbancias Vs. En la figura 2 se observa la representación gráfica de los datos obtenidos por los estudiantes.733 2 0.1039278 0.361 0.298 0.175 0.758 Promedi 0.226 0.262 3 7 0. respectivamente.

141 0.585 6 7 0.532 0.289 34. Concentraciones de Albúmina de suero bovino Vs.082 0.714 24.112 0. Tabla 4.265 0.049 0.5948102 9.485 0.555 5 0.1921462 4 8 9 1 8 7 En la tabla 3 se consignan los resultados obtenidos por las monitoras del laboratorio en la prueba.282 0.528 0.558 3 0.553 15.266 0.092 0.641528 13.171 En la tabla 4 se consignan los resultados obtenidos por cada uno de los grupos de laboratorio en la prueba.555 5 0.579 0.399 0. se encontraron problemas en el muestreo de uno o más puntos.377 0. Tabla 4a.237 0.530 7 0.401 0.072 0.658 8 0.147 0.078 0.115 0.060 0.318 0.561 DS 0.514 0.221 0.045 0.208 0.112 0.426 0.514 0.609 0.124 0.063 CV (%) 53.585 6 0. Resultados de la curva patrón de proteínas por el método de Bradford (autores).280 0.485 0.165 0.041 0.399 0.207 0. Se puede observar que el coeficiente de variación es alto.609 Promedio 0.4888482 15.763 25.165 0.226 11. Abs a 595nm (recortado) 100 200 300 400 600 700 Grupo µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL 1 2 3 4 0. Resultados de la curva patrón de proteínas por el método de Bradford (estudiantes).374 0.558062 5. Abs a 595nm 100 200 300 400 600 700 Grupo µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL 1 0.399 0.318 0.239 0.467 2 0.515 0.279 0.216 0.401 0.339 0.658 8 .377 0.174 0. Se pudo observar que al ser el coeficiente de variación tan alto.523 4 0.216 0.579 0.239 0.082 0.112 0. Concentraciones de Albúmina de suero bovino Vs.089 0.410 0.CV (%) 2 3 7 6 6 37.141 0.532 0.237 0.342 0.363 0.282 0.035 0.170 0.74045 7.

013 5.9768.048 14.049 11.727 0. Gráfico representativo de la curva patrón de proteínas (autores).139 0. Figura 3.034 6.326 0. Gráfico representativo de la curva patrón de proteínas (monitoría) En la figura 3 se puede apreciar la relación de las absorbancias y las concentraciones de proteína de las muestras analizadas. En la figura se puede apreciar la ecuación de la linealización y el r2 de 0.542 0.196 0.524 0.460 0.053 8.027 19. Se puede apreciar que los coeficientes de variación son mucho más bajos que tomando todo el grupo de gatos completo.Promedio DS CV (%) 0.839 En la tabla 4a se consignan los resultados de las réplicas que presentaron mayor igualdad a los datos obtenidos por las monitoras en la prueba.231 0.428 0.599 0. . Figura 4.047 0.

Abs a 650nm 300 400 500 600 700 800 0.016 0.9952.En la figura 4 se puede apreciar la representación de los datos obtenidos y su relación casi lineal (Abs vs. Se puede observar que el coeficiente de variación de dichos datos es relativamente bajo.246 0.349 0.011 0.465 0.254 3.436 0.543 0. Concentración).398 0. Curva patrón para la cuantificación de almidón. Réplica 1 2 3 Promedio DS CV (%) Concentración de almidón en µg/mL Vs.338 En la tabla 5 se consignan los datos experimentales obtenidos por las monitoras del laboratorio en la práctica. En las tablas 5 y 6 se consignan los datos obtenidos experimentalmente por las monitoras del laboratorio y por los estudiantes durante la práctica.894 3.390 0.245 0. Tabla 5.030 5.248 0.357 0.557 0.002 0.420 0.301 0.620 4.439 0.686 3.429 0.284 0.246 0.309 0.336 0.354 0.015 0.492 0.452 0. Tabla 6.015 0.601 0. 3.169 1000 0.310 0.403 0. Resultados de la curva patrón de almidón por el método de Lugol (monitoría). así como la ecuación de la linealización y el r2 de 0. .012 0.467 0.475 0. Resultados de la curva patrón de almidón por el método de Lugol (estudiantes).858 2.567 0.

014 0.365 0.284 0.015 0.364 0.014 0.Grupo 1 2 3 4 5 6 7 8 Promedio DS CV (%) Concentración de almidón en µg/mL Vs.292 3.499 0. Se puede apreciar que el coeficiente de variación no es muy alto.472 0.478 0.393 0.467 0.457 0.093 1000 0.310 0.287 0.419 0.285 0.794 4. Abs a 650nm 300 400 500 600 700 800 0.351 0.430 0.242 0.287 0.360 0.227 0.548 0.427 0.271 0. incluyendo su ecuación de la recta y el r 2 de 0.027 5.411 0.535 0.534 0.236 0.505 0.446 0.099 En la tabla 6 se consignan los resultados obtenidos por los 8 grupos de laboratorio.500 0.359 0. Figura 6. así como de la linealización de los mismos. Gráfico representativo de la curva patrón de almidón (estudiantes).310 0.415 0.373 0. .237 0.946 5.007 0.887 4.430 0.303 0.386 0. Figura 5.425 0. En la figura 5 se pueda apreciar la representación de los datos en una gráfica.013 0. Gráfico representativo de la curva patrón de almidón (monitoría).348 0.397 0.493 2.401 0.420 0.386 0.467 0.559 0.234 0.292 0.9957.238 0.475 0.522 0.229 0.358 0.393 0.222 0.385 0.417 0.442 0.465 0.237 0.534 0.577 0.024 2.326 0.331 0.

