CONCEPTOS:

 Dado el pequeño tamaño de los microorganismos, la cantidad de

información que puede obtenerse de un individuo es muy limitada. Por
ello es necesario el estudio de poblaciones, que contienen miles o
millones de individuos. Estas poblaciones se obtienen al hacer crecer
los microorganismos bajo condiciones más o menos bien definidas, se
conocen como cultivos.

 La mezcla de sustancias, naturales, sintéticas o ambas, que permite el

crecimiento y la reproducción de microorganismos o bien que permite
mantener su viabilidad es lo que conocemos como Medio de Cultivo
Medio
de
cultivo

Cultivo
 El agar es un elemento solidificante muy empleado para la
preparación de medios de cultivo. Se licúa completamente a la
temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados.
Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las
bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él.
 AGAR
DISUELTO

AGAR
PRESIPITADO
( SIN DISOLVER)
 También se añaden colorantes que actúan como
indicadores para detectar, por ejemplo, la
formación de ácido o como inhibidores del
crecimiento de unas bacterias y no de otras (el
Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo
en pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de
Genciana se usa como inhibidor ya que impide el
crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram-
positivas).
CONDICIONES GENERALES PARA EL CULTIVO
DE MICROORGANISMOS
El desarrollo adecuado de los microorganismos en
un medio de cultivo se ve afectado por una serie de
factores de gran importancia y que, en algunos
casos, son ajenos por completo al propio medio.

TEMPERATUR
A

NUTRIENTES
Y FACTORES GRADO DE
DE HUMEDAD
CRECIMIENTO

ACIDEZ O PRESIÓN DE
ALCALINIDAD OXÍGENO
 • Un medio de cultivo adecuado ha de contener como mínimo, carbono,
nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas, vitaminas y otras sustancia
inductoras del crecimiento; sustancias adecuadas para ejercer de donantes o
captadores de electrones para las reacciones químicas que tengan lugar.
DISPONIBILIDAD DE • Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los
NUTRIENTES medios es utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente
ADECUADOS
asequible de nitrógeno y carbóno

• Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo

productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en
estado semisólido
• Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y
CONSISTENCIA comodidad, su inconveniente es que muchos microorganismos no se desarrollan
ADECUADA DEL adecuadamente sino a temperaturas inferiores al punto de fusión de este
MEDIO solidificante

• Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de

oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados
sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán
adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio,
PRESENCIA (O los microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas
AUSENCIA) DE parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras los
OXÍGENO Y OTROS anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de
GASES las citadas condiciones.
 MEDIO DE CULTIVO SOLIDO MEDIO DE CULTIVO LIQUIDO

MEDIO DE CULTIVO
SEMI SOLIDO
 • Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen
desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de
CONDICIONES
estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de
ADECUADAS DE agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque
HUMEDAD el medio.

• La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar.
Hay excepciones evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos
LUZ AMBIENTAL

• La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La

mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren
medios más o menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que
no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos
metabólicos normales
pH

• Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y 43ºC. Otros como los
psicrófilos crecen a 0ºC y los temófilos a 80ºC o incluso a temperaturas superiores (hipertemófilos). En
líneas generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor
de 37ºC, y los saprofítos tienen rangos más amplios.
TEMPERATURA

• Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de
vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los
especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el
ESTERILIDAD autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante)
DEL MEDIO
TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

* MEDIOS DE * MEDIOS DE M EDIOS DE MEDIOS DE

CULTIVO CULTIVO CULTIVO ENRIQUECIMIENTO.
GENERALES. SELECTIVOS. DIFERENCIALES. •son aquellos medios
• Permiten el •llevan incorporadas • incorpora en los cuales a un
crecimiento deuna determinadas determinadas medio base se le
gran variedad de sustancias que sustancias que nos añaden determinadas
microorganismos. inhiben el permiten sustancias nutritivas
Pertenecen a esta crecimiento de un diferenciar entre que son necesarias
categoría las microorganismo y dos tipos de para el crecimiento de
infusiones de facilita el microorganismos. un microorganismo
extractos de carne crecimiento del Ej. El agar de sal y exigente.. Por ejemplo
y peptona, una microorganismo manitol: nos el caldo selenito
mezcla de que nos interesa. permite diferenciar cistina o el caldo agar
composición similar Pertenecen a esta en el caso de los sangre.
a la de los líquidos categoría el caldo staphylococos, los
orgánicos, que se lactosa bilis verde que utilizan el
utiliza para muchas brillanteo el agar manitol en su
bacterias patógenas Salmonella- metabolismo de los
Shigella. que no.
ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS DE
CULTIVO
Los medios de cultivo deshidratados se deben
almacenar en envases sellados bajo las
condiciones que señale el fabricante.
Generalmente se almacenan en un lugar fresco
(entre 15 y 25°), con poca humedad y protegidos
de la luz solar directa. Nunca se deben almacenar
cerca de autoclaves, hornos, ni otra fuente dedecalor
Cada lote medio de c
o vapor. ultivo, una
vez preparado, esteriliza
do, revisado
y en su presentación
final, se identifica
mediante una etiqueta
con el nombre del medio
de
cultivo correspondiente,
el número de lote y la fe
cha de caducidad. Se
almacenan en frigorífico
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
REVISIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Es importante comprobar que el medio se comporta correctamente.

