PREPARACIN DE MEDIO DE CULTIVO Y SIEMBRA

I. INTRODUCCION

Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de

microrganismos observar su crecimiento en sustancias alimenticias
artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el
que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el
crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado
ms de 10.000 medios de cultivo diferentes. Para que las bacterias
crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir
una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y
presin de oxgeno adecuado, as como un grado correcto de acidez o
alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y
factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo
microorganismo contaminante. La mayora de las bacterias patgenas
requieren nutrientes complejos similares en composicin a los lquidos
orgnicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de
cultivo es una infusin de extractos de carne y Peptona al queso
aadirn otros ingredientes. El agar es un elemento solidificarte muy
empleado para la preparacin de medios de cultivo. Se lica
completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al
enfriarse a 40 grados. Con mnimas excepciones no tiene efecto sobre
el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que
crecen en l. La Gelatina es otro agente solidificarte pero se emplea
mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuacin. En
los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales
de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre
completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos
motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y
para detectar reacciones de fermentacin de los microorganismos que
ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completase aaden para
promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.
3.2 Tipos bsicos de medios de cultivo

Atendiendo a su estado fsico:

Lquidos
Semislidos
Slidos Atendiendo a su utilidad prctica:
Medios para aislamientos primarios: Para usos generales: no
selectivos, para cultivo de una amplia variedad de organismos
difciles de hacer crecer. A menudo estn enriquecidos con
materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV,
glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de las
bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc.)
Selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) se
aaden sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos
de bacterias, permitiendo a la vez el crecimiento de otras.
Variando la sustancia aadida, se vara el tipo y grado de
selectividad (Mac Conkey, Kanamicina-Vancomicina)
Enriquecidos: ralentizan/suprimen el crecimiento de la flora
competitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado
(Selenito, medio con Vitamina K).
Para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas
especiales que satisfacen requerimientos de grupos especficos
de bacterias, ayudando a su identificacin (Lowenstein).
II. OBJETIVOS

Prepara el medio de cultivo estril

Adiestrar al estudiante con el mtodo de recuento en placa.
Determinar el nmero de microorganismos viables presentes en una
muestra de alimento
III. REVISION LITERARIA

2.3 Condiciones generales para el cultivo de microorganismos

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo

se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en
algunos casos, son ajenos por completo al propio medio.

Disponibilidad de nutrientes adecuados

Un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica ha

de contener, como mnimo, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales
inorgnicas. En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y
otra sustancia inductoras del crecimiento. Siempre han de estar
presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o
captadores de electrones para las reacciones qumicas que tengan
lugar. Todas estas sustancias se suministraban originalmente en
forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de
levadura. Sin embargo, la preparacin de estas sustancias para su
aplicacin a los medios de cultivo provocaba la prdida de los factores
nutritivos lbiles.

Actualmente, la forma ms extendida de aportar estas sustancias a

los medios es utilizar peptona que, adems, representa una fuente
fcilmente asequible de nitrgeno y carbn ya que la mayora de los
microorganismos, que no suelen utilizar directamente las protenas
naturales, tienen capacidad de atacar los aminocidos y otros
compuestos ms simples de nitrgeno presentes en la peptona.
Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas especficas por lo que
se aade a muchos medias sustancias como suero, sangre, lquido
asctico, etc.
 Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales
minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o
potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de
naturaleza vitamnica. Muy a menudo se aaden al medio de cultivo
ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas actividades
metablicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores
selectivos de ciertos microorganismos.

Consistencia adecuada del medio

Partiendo de un medio lquido podemos modificar su consistencia

aadiendo productos como albmina, gelatina o agar, con lo que
obtendramos medios en estado semislido o slido. Los medios
solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos
microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas
inferiores al punto de fusin de este slidificante y de que otros tienen
la capacidad de licuarla. Actualmente los medios slidos son de uso
universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay tambin gran
cantidad de medios lquidos cuyo uso est ampliamente extendido en
el laboratorio.

Presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases

Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera

con tensin de oxgeno normal. Algunas pueden obtener el oxgeno
directamente de variados

Sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos slo

se desarrollarn adecuadamente en una atmsfera sin oxgeno
ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos
microaerfilos crecen mejor en condiciones atmosfricas
parcialmente anaerobias (tensin de oxgeno muy reducida),
mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo
capaz de adaptarse a cualquiera delas citadas condiciones.
 condiciones adecuadas de humedad

Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la atmsfera,

es imprescindible para un buen desarrollo de las clulas vegetativas
microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas
condiciones mnimas en las estufas de cultivo a 35-
37C proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la
humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar as que
se deseque el medio.

