Pontificia Universidad Javeriana Facultad de ciencias basicas Departamento de Microbiologia Informe curvas patron para la determinar azucares reductores

(DNS), cuantificacion de proteinas (Bradford) y cuantificacion de almidon (yodatoyoduro) Viernes – Grupo 7 Nicolas Martinez Aldana, Luis miguel chaves

RESUMEN Objetivo: Realizar una serie de curvas patrón por los métodos de DNS, Bradford y yodo-yoduro, para la cuantificación de azúcares reductores, proteínas totales y almidón, respectivamente. Materiales y métodos: Para la cuantificación de azúcares reductores se utilizaron soluciones de glucosa con concentraciones entre un rango de 0,5 a 1,7 g/L, y esto se realizó con la técnica del ácido 3,5 Dinitrosalicílico (DNS), para la cuantificación de proteínas se utilizo la técnica de Bradford y solución de albúmina en un rango de concentración de 100 a 700 μg/mL, para cuantificar la cantidad de almidón se utilizó una solución de este a concentraciones entre 300 y 1000 μg/mL, para esto se utilizó espectrofotometría, con los datos que se obtuvieron en cada etapa del procedimiento se realizo una regresión lineal donde se obtuvo una ecuación que describe la absorbancia en términos de la concentración. Resultados: La ecuación que describe la relación entre la absorbancia y la concentración de azucares reductores fueY= 0,5105x0,0149 con un r2 = 0,9982, la ecuación que describe esta relación con proteínas es Y=0,0953x+0,0439 con un r2 = 0,9952 yla que describe la concentración de almidón es Y=0,0004x+0,1251 con un r2= 0,9845. Conclusión: Con el uso de las curvas patrón se pudo determinar ecuaciones que nos permiten identificar la concentración de proteínas extracelulares, azucares reductores y el almidón.

PALABRAS CLAVES: Curva Patrón, azucares reductores, ácido 3,5 dinitrosalicílico, proteínas, Bradford, almidón, yodato-yoduro, absorbancia

INTRODUCCION

ocurre rápidamente liberando yodo el cual se detecta fácilmente con almidón. por otro lado. para la cuantificación de azúcares reductores. azúcares reductores. ion o molécula). Finalmente. respectivamente. En la practica de laboratorio se llevaron a cabo tres curvas patrón. tras la unión a las proteínas torna a color azul (4). proteínas y almidón. Se basa principalmente en una relación lineal entre un carácter medible. Para realizar la curva de calibración se realizo una serie de diluciones a partir de una muestra cuya concentración se conocía previamente.Una curva patrón. uno de los más usuales es el método de Bradford.La otra variable que se utilizo fue la concentración de la sustancia o elemento que se quería determinar. el siguiente paso es establecer una relación matemática con los datos obtenidos. Se dice que la respuesta de la muestra puede ser cuantificada y. cuya presencia puede detectarse por lectura de la Absorbancia en la longitud de onda de 540nm (3). método de Lowry. en términos simples el receptor puede absorber energía o no(1). Cada sustancia. El yodo por fuerzas de Van der vals se une a los enlace α 1-4 del almidón formando un complejo de inclusión que forman un color violeta (5). MATERIALES Y METODOS: . existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas como reacciones de biuret. por asimilación de los elementos de una concentración conocida. se puede interpolar el dato de la muestra problema hasta encontrar la concentración del analito. tornando a un color rojo. por ejemplo para el desarrollo de este laboratorio se utilizaron dos variables como lo son la absorción que guiados por la teoría cuántica que dice que si hay una “colisión” entre un fotón y un receptor (átomo. en condiciones fuertemente ácidas el colorante suele ser más estable. requiere de diferentes métodos para su cuantificación. en un medio débilmente ácido. proteínas totales y almidón. para la cuantificación del almidón se utilizó la técnica yoduro – yodato esta prueba se basa en la reacción donde. o curva de calibración es una herramienta de la química analítica que se emplea para medir la concentración de una sustancia en una muestra. Estos métodos suelen tener una respuesta lineal sobre la que se le realiza un análisis estadístico de regresión para evaluar la confiabilidad de los datos (2). por su composición química. el cual se basa en la reducción del DNS (de color amarillo) por la glucosa u otro azúcar reductor al ácido 3-amino-5-nitrosalicílico (de color rojo ladrillo). entre otros. Para cuantificar azúcares reductores se utiliza el método del ácido 3. del ácido bicincónico. Bradford y yodo-yoduro. hay una probabilidad finita de que su energía pueda ser transferida al receptor en un proceso discontinuo. El objetivo de esta introducción es ilustrarnos para cumplir el objetivo de la practica el cual es realizar una serie de curvas patrón por los métodos de DNS. pero sin duda. que se basa en un equilibrio entre las tres formas del azul de Commassie (colorante). si se emplea la curva de calibración.5 di-nitrosalicílico o llamado también DNS.