Las pruebas que debes hacer para tener seguridad son:

Revisión macroscópica: Se examina el medio a simple vista,

atendiendo a su color, a su opalescencia y transparencia, a la
humedad en las placas ya preparadas y a la posible aparición
de precipitados.
Vigilancia de Ph: Porque la mayoría de los microorganismos se
desarrollan mejor en medios con un pH neutro.
Vigilancia de la esterilidad: Se lleva a cabo incubando a 30 ºC
durante 72 horas una pequeña porción, representativa del lote
de medio preparado, para comprobar que allí no crecen
gérmenes.
Prueba de la eficacia: En una pequeña porción representativa del
medio preparado, se
inocula un microorganismo normalmente el propio fabricante a
conseja el más adecuado y se cultiva. Así se comprueba si en
el medio de cultivo preparado ese microorganismo se
desarrolla correctamente.
MÉTODO DE SIEMBRA POR ESTRÍA
 Se toma una muestra de la población mixta
 Se hacen estrías sobre la superficie de un
medio sólido preparado en una placa Petrí.
Conforme se van haciendo estrías en zigzag
con el asa, cada vez se van depositando en la
superficie del medio menos microorganismos.
 Se flamea el asa, se toca en la región donde se
han realizado las últimas estrías y se continúa
la siembra con la misma técnica, en la
superficie de medio sin sembrar aún.
Repitiendo este proceso varias veces se logra
separar células individuales.
 Se incuba a temperatura adeucuada
MÉTODO DE SIEMBRA EN PROFUNDIDAD

A partir de las diluciones seriadas preparadas

tomamos 1mL de cada una de ellas y lo
depositamos en distintas placas de Petri
vacías y estériles.
 Después añadimos un determinado volumen
del medio de cultivo (10-20 mL) que tenemos
en un baño María para evitar que se
solidifique.
 Dejamos solidificar y luego incubamos en la
estufa durante 24 horas a 37ºC.
 Transcurrido el tiempo realizamos el recuento
 MÉTODO DE SIEMBRA EN SUPERFICIE

 El medio de cultivo ya está solidificado en

la placa.
 Preparamos las diluciones seriadas y
añadimos a cada placa 1 mL
 Para extender sobre la superficie de la
placa la muestra se utiliza un asa de vidrio
 RECUENTO
MICROBIANO
Para el recuento de microorganismos
presentes en una muestra de agua,
suelo, aire, alimento, cultivos, entre
otros, existen diferentes métodos o
técnicas: Algunas técnicas son directas
y permiten un recuento de todas las células,
tanto las vivas como las muertas.
Las medidas directas incluyen los recuentos directos al
microscopio o recuento electrónico, el recuento en
placa, o
el cálculo del número más probable (NMP).
Otras son medidas indirectas y miden una propiedad
de la
masa de las células como son la turbidez, el peso seco,
o una
 RECUENTOS DIRECTOS AL
MICROSCOPIO
Se basa en colocar un volumen determinado de células y
realizar el conteo utilizando un microscopio. Para ello se
utiliza la cámara de recuento de Petroff-Hauser o de
Neubauer: consistente en un portaobjetos con una
excavación de 0.02 mm de profundidad en un área de 1
milímetro cuadrado, con una rejilla dividida en 25 cuadrados
grandes los cuales a su vez se subdividen en 16 cuadrados
de 4X4 o sea que la muestra se distribuye en 400 celdillas.
El recuento celular se calcula así: n x 25 x 50 x 1000 =
concentración de células/ml
RECUENTOS EN PLACA

 Generalmente la muestra original se diluye para que el

número de colonias no exceda las 300 unidades

 Cuando la muestra se diluye el cálculo del resultado se

realiza contando las colonias en aquellas placas que
tengan entre 30 y 300, se promedia y se multiplica por el
factor de dilución; Los resultados se expresan en
unidades formadoras de colonias (UFC), el valor de
UFC es un valor que expresa el número relativo de
microorganismos de un taxón determinado en un
volumen de un metro cúbico de muestra.
 PARA EL RECUENTO DE
COLONIAS SE EMPLEAN
EQUIPOS QUE CONSISTE
EN UNA PANTALLA
ILUMINADA LA CUAL
POSEE UNA GRAN LENTE
DE AUMENTO; PUEDEN
SER: CONTADORES DE
COLONIAS EN LOS
CUALES LA CAJA DE PETRI
SE AJUSTA EN UNA
PLATAFORMA Y SE
ILUMINA POR DEBAJO Y AL
MISMO TIEMPO LA LENTE
AUMENTA 1.5 VECES EL
CUENTA COLONIAS
TAMAÑO DEL OBJETO.
RECUENTOS EN FILTROS DE
MEMBRANA
Utilizados cuando el número de bacterias es bajo. Son
filtros con un poro de 0,45 mm que retienen las bacterias.
Se filtra un volumen dado y se coloca el filtro sobre una
placa del medio de cultivo apropiado.
RECUENTO DE NUMERO MAS PROBABLE
Basado en un método estadístico. Dependiendo del
número de m.o que sospechamos que puede tener
la muestra existen distintas tablas de trabajo de
números más probables. Se utiliza sobre todo en la
industria, para el análisis de agua.