Luz ambiental La mayora de los microorganismos crecen

mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay
excepciones evidentes como sera el caso de los
microorganismos fotosintticos.
PH La concentracin de iones hidrgeno es muy importante
para el crecimiento delos microorganismos. La mayora de ellos
se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los
hay que requieren medios ms o menos cidos. No se debe
olvidar que la presencia de cidos o bases en cantidades que
no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo
inhibirlo o incluso alterar sus procesos metablicos normales.
Temperatura

Los microorganismos mes filos crecen de forma ptima a

temperaturas entre 15y 43C. Otros como los psicrfilos crecen a 0C
y las termfilas a 80C o incluso a temperaturas superiores
(hipertemfilos). En lneas generales, los patgenos humanos crecen
en rangos de temperatura mucho ms cortos, alrededor de 37C, y los
saprofitos tienen rangos ms amplios.

Esterilidad del medio

Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estriles para

evitar la aparicin de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o
incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los
especmenes inoculados en dichos medios.
El sistema clsico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave
(que utiliza vapor de agua a presin como agente esterilizante)

2.4 Mtodos de preparacin de medios

Preparacin de un medio solido en placa:

1. Pesar la cantidad de medio (si el preparado contiene agar debemos

aadirlo a una concentracin de 15g/l) y rehidratarlo agua destilado en
una botella

2. Autoclavar la botella sin cerrar totalmente el tapn de rosca

3. Sacar del autoclave, enroscar del todo el tapn e introducir la botella

enun bao a 40c al menos durante 30 minutos.

4. Distribuir el medio en las placas de petri que estn estriles dentro d

e unacampana de flujo laminar o en las proximidades del mechero,
flameando bien la boca de la botella para evitar las contaminaciones.

5. Dejar que el medio solifique.

Preparacin de medio solido en tubo (slant)

1. Pesar el medio que contenga agar y rehidratar con agua destilada e

n un matraz

2. Fundir el medio en un horno microondas o en una placa caliente.

El medio debe hervir hasta que se vuelve transparente.

3. Distribuir rpidamente el medio en los tubos antes de que comience

asolidificar para ello se empleara una pipeta y los tubos no se llenaran
ms de un tercio de su volumen.

4. Autoclavar

5. Sacar de la autoclave e inclinar los tubos sobre la poyata para obten

er tubos con medio de slant.
 Preparacin de medio liquido en tubo (caldo)

1. Pesar y rehidratar el medio

2. Distribuirlo con una pipeta en los tubos (sin llenarlos ms de 1/3 de

suvolumen)

3. Autoclavar

4. Sacar de la autoclave y dejar enfriar

5. Todos los medios se guardan en nevera a 4c

2.5 Realizacin de la siembra

a) Siembra en medio lquido Se introduce el asa de siembra en el tubo

con cultivo crecido y se toma un inoculo que se lleva al tubo estril con
medio liquido (agitndolo en el seno del medio)

b) Siembra en placa Dividida la placa en tres partes, sembrar en cada

tercio el inoculo tomado de los cultivos crecidos .se introduce el asa de
siembra en el tubo con cultivo crecido y se toma una gota de inoculo
que se extiende sobre el agar de la placa deslizando el asa
suavemente por su superficie en zig-zag.

c) Siembra en agar inclinado Se introduce el asa de siembra en el tubo

con cultivo crecido y se toma un inoculo que se extiende sobre el
agar inclinado deslizando el asa suavemente por su superficie en zig-
zag. En el caso del medio TSI, la siembra se deber realizar tanto en
superficie (aerobiocis) como en la poblacin del agar (anaerobiosis).

2.6 Incubacin

De los medios sembrados a 37c hasta que haya habido crecimiento

bacteriano.
IV. MATERIALES Y METODOS
4.1 MATERIALES
BIOLOGICO:
Muestra de agua estril
Jugo de papaya
Suero fisiolgico
Alcohol 70%

DE
LABORATORIO:
Placas Petri esteriles
Pipetas
Mechero
Tubos de ensayo
Gradilla
Frascos
Pizeta

MEDIOS DE CULTIVO:

Agar cuenta grmenes (PCA)

Solucin salina fisiolgica peptonada
(SSFP)
Agar agar
Glucose wassertreti
Agar mieller hintar

EQUIPOS
Contador Quebeck
Incubadora a 35-37C
4.2 PROCEDIMIENTO

La muestra debe de llegar al laboratorio convenientemente identificada

cumpliendo los requisitos de muestreo.

A) SIEMBRA POR INCORPORACION

PRIMERO:

Desinfectar el lugar de trabajo con alcohol yodado.

