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curvas patrón- viernes-g7

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Pontificia Universidad Javeriana Facultad de ciencias basicas Departamento de Microbiologia Informe curvas patron para la determinar azucares reductores

(DNS), cuantificacion de proteinas (Bradford) y cuantificacion de almidon (yodatoyoduro) Viernes – Grupo 7 Nicolas Martinez Aldana, Luis miguel chaves

RESUMEN Objetivo: Realizar una serie de curvas patrón por los métodos de DNS, Bradford y yodo-yoduro, para la cuantificación de azúcares reductores, proteínas totales y almidón, respectivamente. Materiales y métodos: Para la cuantificación de azúcares reductores se utilizaron soluciones de glucosa con concentraciones entre un rango de 0,5 a 1,7 g/L, y esto se realizó con la técnica del ácido 3,5 Dinitrosalicílico (DNS), para la cuantificación de proteínas se utilizo la técnica de Bradford y solución de albúmina en un rango de concentración de 100 a 700 μg/mL, para cuantificar la cantidad de almidón se utilizó una solución de este a concentraciones entre 300 y 1000 μg/mL, para esto se utilizó espectrofotometría, con los datos que se obtuvieron en cada etapa del procedimiento se realizo una regresión lineal donde se obtuvo una ecuación que describe la absorbancia en términos de la concentración. Resultados: La ecuación que describe la relación entre la absorbancia y la concentración de azucares reductores fueY= 0,5105x0,0149 con un r2 = 0,9982, la ecuación que describe esta relación con proteínas es Y=0,0953x+0,0439 con un r2 = 0,9952 yla que describe la concentración de almidón es Y=0,0004x+0,1251 con un r2= 0,9845. Conclusión: Con el uso de las curvas patrón se pudo determinar ecuaciones que nos permiten identificar la concentración de proteínas extracelulares, azucares reductores y el almidón.

PALABRAS CLAVES: Curva Patrón, azucares reductores, ácido 3,5 dinitrosalicílico, proteínas, Bradford, almidón, yodato-yoduro, absorbancia

INTRODUCCION

5 di-nitrosalicílico o llamado también DNS. En la practica de laboratorio se llevaron a cabo tres curvas patrón. proteínas y almidón. uno de los más usuales es el método de Bradford. Para realizar la curva de calibración se realizo una serie de diluciones a partir de una muestra cuya concentración se conocía previamente. el siguiente paso es establecer una relación matemática con los datos obtenidos. del ácido bicincónico. por otro lado. el cual se basa en la reducción del DNS (de color amarillo) por la glucosa u otro azúcar reductor al ácido 3-amino-5-nitrosalicílico (de color rojo ladrillo). cuya presencia puede detectarse por lectura de la Absorbancia en la longitud de onda de 540nm (3). El yodo por fuerzas de Van der vals se une a los enlace α 1-4 del almidón formando un complejo de inclusión que forman un color violeta (5). o curva de calibración es una herramienta de la química analítica que se emplea para medir la concentración de una sustancia en una muestra. Cada sustancia. entre otros. existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas como reacciones de biuret. para la cuantificación del almidón se utilizó la técnica yoduro – yodato esta prueba se basa en la reacción donde. Estos métodos suelen tener una respuesta lineal sobre la que se le realiza un análisis estadístico de regresión para evaluar la confiabilidad de los datos (2). ocurre rápidamente liberando yodo el cual se detecta fácilmente con almidón. Bradford y yodo-yoduro. para la cuantificación de azúcares reductores. azúcares reductores. en términos simples el receptor puede absorber energía o no(1). se puede interpolar el dato de la muestra problema hasta encontrar la concentración del analito. El objetivo de esta introducción es ilustrarnos para cumplir el objetivo de la practica el cual es realizar una serie de curvas patrón por los métodos de DNS. Se basa principalmente en una relación lineal entre un carácter medible. tras la unión a las proteínas torna a color azul (4). por ejemplo para el desarrollo de este laboratorio se utilizaron dos variables como lo son la absorción que guiados por la teoría cuántica que dice que si hay una “colisión” entre un fotón y un receptor (átomo. requiere de diferentes métodos para su cuantificación. pero sin duda. Para cuantificar azúcares reductores se utiliza el método del ácido 3. proteínas totales y almidón. hay una probabilidad finita de que su energía pueda ser transferida al receptor en un proceso discontinuo.La otra variable que se utilizo fue la concentración de la sustancia o elemento que se quería determinar. si se emplea la curva de calibración. tornando a un color rojo. ion o molécula). por su composición química. MATERIALES Y METODOS: . en condiciones fuertemente ácidas el colorante suele ser más estable. por asimilación de los elementos de una concentración conocida. que se basa en un equilibrio entre las tres formas del azul de Commassie (colorante). en un medio débilmente ácido.Una curva patrón. respectivamente. Finalmente. Se dice que la respuesta de la muestra puede ser cuantificada y. método de Lowry.