CURVA PATRON PARA LA DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES: Con la ecuación de la volumetría se prepararon soluciones con las siguientes concentraciones de glucosa (0. Para la determinación de la concentración de proteínas mediante la técnica de Bradford se preparo un blanco con 0. 0. al cabo de esto se llevaron estos tubos a una temperatura de ebullición por 5 minutos. 1ml de solución de yodo-yoduro y 2 ml de agua destilada y a partir de las diluciones preparadas se preparan soluciones con 1ml de estas mas 1ml de reactivo yodo-yoduro y 2ml de gua destilada.7.1ml de NaCl y 5ml de reactivo de Bradford y se prepararon soluciones que contenían 0. 1. CURVA PATRON PARA LA DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE PROTEINAS: Con la ecuación de la volumetría se prepararon soluciones con las siguientes concentraciones de albumina 100.5ml de agua destilada y luego se realizó una medición en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 540nm. 600. 1.400. Una vez que se enfriaron los tubos se les agregó 2. con las concentraciones de glucosa (0.5.5. 1.7) g/L se preparo una solución que contenía 0.1ml de cada dilución con 5ml del reactivo de Bradford. 0. 300. se midió la absorbancia de estas soluciones a una longitud de onda de 595nm CURVA PATRON PARA LA DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE ALMIDON: Con la ecuación de la volumetría se prepararon soluciones con las siguientes concentraciones de almidón 300. RESULTADOS 1. se homogenizan y se leen en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 650nm.0. Para la determinación de la concentración de almidón mediante la técnica de yodo-yoduro se preparo un blanco con 1ml de solución de sales.7. 1.700. Curva patrón para la determinación de azúcares reductores. 1.5.25ml de reactivo DNS y 0.25ml de agua. 1. 200. 700 μg/ml.7) g/L.5.25ml de la dilución mas 0. Para la determinación de la concentración de glucosa mediante la técnica de DNS se preparo un blanco con 0.800 y1000 μg/ml.500.400. al terminar este tiempo se pasaron los tubos a un recipiente que contenía hielo para frenar la reacción.600.25ml de DNS.0. .

876 1.933 5 0.079942 0.811 0.006 8 0.5 1. Abs a 540nm GRUPOS Concentraciones (g/L) 0.758 1. Resultados de la curva patrón de glucosa por DNS (estudiantes) Concentración de azúcar en g/L Vs.7 2 1 0.480 0. Resultados de la curva patrón de glucosa por DNS (monitoría).856 0.102896 CV 30.304 0.837 0.250809 0.995 DS 0.154546 0.5 0.949 1.261 0.362 0.212 0.498 0. .290 0.028 0.632 0.454 0.071 CV (%) 10. Tabla 2.005 8.051 0.026 0.727 0.750 0.146 La tabla 1 muestra los resultados obtenidos por las monitoras al efectuar el ensayo de DNS sobre las muestras de glucosa.792 0.655 0.068 4 0.318 0. en la que se observa un aumento de las absorbancias conforme aumentan las concentraciones de azúcar.130 1.89211 29.367 0.831 1.984 Promedio 0.214 11.5 0.5 1.699 1.328 0.084 0.785 0.52879 29.488 0.947 Promedio 0.697 0.755 0.712 0.323 0.490 0.240 0. Los resultados se consignan a continuación en la tabla número 1 y en la tabla número 2.932 7 0.693 0.094927 0.418 0.962 2 0.523 0.166 2 0.060 1.241 0.879 0. Concentración de azúcar en g/L Vs. Tabla 1. Se puede observar que el coeficiente de variación es alto.316 0.221332 0.7 1 1.871 3 0.379 0.817 0.261 0.352 0.139 3.7 1 1.254 11.027 0.077 3 0.827 0.207 0.424 0.896 1.17516 En la tabla número 2 se registran los datos de los 8 grupos de laboratorio tomados para cada una de las concentraciones de glucosa.280 0.293 0. los cuales se encuentran fuera del rango de un estudio químico (máximo 5%). así como los coeficientes de variación.139 0.16797 10.011 DS 0.La curva patrón para cuantificación de azúcares reductores se obtuvo producto de los resultados del experimento llevados a cabo por las monitoras y por los estudiantes del laboratorio.7 2 1 0.754 0.304 0.085 7.808 1.470 0.211 0.64373 25.33974 30.130 6 0.300 0.240 0.025 0.532 0.233 0.419 0.251 0. Abs a 540nm (monitoría) Réplica Concentraciones g/L 0.374 0.

