FOSFATASA ALCALINA

PROCEDIMIENTO:

INICIO

Curva de calibracin Curva de calibracin

Tomar 5 tubos y preparar con disoluciones indicadas en la tabla # 1.

Determinacin Km Vm Determinacin Km yy Vm
Tomar 5 tubos y prepara con disoluciones. ver tabla #2 Preparar blanco (0,5 zinc, 5ml glicina y 1 ml fosfato).

Inhibidor
Tomar 5 tubos y prepara con disoluciones. ver tabla #2

A cada tubo. Adicionar 1 ml de sln fosfato 0,5 M y 0,5 ml de sln ZnCl2 0,00060M

Calentar a 37C por 5 minutos igual tratamiento suero fetal Agregar 0,5ml enzima dejar reaccin por 15 minutos a 37C Detener reaccin con 1 ml NaHPo4 0,5M

Dejar en reposo 5 minutos.

Preparar blanco(4ml buffer glicina, 0,5ml sln zinc y 1ml fosfato )

Calentar a 37C por 5 minutos igual tratamiento suero fetal

Agregar 0,5ml enzima dejar reaccin por 15 minutos a 37C

Detener reaccin con 1 ml NaHPo4 0,5M

Seleccionar longitud de onda 410nm. Y registrar datos.

Calcular [PNP] y realice RESULTADOS grafico.

Construir tabla # 4

Construir tabla # 6 y determinar tipo de inhibidor.

FINAL

RESULTADOS: Tabla #1 Curva de calibracin. Tubo Dilucin PNP Buffer de glicina Fosfato de sodio 0,5 M Sln se ZnCl2 M Absorbencia Concentracin PNP mol/L Grafica #1 1 4 mL 0 1 0,5 0,968 2 1/2 2 1 0,5 0,487 3 1/4 2 1 0,5 0,255 4 1/8 2 1 0,5 0,122 5 1/16 3 1 0,5 0,081

1,00E-04 5,00E-05 2,50E-05 1,25E-05 6,25E-06

CURVA DE CALIBRACION
1.2 1 ABSORBANCIA 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.00E+00 5.00E-05 1.00E-04 1.50E-04 CURVA DE CALIBRACION Linear (CURVA DE CALIBRACION) y = 9535.9x + 0.0131 R = 0.9996

CONCENTRACION PNP(mol/litro)

Tabla # 2 Determinacin de parmetros cinticos Km y Vm.

Tubo PNPP sln ZnCl2 0,0006 M

1 4 ml 0,5

2 1/2 0,5

3 1/4 0,5

4 1/8 0,5

5 1/16 0,5 0,396 4,02E-05 1,61E-07

absorbancias 1,263 1,149 1,077 0,809 concentracin PNP mol/L 1,31E-04 1,19E-04 1,12E-04 8,35E-05 Moles de PNP 5,24E-07 4,76E-07 4,48E-07 3,34E-07

Grafica # 2

A B S O R B A N C I A

1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.00E+00

y = 9541.1x + 0.0127 R = 1 Km/Vm Linear (Km/Vm)

5.00E-05

1.00E-04

1.50E-04

concentracion PNP (mol/litro)

Tabla # 3 PARAMETROS CINETICOS

[PNPP] 5,00E-03 2,50E-03 1,25E-03 6,25E-04 3,13E-04

ABSORBANCIA [PNP] 1,263 1,149 1,077 0,809 0,396 1,31E-04 1,19E-04 1,12E-04 8,347E-05 4,016E-05

V0=[PNP]/min 8,73E-06 7,93E-06 7,46E-06 5,56E-06 2,68E-06

1/[PNPP] 1/V0 200 400 800 1600 3194,9 114547,5 126103,4 134048,2 179856,1 373134,2

Grafica # 3 parmetros enzimticos Km y Vm

INVERSOS
400000 350000 300000 250000 1/V0 200000 150000 100000 50000 0 0 1000 2000 (1/[PNPP] M/L) 3000 4000 y = 86.159x + 78789 R = 0.9481 1/V0 Linear (1/V0)

Tabla # 4 determinacin de inhibidor. Absorbancias Concentracin PNP mol/L PNP Mol 0,567 5,81E-05 2,61E-07 0,566 5,80E-05 2,61E-07 0,419 4,26E-05 1,91E-07 0,288 0,181

2,88E-05 1,76E-05 1,29E-07 7,92E-08

Grafica # 4

0.7

Absorbancia VS [PNP]
y = 9527.5x + 0.0134 R = 1

0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1

INHIBIDOR Linear (INHIBIDOR)

0 0.00E+00 2.00E-05 4.00E-05 6.00E-05 8.00E-05

[PNP]