1ml de solución de yodo-yoduro y 2 ml de agua destilada y a partir de las diluciones preparadas se preparan soluciones con 1ml de estas mas 1ml de reactivo yodo-yoduro y 2ml de gua destilada.5. con las concentraciones de glucosa (0.25ml de agua.5.0.5ml de agua destilada y luego se realizó una medición en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 540nm. 1. Para la determinación de la concentración de glucosa mediante la técnica de DNS se preparo un blanco con 0. Para la determinación de la concentración de almidón mediante la técnica de yodo-yoduro se preparo un blanco con 1ml de solución de sales.1ml de cada dilución con 5ml del reactivo de Bradford. RESULTADOS 1.500.7) g/L.400. al cabo de esto se llevaron estos tubos a una temperatura de ebullición por 5 minutos.5.25ml de reactivo DNS y 0. Una vez que se enfriaron los tubos se les agregó 2.1ml de NaCl y 5ml de reactivo de Bradford y se prepararon soluciones que contenían 0.7.400.800 y1000 μg/ml. 0.CURVA PATRON PARA LA DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES: Con la ecuación de la volumetría se prepararon soluciones con las siguientes concentraciones de glucosa (0.0. se midió la absorbancia de estas soluciones a una longitud de onda de 595nm CURVA PATRON PARA LA DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE ALMIDON: Con la ecuación de la volumetría se prepararon soluciones con las siguientes concentraciones de almidón 300.25ml de la dilución mas 0.7) g/L se preparo una solución que contenía 0. 1.5. 1.25ml de DNS. se homogenizan y se leen en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 650nm.600. 0. al terminar este tiempo se pasaron los tubos a un recipiente que contenía hielo para frenar la reacción. . 1. 200. 1.700. 300.7. CURVA PATRON PARA LA DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE PROTEINAS: Con la ecuación de la volumetría se prepararon soluciones con las siguientes concentraciones de albumina 100. 1. Curva patrón para la determinación de azúcares reductores. 700 μg/ml. 600. Para la determinación de la concentración de proteínas mediante la técnica de Bradford se preparo un blanco con 0.

Resultados de la curva patrón de glucosa por DNS (monitoría).454 0.316 0.280 0.792 0.154546 0.006 8 0.5 1. los cuales se encuentran fuera del rango de un estudio químico (máximo 5%).7 1 1.490 0. Abs a 540nm GRUPOS Concentraciones (g/L) 0.130 6 0.896 1.379 0.811 0.7 2 1 0.856 0. Tabla 1.166 2 0.5 0.64373 25.139 3.102896 CV 30. así como los coeficientes de variación.221332 0.207 0.254 11.367 0.876 1.085 7. Resultados de la curva patrón de glucosa por DNS (estudiantes) Concentración de azúcar en g/L Vs.754 0.011 DS 0.5 1.051 0.214 11.304 0.362 0.094927 0.251 0.488 0.240 0.La curva patrón para cuantificación de azúcares reductores se obtuvo producto de los resultados del experimento llevados a cabo por las monitoras y por los estudiantes del laboratorio.026 0.027 0.7 2 1 0. Abs a 540nm (monitoría) Réplica Concentraciones g/L 0.947 Promedio 0.025 0.304 0.750 0.233 0.5 0.827 0.655 0.962 2 0.212 0.831 1.785 0.52879 29.424 0.211 0.352 0.758 1.300 0.241 0.693 0.933 5 0.028 0.071 CV (%) 10.17516 En la tabla número 2 se registran los datos de los 8 grupos de laboratorio tomados para cada una de las concentraciones de glucosa. en la que se observa un aumento de las absorbancias conforme aumentan las concentraciones de azúcar.261 0.837 0.697 0.084 0.480 0.146 La tabla 1 muestra los resultados obtenidos por las monitoras al efectuar el ensayo de DNS sobre las muestras de glucosa.871 3 0.290 0. .318 0.293 0.16797 10.699 1.323 0.498 0. Se puede observar que el coeficiente de variación es alto. Concentración de azúcar en g/L Vs.808 1.33974 30.005 8. Tabla 2.632 0.879 0.89211 29.532 0.068 4 0.755 0.240 0.139 0.374 0.130 1.079942 0.7 1 1.949 1.418 0.060 1.932 7 0.328 0.470 0.419 0. Los resultados se consignan a continuación en la tabla número 1 y en la tabla número 2.523 0.712 0.727 0.817 0.984 Promedio 0.250809 0.077 3 0.995 DS 0.261 0.