según la ley de Lambert-Beer. para luego obtener. tomando en base las mediciones de absorbancia realizadas a muestras de concentración conocida. como el diámetro.En la figura 6 se puede apreciar la representación de los datos en un gráfico. respecto a los datos de absorbancia solo se cumple desde 0. DISCUSIÓN La elaboración de una curva patrón es un paso muy importante para la determinación de las concentraciones de una muestra a analizar. teniendo un parámetro con el que se relaciona dicha concentración por medio de la curva patrón.9845. con la ecuación de la recta y el r 2 de 0. Lugol). se debe tener en cuenta que. En la práctica se construyeron 3 curvas patrón para distintos propósitos. En general. mediante la ayuda de un programa de hoja de cálculo o CAS. el comportamiento lineal de los datos de concentración.1 hasta 1 unidades . así como de la linealización de los mismos. a las que se les halla una determinada Absorbancia. A la hora de trabajar con absorbancias. se utilizan soluciones de concentración conocida. para la construcción de curvas patrón. graficándose finalmente cada pareja de puntos en un sistema cartesiano y así lograr obtener una línea recta que relacione dichas concentraciones con el parámetro medido. empleando métodos colorimétricos (DNS. por ejemplo u otro parámetro. una linealización de dichos puntos y poder así predecir qué concentración tendrá una muestra de determinada absorbancia. Bradford.

CONCLUSIONES - De acuerdo al procedimiento de la práctica se pudo conocer los fundamentos químicos. Bradford y yodo-yoduro. se encontraban bastante dispersos. Dicha situación no se presentó en los datos de la tercera curva. En los datos obtenidos en las 2 primeras practicas correspondientes a las curvas patrón de azúcares reductores y proteínas. La primera curva realizada fue la curva patrón para la determinación de azúcares reductores por el método de DNS. La segunda curva realizada fue la curva patrón para la cuantificación de proteínas según el método de Bradford. La tercera curva realizada fue la curva patrón para la cuantificación de almidón según el método de Lugol. el cual se basa en la interacción de ciertos aminoácidos como la Histidina y la arginina. con las que se procedió a realizar cada una de las curvas. un mínimo de réplicas aceptable (3 réplicas). . formando un complejo yodoalmidón y rindiendo un color violeta que indica la presencia de almidón positiva (8). se pudo observar que los datos de las réplicas. para dar lugar a una reacción colorimétrica (7). más allá de éste rango. por lo que se empleó todo el conjunto de datos (8 réplicas) para hacer las mediciones de la curva patrón. con el colorante azul de Coomasie. la de almidón.de absorbancia. el comportamiento de los datos empieza a ser polinómico y por ende la relación 1 a 1 se pierde. cada una correspondiente a un grupo de trabajo del laboratorio. el correcto procedimiento y la importancia de las técnicas de DNS. Dicho proceso es un método ampliamente utilizado en microbiología para la detección de sustratos iniciales de un medio específico. el cual es un método bastante fiable y preciso para la determinación de dichos azúcares (6). a la calibración incorrecta de los equipos o a fallas de manejo de los grupos de laboratorio. presentando un coeficiente de variación muy alto (mayor al 5%). Estos resultados tan diferentes pueden deberse a la sensibilidad de los reactivos. así como de sustratos residuales. por lo que se debió proceder a recortar el número de réplicas que se tomaron para efectuar dichas curvas patrón obteniendo al final. que permiten hacer cálculos cinéticos para los microorganismos involucrados en un proceso fermentativo. el cual se basa en la detección del almidón debido a la interacción del yodo con las hélices del almidón.

Fundamentos de química analítica.Miller GL.Gonzales C. México. Anal Biochem.- Con el uso de las curvas patrón se pudo determinar y se hallaron ecuaciones que nos permiten saber o cuantificar las concentraciones de almidón. Madrid (2003) 3. Fundamentos de química. México DF. Primera edición (2002). 4. 410p. 426. Universidad Nacional de Colombia. 426. Laxmi Publications. . Sede Bogota. PEARSON. 2003 6. 72: 248-254. An introduction to practical biotechnology. 540p. 7. Chem. 1959. 31. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Introducción a los métodos instrumentales de análisis. proteínas y azucares reductores.Bradford MM (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. 8.. Anal. 5.Alfonso Clavijo Diaz. Ed. Anal. 1959. - - BIBLIOGRAFÍA 1. purification and characterization. Utilizando el conocimiento aprendido en estas practicas se pueden hallar diferentes ecuaciones para cuantificar diferentes compuestos que están presentes en una gran cantidad de reacciones. pg 805 2. Primera edición. Chem. Principles and reactions of protein extraction. McGraw-Hill. año 2006. Cuarta edición. CRC Press..Miller GL. 31.Harisha S.Burns R. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Mediante una previa investigación y en las practicas se identificaron los factores que pueden llegar a interrumpir o dar falsos positivos en las técnicas utilizadas.Ahmed H. año 2005.

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