Tabla # 5 parmetros cinticos con inhibidor

[PNPP] 5,00E-03 2,50E-03 1,25E-03 6,25E-04 3,13E-04

ABSORBANCIA 0,567 0,566 0,419 0,288 0,181

[PNP] 5,81E-05 5,80E-05 4,26E-05 2,88E-05 1,76E-05

V0=[PNP]/min 1/[PNPP] 1/V0 3,87E-06 3,86E-06 2,84E-06 1,92E-06 1,17E-06 200 400 800 1600 3194 258397 259067 352112 520833 854700

Grafica # 5 inversos inhibidor Km y Vm

inversos Inhibidor
900000 800000 700000 600000 500000 1/V0 400000 300000 200000 100000 0 0 2000 y = 205.62x + 194304 R = 0.9964

inversos Linear (inversos)

4000

(1/[PNP])

Modelo de clculo:

Concentracin PNP curva de calibracin=

Concentracin PNP parmetros enzimtico e inhibidor = y = 9535,9x + 0,013

x=

Concentracin PNPP = V0= [PNP]/min= 1/[PNPP] = 1/V0 = =200 =114547

Moles de PNP = Moles de PNP Inhibidor =

FOSFATASA ALCALINA Determinar la cintica qumica de la fosfatasa de acuerdo a la reaccin de inhibicin, y a los parmetros de VMAX y Km. OBJETIVO: Identificar y aplicar mtodos diferentes para la determinacin de la actividad enzimtica de la Fosfatasa alcalina; de acuerdo a sus propiedades fsicas y qumicas, Determinar si el inhibidor (fosfato) acta sobre la enzima (fosfatasa); como un inhibidor competitivo o no competitivo.

Nota: el blanco contena fosfato

CONSULTA: Cul es la importancia clnica de la fosfatasa alcalina? R// Las fosfatasas alcalinas son enzimas que se encuentran presentes en casi todos los tejidos del organismo, siendo particularmente alta su presencia en huesos, hgado, placenta, intestinos y rin. Tiene importancia clnica tanto su aumento como su disminucin de los niveles en plasma. Causas ms probables de aumento del nivel de FAL: Enfermedad sea de Paget, obstrucciones hepticas, hepatitis, hepatotoxicidad por medicamentos osteomalacia.

Causas ms probables de disminucin del nivel de FAL: Cretinismo. dficit de vitamina C1, 5,6.

El diagnstico clnico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clnicos y de laboratorio. [2] En este caso, se puede considerar el fosfato como un inhibidor por producto? R// El fosfato se comport como un inhibidor de tipo no competitivo. [1],[3]. Sera posible revertir la inhibicin provocada por el fosfato aumentando la concentracin de PNPP? R// Las velocidades inciales en presencia del inhibidor disminuyen. La diferencia entre las velocidades en presencia del inhibidor se hace cada vez menores con respecto a una reaccin cintica sin l. En pocas palabras, la velocidad se incrementa en cantidades discretas en tanto ms sustrato se adicione. [1]

DISCUSIN: El Inhibidor en esta prctica fue un inhibidor no competitivo la Km permaneci constante (1/[PNPP]) y la velocidad disminuyo de la enzima actuando sola, al actuar bajo el efecto del inhibidor. [3] Consideramos que la prctica de laboratorio fue bien realizada, ya que los porcentajes de error estuvieron en el rango previsto y adems, obtuvimos una sincronizacin a nivel grupal muy buena en el laboratorio; pero se nos presento algunos inconvenientes al determinar el tipo de inhibidor, lo cual consideramos que es por falta de claridad en los conceptos. Se deben utilizar cantidades de sustrato mas altas ya que con las utilizadas no se alcanzo la velocidad mxima, o por lo menos no la logramos identificar en nuestros grficos.

CONCLUSIONES:

La enzima fosfatasa alcalina es de gran importancia en medicina, ya que permite diagnosticar enfermedades, por medio de un examen de sangre para medir el nivel de la misma. Conocer la actividad de un determinado inhibidor es de gran importancia, tanto desde el punto de vista biolgico como mdico. para concluir el tipo de inhibidor utilizado en una reaccin enzimtica se debe tener muy claro los conceptos de inhibicin, ya que se presta para mltiples confusiones.

RESEA BIBLIOGRAFICA [1] El portal de la salud, consultado el 4 de septiembre del 2011 disponible en linea en: www.elportaldelasalud.com/index.php?option=com_content&task=view&i d=123&Itemid=147&limit=1&limitstart=2 [2] Ingeniera de diagnostico clnico, consultado el 4 de septiembre 2011, disponible en lnea en: /www.idcca.com/images/enzimas/fosfatasaalcalina2.pdf [3] LEHNINGER. Albert L, Bioqumica. Las bases moleculares de la estructura y funcin celular, 2aedicin, Ediciones Omega S.A. 1995. pg. 203-209.