Figura 1.758 1.792 0.365 5. según lo obtenido por las monitoras del laboratorio. .068 CV (%) 10.379 0.579 11.488 0.693 0.876 1.337 0.237 0.328 0.5 0.7 1 1.240 0.Tabla 2a.261 0.028 0.074 0.5 1.069 0.774 0.838 1.7 2 1 2 3 0. debido a que el mismo era demasiado alto y se encontraron réplicas que se encontraban demasiado desviadas de los datos experimentales de control interno. Abs a 540nm (recortado) GRUPOS Concentraciones (g/L) 0.025 0.480 0.518 8.795 La tabla 2a registra las réplicas que más se acomodan a la tendencia de los datos de absorbancia.211 0.238 6. Resultados de la curva patrón de glucosa por DNS RECORTADO (autores) Concentración de azúcar en g/L Vs.600 9.500 0.532 0.002 DS 0.304 0.837 0. Gráfico representativo de la curva patrón de glucosa (monitoría).038 0.932 7 0.068 4 5 6 0. Se eliminaron grupos de datos para obtener un menor coeficiente de variación entre las absorbancias medidas.879 0.006 8 Promedio 0. para cada una de las muestras.

En las tablas 3 y 4 se registran los datos obtenidos de proteínas totales (albúmina de suero bovino) por el método de Bradford. Concentraciones.036 0.557 0.668 0. Tabla 3.361 0. realizado por las monitoras del laboratorio y por los estudiantes. 2.415 0.9962.1039278 0. respectivamente.3893333 0.226 0. Gráfico representativo de la curva patrón de glucosa (autores). Figura 2.4426666 o 0.298 0.178 0.0295691 0. En la figura 2 se observa la representación gráfica de los datos obtenidos por los estudiantes.763 0.422 0.684 0.145 0.491 0.082 0.725 DS 0. Curva patrón para la cuantificación de proteínas.262 3 7 0.684 3 0. de absorbancias Vs. de las 3 réplicas que más se ajustaron a los resultados del control. Resultados de la curva patrón de proteínas por el método de Bradford (monitoría) Concentraciones de Albúmina de suero bovino Vs. Abs a 595nm (monitoría) 200 Réplica 100 µg/mL µg/mL 300 µg/mL 400 µg/mL 600 µg/mL 700 µg/mL 1 0.0545802 0.42 0.175 0.0420039 0.733 2 0. y la regresión lineal de los datos con la ecuación de dicha regresión y su r2 de 0.En la figura 1 se puede apreciar la relación casi lineal entre las concentraciones de glucosa y las absorbancias de cada una.262 0.758 Promedi 0.387 0.0376430 .

141 0.112 0.377 0. Tabla 4.041 0.115 0. Abs a 595nm 100 200 300 400 600 700 Grupo µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL 1 0.174 0.339 0.553 15.377 0.609 0.514 0.561 DS 0.280 0.363 0.4888482 15.207 0.530 7 0.523 4 0.374 0.226 11.579 0.342 0.112 0.216 0.221 0.237 0.585 6 7 0.609 Promedio 0.170 0.289 34.266 0.171 En la tabla 4 se consignan los resultados obtenidos por cada uno de los grupos de laboratorio en la prueba.485 0.410 0.282 0.318 0.239 0.426 0.658 8 .060 0.165 0.401 0.641528 13.399 0.532 0.089 0.265 0.515 0.165 0. se encontraron problemas en el muestreo de uno o más puntos.558062 5.072 0.CV (%) 2 3 7 6 6 37.216 0. Resultados de la curva patrón de proteínas por el método de Bradford (autores).514 0. Resultados de la curva patrón de proteínas por el método de Bradford (estudiantes).532 0.208 0.239 0.124 0.035 0.092 0.555 5 0.045 0. Abs a 595nm (recortado) 100 200 300 400 600 700 Grupo µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL 1 2 3 4 0. Tabla 4a.078 0.401 0.658 8 0.467 2 0.082 0.318 0.558 3 0.082 0.399 0.763 25.528 0.555 5 0.282 0.112 0.147 0.485 0.279 0.063 CV (%) 53.74045 7.141 0.399 0. Concentraciones de Albúmina de suero bovino Vs.049 0.5948102 9.579 0.1921462 4 8 9 1 8 7 En la tabla 3 se consignan los resultados obtenidos por las monitoras del laboratorio en la prueba. Se pudo observar que al ser el coeficiente de variación tan alto. Se puede observar que el coeficiente de variación es alto.714 24.237 0. Concentraciones de Albúmina de suero bovino Vs.585 6 0.