600 9.261 0.240 0. para cada una de las muestras.932 7 0.532 0. .7 1 1.002 DS 0.758 1.876 1. Resultados de la curva patrón de glucosa por DNS RECORTADO (autores) Concentración de azúcar en g/L Vs.038 0. Se eliminaron grupos de datos para obtener un menor coeficiente de variación entre las absorbancias medidas.028 0.500 0.337 0.488 0.579 11.006 8 Promedio 0.792 0.379 0. Abs a 540nm (recortado) GRUPOS Concentraciones (g/L) 0.068 4 5 6 0. según lo obtenido por las monitoras del laboratorio.480 0.237 0.238 6.304 0.074 0. Figura 1.069 0.328 0.693 0.774 0. debido a que el mismo era demasiado alto y se encontraron réplicas que se encontraban demasiado desviadas de los datos experimentales de control interno.7 2 1 2 3 0.365 5.879 0.Tabla 2a.5 0.518 8.5 1.068 CV (%) 10.211 0.837 0. Gráfico representativo de la curva patrón de glucosa (monitoría).838 1.795 La tabla 2a registra las réplicas que más se acomodan a la tendencia de los datos de absorbancia.025 0.

1039278 0.175 0.387 0. de las 3 réplicas que más se ajustaron a los resultados del control. 2. Gráfico representativo de la curva patrón de glucosa (autores). y la regresión lineal de los datos con la ecuación de dicha regresión y su r2 de 0.262 0.178 0.557 0.684 0.361 0.0295691 0.4426666 o 0.684 3 0.491 0.298 0. Figura 2.036 0. de absorbancias Vs. Resultados de la curva patrón de proteínas por el método de Bradford (monitoría) Concentraciones de Albúmina de suero bovino Vs. respectivamente.145 0.415 0. Curva patrón para la cuantificación de proteínas.725 DS 0.262 3 7 0.3893333 0.En la figura 1 se puede apreciar la relación casi lineal entre las concentraciones de glucosa y las absorbancias de cada una.763 0.733 2 0. realizado por las monitoras del laboratorio y por los estudiantes. Abs a 595nm (monitoría) 200 Réplica 100 µg/mL µg/mL 300 µg/mL 400 µg/mL 600 µg/mL 700 µg/mL 1 0.0420039 0. En la figura 2 se observa la representación gráfica de los datos obtenidos por los estudiantes.42 0.668 0.9962.422 0. Concentraciones.226 0.0545802 0. En las tablas 3 y 4 se registran los datos obtenidos de proteínas totales (albúmina de suero bovino) por el método de Bradford.082 0.0376430 . Tabla 3.758 Promedi 0.

165 0.174 0.216 0.523 4 0.171 En la tabla 4 se consignan los resultados obtenidos por cada uno de los grupos de laboratorio en la prueba.165 0.410 0.399 0.485 0.426 0.485 0. se encontraron problemas en el muestreo de uno o más puntos.514 0.282 0.063 CV (%) 53.049 0.141 0.377 0.207 0.112 0. Concentraciones de Albúmina de suero bovino Vs.399 0.553 15.237 0.342 0.609 Promedio 0.528 0.221 0.555 5 0.239 0.072 0. Abs a 595nm 100 200 300 400 600 700 Grupo µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL 1 0.112 0.579 0.609 0.714 24.318 0.374 0.266 0. Se pudo observar que al ser el coeficiente de variación tan alto.CV (%) 2 3 7 6 6 37.532 0.399 0.060 0.339 0.239 0.658 8 .041 0. Resultados de la curva patrón de proteínas por el método de Bradford (estudiantes).763 25.4888482 15.515 0.585 6 7 0.216 0.1921462 4 8 9 1 8 7 En la tabla 3 se consignan los resultados obtenidos por las monitoras del laboratorio en la prueba.585 6 0.530 7 0.170 0.115 0.082 0. Abs a 595nm (recortado) 100 200 300 400 600 700 Grupo µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL 1 2 3 4 0.045 0.265 0.5948102 9.401 0.532 0.363 0. Resultados de la curva patrón de proteínas por el método de Bradford (autores).318 0.641528 13. Concentraciones de Albúmina de suero bovino Vs.401 0.147 0.112 0. Se puede observar que el coeficiente de variación es alto.089 0.74045 7.237 0.124 0.514 0.558 3 0.467 2 0.226 11.280 0.555 5 0.289 34.558062 5. Tabla 4a. Tabla 4.208 0.579 0.377 0.658 8 0.092 0.035 0.082 0.141 0.078 0.561 DS 0.282 0.279 0.