Identificar la muestra con los siguientes datos. Nombre y/o nmero del
lote, dilucin, volumen sembrado, tcnica de siembra, fecha, operador,
etc.
Segn la carga microbiana esperada elegir las diluciones a Sembrar.
Realizar no menos de tres diluciones consecutivas: 1:10, 1:100,
1.1000. Cada vez que se prepara una dilucin cargar y descargar l
pipeta cuando menos tres veces.
depositar 1mL de cada dilucin en placas estriles, por duplicado.
Adicionar a cada placa 15 a 20 ml del medio de cultivo a emplear (por
ejemplo: PCA, para bacterias aerobias mes filas viables, u otro
medio de cultivo de acuerdo al microorganismo que se desee contar),
previamente licuado y enfriado a 45C
Mezclar cuidadosamente el medio y el inoculo mediante una
combinacin de movimientos giratorios y de vaivn, sobre la superficie
de la mesa de trabajo. Deben tomarse precauciones para que durante
 estos movimientos, el agar no toque la tapa de la placa de Petri y dejar
solidificar
Despus de solidificado el agar, incubar las placas a 37C durante 24
a 48 horas.
Para el recuento, escoger las placas en las que han desarrollado entre
30 y 300 u.f.c.
Para calcular el nmero de bacterias viables (U.F.C...) por mililitro (ml)
o grano (g) de muestra original, se produce de la siguiente manera:

a) Seleccionar 2 placas correspondientes a una dilucin que

contenga entre 30 y 300 U.F.C.
Ejemplo: dilucin 102
Placa 1:85 U.F.C
Placa 2:89 U.F.C
Si este fuere el caso sacar la media aritmtica de los dos recuentos y
multiplicar por el inverso del factor de dilucin. Reportar el resultado
como numero de u.f.c por gramo o mililitro segn sea el caso.
Ejemplo: dilucin 102
Placa 1=85 U.F.C
Placa 2=89 U.F.C
Promedio =87 U.F.C por inverso del factor de disolucin ( 102)
V. RESULTADOS

Preparacin de la muestra

1 ml 1 ml

9 ml de H2O 9 ml de H2O 9 ml de H2O

ESTERIL ESTERIL ESTERIL

D= 10
VI. DISCUSIN

- Se investigaron previamente para la realizacin de esta prctica conceptos

bsicos para la preparacin de medios de cultivo, as como los tipos de
esterilizacin para los mismos, que en este caso se utiliz un mtodo fsico:
presin a vapor, es decir la autoclave que posee los requisitos indispensables
(temperatura y tiempo de exposicin) para eliminar los microorganismos que
pudieran haber quedado en el medio.
- La importancia de este laboratorio no solo se basa en la observacin y
aprendizaje de la Esterilizacin, desinfeccin, manipulacin e identificacin de
materiales, sino de comprender la importancia de los microorganismos y
cmo influyen directamente en nuestras vidas. Los grandes hombres de
ciencia que se aventuraron a descubrir este mundo oculto, nos
proporcionaron todos sus descubrimientos, por los cuales dedicaron
prcticamente toda su vida y que hoy con instrumentos y tcnicas modernas
podemos observar, practicar y realizar en los laboratorios.
- Despus de 10 minutos se revis que se hubieran solidificado las muestras
para despus proceder a taparlas y envolverlas en papel (volteadas boca
abajo) para que si se evaporaba el lquido lo hiciera hacia la misma muestra
y de esta manera no quedaran gotas del lquido sobre la tapa ya que sera
despus esto una posible contaminacin cuando se quisiera sembrar una
muestra y para evitar la deshidratacin.
- Otro punto importante a tomar en cuenta, es que cada lote de medio de cultivo
preparado debe pasar por un riguroso proceso de control de calidad, en donde
se determinan sus propiedades fisicoqumicas (apariencia, pH, etc.) y
microbiolgicas (esterilidad y promocin de crecimiento) verificando que
cumplan con los requisitos de calidad establecidos y por ende demostrar que
son aptos para su uso.
VII. CONCLUSIONES
- Los medios de cultivo estn conformados por nutrientes favorables para
la proliferacin de microorganismos.
- Tenemos que esterilizar los materiales a utilizar para el cultivo de
microorganismos para evitar la contaminacin.
- Se observ que de acuerdo al tipo de bacteria que se requiera sembrar,
ser el tipo de medio de cultivo, esto, ya que cada bacteria requiere cierto
tipo de nutrientes para subsistir y formar sus colonias, adems de que
cierto tipo de medios de cultivo, nos pueden mostrar de acuerdo a su
composicin ciertas caractersticas que presentan determinado tipo de
bacterias, ya sea por su pH y que este sea indicado por los indicadores de
los medios o por que reaccione con ciertos componentes del medio
creando colores o formas

VIII. RECOMENDACIONES
- Seguir paso a paso los procedimientos que se al realizar la prctica.
- Trabajar con la indumentaria apropiada, guardapolvo, guantes, mascarilla.
- Esterilizar de forma adecuada los instrumentos que se utilizarn en la
prctica, como tambin manipular de manera correcta la autoclave.
- En el momento de la siembra hacerlo uniformemente en la placa Petri
IX. BIBLIOGRAFIA

http://www.ugr.es/~pomif/pom-bac/pb-iv/pb-iv-2-
http://gsdl.bvs.sld.cu/cgi-bin/library
slideshare.net/leo-canis-lupus/mtodos-de-siembra-y-aislamiento
http://www.academia.edu/9286004/INFORME_7_CULTIVO_DE_MICROOR
GANISMOS
http://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnologia/
practicoIII.pdf
X. ANEXOS