Figura 4.053 8. En la figura se puede apreciar la ecuación de la linealización y el r2 de 0.047 0.048 14.428 0.013 5.542 0. Se puede apreciar que los coeficientes de variación son mucho más bajos que tomando todo el grupo de gatos completo. .460 0.326 0.727 0.599 0.196 0.231 0.034 6.839 En la tabla 4a se consignan los resultados de las réplicas que presentaron mayor igualdad a los datos obtenidos por las monitoras en la prueba.027 19.524 0.9768.Promedio DS CV (%) 0.139 0. Gráfico representativo de la curva patrón de proteínas (autores).049 11. Gráfico representativo de la curva patrón de proteínas (monitoría) En la figura 3 se puede apreciar la relación de las absorbancias y las concentraciones de proteína de las muestras analizadas. Figura 3.

En las tablas 5 y 6 se consignan los datos obtenidos experimentalmente por las monitoras del laboratorio y por los estudiantes durante la práctica.245 0.248 0. Tabla 5.492 0.169 1000 0.011 0.567 0.016 0. Curva patrón para la cuantificación de almidón.858 2.015 0.429 0.601 0.543 0.En la figura 4 se puede apreciar la representación de los datos obtenidos y su relación casi lineal (Abs vs.336 0.9952.030 5. 3.012 0.439 0.894 3.620 4.349 0.002 0.338 En la tabla 5 se consignan los datos experimentales obtenidos por las monitoras del laboratorio en la práctica.686 3.465 0.301 0.015 0.403 0.452 0.398 0.254 3. Resultados de la curva patrón de almidón por el método de Lugol (monitoría). Réplica 1 2 3 Promedio DS CV (%) Concentración de almidón en µg/mL Vs. Resultados de la curva patrón de almidón por el método de Lugol (estudiantes).246 0. Concentración). así como la ecuación de la linealización y el r2 de 0.310 0.309 0.284 0.357 0.475 0.436 0. Tabla 6.420 0.390 0. Abs a 650nm 300 400 500 600 700 800 0.354 0.246 0.557 0.467 0. Se puede observar que el coeficiente de variación de dichos datos es relativamente bajo. .

237 0.364 0.013 0.457 0.014 0.385 0.242 0.478 0.499 0.310 0.222 0.577 0.393 0.397 0.365 0.236 0.285 0.500 0.238 0.475 0.505 0. así como de la linealización de los mismos.099 En la tabla 6 se consignan los resultados obtenidos por los 8 grupos de laboratorio. Figura 5.430 0.015 0.326 0.271 0.425 0.946 5.535 0.427 0.024 2. Figura 6.420 0.351 0.234 0.548 0.419 0.348 0.093 1000 0.287 0.9957.430 0. Abs a 650nm 300 400 500 600 700 800 0. Se puede apreciar que el coeficiente de variación no es muy alto.227 0.493 2.027 5.415 0.534 0.287 0.292 0.522 0.393 0.358 0.Grupo 1 2 3 4 5 6 7 8 Promedio DS CV (%) Concentración de almidón en µg/mL Vs.534 0.794 4.411 0. Gráfico representativo de la curva patrón de almidón (monitoría).472 0.559 0.007 0. incluyendo su ecuación de la recta y el r 2 de 0. En la figura 5 se pueda apreciar la representación de los datos en una gráfica. .887 4.359 0.446 0. Gráfico representativo de la curva patrón de almidón (estudiantes).292 3.373 0.442 0.386 0.401 0.360 0.310 0.331 0.284 0.417 0.303 0.014 0.467 0.237 0.465 0.229 0.386 0.467 0.