027 19.013 5.048 14.727 0.049 11.428 0. Figura 3. Se puede apreciar que los coeficientes de variación son mucho más bajos que tomando todo el grupo de gatos completo. En la figura se puede apreciar la ecuación de la linealización y el r2 de 0.326 0.139 0.839 En la tabla 4a se consignan los resultados de las réplicas que presentaron mayor igualdad a los datos obtenidos por las monitoras en la prueba.047 0.053 8.460 0. .Promedio DS CV (%) 0.231 0.196 0.542 0.599 0.034 6.9768. Gráfico representativo de la curva patrón de proteínas (monitoría) En la figura 3 se puede apreciar la relación de las absorbancias y las concentraciones de proteína de las muestras analizadas. Gráfico representativo de la curva patrón de proteínas (autores).524 0. Figura 4.

439 0.002 0.254 3.245 0. Abs a 650nm 300 400 500 600 700 800 0.248 0.016 0.467 0.246 0.246 0.403 0. así como la ecuación de la linealización y el r2 de 0.357 0.567 0.420 0. Réplica 1 2 3 Promedio DS CV (%) Concentración de almidón en µg/mL Vs. Concentración).En la figura 4 se puede apreciar la representación de los datos obtenidos y su relación casi lineal (Abs vs.9952.354 0.452 0.310 0.390 0.543 0. Curva patrón para la cuantificación de almidón.309 0. Tabla 5.012 0.601 0.894 3.429 0. .349 0. Resultados de la curva patrón de almidón por el método de Lugol (monitoría).557 0.620 4.336 0.492 0.475 0.436 0. 3.338 En la tabla 5 se consignan los datos experimentales obtenidos por las monitoras del laboratorio en la práctica.858 2. Tabla 6.015 0.301 0.011 0. Resultados de la curva patrón de almidón por el método de Lugol (estudiantes).169 1000 0.015 0. Se puede observar que el coeficiente de variación de dichos datos es relativamente bajo.465 0.284 0.398 0. En las tablas 5 y 6 se consignan los datos obtenidos experimentalmente por las monitoras del laboratorio y por los estudiantes durante la práctica.030 5.686 3.

393 0.027 5. así como de la linealización de los mismos.419 0.465 0.303 0.393 0.534 0.411 0.007 0.430 0.093 1000 0.229 0.535 0.415 0. Gráfico representativo de la curva patrón de almidón (estudiantes). Se puede apreciar que el coeficiente de variación no es muy alto.Grupo 1 2 3 4 5 6 7 8 Promedio DS CV (%) Concentración de almidón en µg/mL Vs.310 0.364 0.287 0.446 0.222 0.425 0.310 0.534 0.577 0.887 4.365 0.326 0.348 0.386 0.505 0.467 0. Figura 6.292 3. Abs a 650nm 300 400 500 600 700 800 0.284 0. En la figura 5 se pueda apreciar la representación de los datos en una gráfica.292 0.427 0.285 0.430 0.360 0.467 0.475 0.794 4.500 0. Gráfico representativo de la curva patrón de almidón (monitoría).417 0.236 0.9957.237 0.478 0.522 0.386 0.397 0.014 0.373 0. .559 0.271 0.548 0.493 2.227 0.420 0.946 5.331 0.013 0.472 0. incluyendo su ecuación de la recta y el r 2 de 0.457 0.358 0.014 0.401 0.442 0.015 0. Figura 5.351 0.237 0.385 0.359 0.287 0.099 En la tabla 6 se consignan los resultados obtenidos por los 8 grupos de laboratorio.234 0.238 0.499 0.242 0.024 2.