para luego obtener. una linealización de dichos puntos y poder así predecir qué concentración tendrá una muestra de determinada absorbancia. así como de la linealización de los mismos. con la ecuación de la recta y el r 2 de 0. mediante la ayuda de un programa de hoja de cálculo o CAS. según la ley de Lambert-Beer. empleando métodos colorimétricos (DNS. respecto a los datos de absorbancia solo se cumple desde 0. para la construcción de curvas patrón.1 hasta 1 unidades . se debe tener en cuenta que. En general.9845. A la hora de trabajar con absorbancias. En la práctica se construyeron 3 curvas patrón para distintos propósitos. el comportamiento lineal de los datos de concentración. teniendo un parámetro con el que se relaciona dicha concentración por medio de la curva patrón. a las que se les halla una determinada Absorbancia. como el diámetro. por ejemplo u otro parámetro.En la figura 6 se puede apreciar la representación de los datos en un gráfico. graficándose finalmente cada pareja de puntos en un sistema cartesiano y así lograr obtener una línea recta que relacione dichas concentraciones con el parámetro medido. Lugol). tomando en base las mediciones de absorbancia realizadas a muestras de concentración conocida. se utilizan soluciones de concentración conocida. Bradford. DISCUSIÓN La elaboración de una curva patrón es un paso muy importante para la determinación de las concentraciones de una muestra a analizar.

La segunda curva realizada fue la curva patrón para la cuantificación de proteínas según el método de Bradford. Bradford y yodo-yoduro. se encontraban bastante dispersos. así como de sustratos residuales. . la de almidón. se pudo observar que los datos de las réplicas. el comportamiento de los datos empieza a ser polinómico y por ende la relación 1 a 1 se pierde. cada una correspondiente a un grupo de trabajo del laboratorio. más allá de éste rango.de absorbancia. por lo que se debió proceder a recortar el número de réplicas que se tomaron para efectuar dichas curvas patrón obteniendo al final. por lo que se empleó todo el conjunto de datos (8 réplicas) para hacer las mediciones de la curva patrón. Dicha situación no se presentó en los datos de la tercera curva. con el colorante azul de Coomasie. el cual es un método bastante fiable y preciso para la determinación de dichos azúcares (6). a la calibración incorrecta de los equipos o a fallas de manejo de los grupos de laboratorio. Dicho proceso es un método ampliamente utilizado en microbiología para la detección de sustratos iniciales de un medio específico. el cual se basa en la interacción de ciertos aminoácidos como la Histidina y la arginina. La tercera curva realizada fue la curva patrón para la cuantificación de almidón según el método de Lugol. que permiten hacer cálculos cinéticos para los microorganismos involucrados en un proceso fermentativo. En los datos obtenidos en las 2 primeras practicas correspondientes a las curvas patrón de azúcares reductores y proteínas. CONCLUSIONES - De acuerdo al procedimiento de la práctica se pudo conocer los fundamentos químicos. presentando un coeficiente de variación muy alto (mayor al 5%). Estos resultados tan diferentes pueden deberse a la sensibilidad de los reactivos. con las que se procedió a realizar cada una de las curvas. para dar lugar a una reacción colorimétrica (7). formando un complejo yodoalmidón y rindiendo un color violeta que indica la presencia de almidón positiva (8). el correcto procedimiento y la importancia de las técnicas de DNS. La primera curva realizada fue la curva patrón para la determinación de azúcares reductores por el método de DNS. un mínimo de réplicas aceptable (3 réplicas). el cual se basa en la detección del almidón debido a la interacción del yodo con las hélices del almidón.

72: 248-254. purification and characterization. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar.- Con el uso de las curvas patrón se pudo determinar y se hallaron ecuaciones que nos permiten saber o cuantificar las concentraciones de almidón. An introduction to practical biotechnology. Chem. México.Alfonso Clavijo Diaz. 31. 7. Universidad Nacional de Colombia. 1959. Mediante una previa investigación y en las practicas se identificaron los factores que pueden llegar a interrumpir o dar falsos positivos en las técnicas utilizadas.. Cuarta edición. Anal. Primera edición (2002). 426. Chem. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar.Miller GL. Utilizando el conocimiento aprendido en estas practicas se pueden hallar diferentes ecuaciones para cuantificar diferentes compuestos que están presentes en una gran cantidad de reacciones. Sede Bogota.Burns R. México DF. Anal. Fundamentos de química.Harisha S.Gonzales C. McGraw-Hill. 4.Bradford MM (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Fundamentos de química analítica.Miller GL. Ed. Principles and reactions of protein extraction. año 2006. pg 805 2. 540p. 426. 1959.. Laxmi Publications. 8. proteínas y azucares reductores. 2003 6. . Introducción a los métodos instrumentales de análisis. Madrid (2003) 3. PEARSON. CRC Press. Anal Biochem. 5. - - BIBLIOGRAFÍA 1.Ahmed H. 31. Primera edición. año 2005. 410p.

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