se utilizan soluciones de concentración conocida. el comportamiento lineal de los datos de concentración. para la construcción de curvas patrón. como el diámetro. tomando en base las mediciones de absorbancia realizadas a muestras de concentración conocida. DISCUSIÓN La elaboración de una curva patrón es un paso muy importante para la determinación de las concentraciones de una muestra a analizar. así como de la linealización de los mismos. una linealización de dichos puntos y poder así predecir qué concentración tendrá una muestra de determinada absorbancia. graficándose finalmente cada pareja de puntos en un sistema cartesiano y así lograr obtener una línea recta que relacione dichas concentraciones con el parámetro medido. En la práctica se construyeron 3 curvas patrón para distintos propósitos.1 hasta 1 unidades . respecto a los datos de absorbancia solo se cumple desde 0. Lugol). Bradford. por ejemplo u otro parámetro. teniendo un parámetro con el que se relaciona dicha concentración por medio de la curva patrón. según la ley de Lambert-Beer. A la hora de trabajar con absorbancias. para luego obtener.En la figura 6 se puede apreciar la representación de los datos en un gráfico. empleando métodos colorimétricos (DNS.9845. se debe tener en cuenta que. a las que se les halla una determinada Absorbancia. En general. con la ecuación de la recta y el r 2 de 0. mediante la ayuda de un programa de hoja de cálculo o CAS.

el correcto procedimiento y la importancia de las técnicas de DNS. más allá de éste rango. presentando un coeficiente de variación muy alto (mayor al 5%).de absorbancia. con las que se procedió a realizar cada una de las curvas. un mínimo de réplicas aceptable (3 réplicas). el cual es un método bastante fiable y preciso para la determinación de dichos azúcares (6). CONCLUSIONES - De acuerdo al procedimiento de la práctica se pudo conocer los fundamentos químicos. para dar lugar a una reacción colorimétrica (7). La primera curva realizada fue la curva patrón para la determinación de azúcares reductores por el método de DNS. . formando un complejo yodoalmidón y rindiendo un color violeta que indica la presencia de almidón positiva (8). La segunda curva realizada fue la curva patrón para la cuantificación de proteínas según el método de Bradford. La tercera curva realizada fue la curva patrón para la cuantificación de almidón según el método de Lugol. por lo que se empleó todo el conjunto de datos (8 réplicas) para hacer las mediciones de la curva patrón. En los datos obtenidos en las 2 primeras practicas correspondientes a las curvas patrón de azúcares reductores y proteínas. a la calibración incorrecta de los equipos o a fallas de manejo de los grupos de laboratorio. Bradford y yodo-yoduro. el cual se basa en la detección del almidón debido a la interacción del yodo con las hélices del almidón. por lo que se debió proceder a recortar el número de réplicas que se tomaron para efectuar dichas curvas patrón obteniendo al final. Dicho proceso es un método ampliamente utilizado en microbiología para la detección de sustratos iniciales de un medio específico. Estos resultados tan diferentes pueden deberse a la sensibilidad de los reactivos. el cual se basa en la interacción de ciertos aminoácidos como la Histidina y la arginina. se encontraban bastante dispersos. Dicha situación no se presentó en los datos de la tercera curva. el comportamiento de los datos empieza a ser polinómico y por ende la relación 1 a 1 se pierde. se pudo observar que los datos de las réplicas. así como de sustratos residuales. la de almidón. con el colorante azul de Coomasie. que permiten hacer cálculos cinéticos para los microorganismos involucrados en un proceso fermentativo. cada una correspondiente a un grupo de trabajo del laboratorio.

426. Anal. 410p. An introduction to practical biotechnology. Madrid (2003) 3. 1959. 426.- Con el uso de las curvas patrón se pudo determinar y se hallaron ecuaciones que nos permiten saber o cuantificar las concentraciones de almidón. PEARSON.Harisha S.Miller GL. Primera edición. 2003 6. Sede Bogota. McGraw-Hill. México DF. Principles and reactions of protein extraction. pg 805 2. México.Burns R. Primera edición (2002). 8. Laxmi Publications. Anal Biochem. 5.Gonzales C. Utilizando el conocimiento aprendido en estas practicas se pueden hallar diferentes ecuaciones para cuantificar diferentes compuestos que están presentes en una gran cantidad de reacciones. 4.. 72: 248-254. purification and characterization. 31. Ed. proteínas y azucares reductores. año 2005. 7. año 2006. 540p.Alfonso Clavijo Diaz. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Fundamentos de química. Universidad Nacional de Colombia.Ahmed H.Miller GL. Mediante una previa investigación y en las practicas se identificaron los factores que pueden llegar a interrumpir o dar falsos positivos en las técnicas utilizadas. Introducción a los métodos instrumentales de análisis. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. 31..Bradford MM (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. - - BIBLIOGRAFÍA 1. . Fundamentos de química analítica. Chem. 1959. Cuarta edición. CRC Press. Anal. Chem.

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