PRÁCTICA No.

TÉCNICAS DE SEPARACIÓN DE BIOMOLECULAS.

CROMATOGRAFÍA EN PAPEL Y CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA

1. OBJETIVO
Reconocer diferentes técnicas de cromatografía como válidas para separar aminoácidos
y reconocer la presencia de compuestos con el uso de patrones.

2. INTRODUCCIÓN.

Las técnicas cromatográficas se emplean para separar los componentes individuales de una
mezcla y, en ciertos casos, para identificar un compuesto comparando su comportamiento
cromatográfico con el de sustancias conocidas empleadas como patrón o alguna propiedad
fisicoquímica del compuesto.
La base de la técnica es que cuando un determinado soluto interactúa con dos fases, una de
ellas llamada fase estacionaria (habitualmente sólida o líquida) y la otra llamada fase móvil
(habitualmente líquida o gas), el soluto experimenta una serie de procesos (adsorción en la
fase estacionaria, solubilización en cada fase, arrastre por la fase móvil, etc.) que, en último
extremo, llevan a que el soluto se reparta entre ambas fases. En el equilibrio, la relación
entre las concentraciones del soluto entre ambas fases es constante, y se denomina, a este
tipo de experiencia Cromatografía de reparto. En una mezcla, cada componente tendrá una
distribución diferente, característica y reproducible en condiciones experimentales iguales.
En este caso la separación se considera buena. Este reparto depende de la naturaleza de las
fases, así como de las condiciones de la cromatografía.
2.1. Cromatografía en papel
Una de las técnicas cromatograficas más sencillas es la que se realiza sobre papel. Se basa
el método en la propiedad que tienen ciertos compuestos de ser solubles, aunque en
magnitud diferente, en dos o más solventes que son inmiscibles entre si y que se hallan en
contacto. Cuando se permite que pase un tiempo suficiente para alcanzar el equilibrio, el
compuesto se encontrara distribuido entre las dos fases liquidas (fase estacionaria y fase
móvil), de un modo característico. El reparto (o distribución), que se define como la
relación que existe ente la concentración A del compuesto en el solvente A y su
concentración B en el solvente B, se expresaría así:

K = A / B

Como puede deducirse, K resulta característica para un determinado compuesto químico,

un sistema de solvente y todo otro conjunto de condiciones, dentro de las cuales se incluyen
las ambientales, ya que su valor quedara influenciado por cualquier factor que afecte la
solubilidad en cada uno de los solventes utilizados. Algunos de estos factores más
importantes serían: la temperatura, la presión atmosférica y la presencia de otros solutos.
 La cromatografía en papel puede realizarse en forma ascendente o descendentey en forma
circular (cromatografía circular), en la que un papel de filtro se coloca horizontalmente y
así se evita que la fase móvil corra en contra de la gravedad, la fase estacionaria o fija, es
agua adsorbida superficialmente, en este caso de naturaleza polar (iones OH - y H+), se
localizan sobre el papel de filtro, así, las sustancias polares correrán menos, pues se
adsorben más fuertemente a los iones del papel. Luego se coloca el papel de filtro sobre una
caja de Petri que contenga el solvente o mezcla de solventes de naturaleza apolar o menos
polar que el agua, se le adiciona un sistema capilar que posibilite que el solvente alcance el
papel de filtro, se tapa y se deja que la fase móvil alcance el borde del papel

Este procedimiento es muy simple y no requiere de equipos especiales, por lo que resulta
ideal para que personas poco expertas obtengan resultados demostrativos. Otra ventaja es
que si se mantienen las condiciones estables, es decir si se emplea el mismo tipo de papel,
los mismos solventes y las mismas condiciones ambientales, la movilidad de una mancha
correspondiente a una sustancia pura es constante y por lo tanto es posible identificar esa
mancha por comparación directa con una mancha patrón. De otra forma, en ausencia de
patrones, es posible la identificación de la sustancia con base en las propiedades
fisicoquímicas (de la sustancia) y a partir del llamado Rf (factor de retención. El Rf es la
relación que existe entre la distancia recorrida por la mancha respecto de la recorrida por el
solvente.

Rf = Distancia de la mancha / Distancia del solvente

2.2. Cromatografia en capa fina

Otra de las técnicas cromatográficas sencillas es la que se realiza en capa fina, llamada así
porque la fase estacionaria es un solvente polar, normalmente H 2O adsorbido en una capa
fina de un material poroso inerte(gel de sílice, alúmina, etc.) similar a la fase inerte en
Cromatografía en papel. La fase móvil es una mezcla de disolventes en diferentes
proporciones menos polar que el agua adsorbido en el material poroso, que emigra por la
capa fina, debido al fenómeno de capilaridad. En su movimiento, arrastra en mayor o
menor proporción al componente o mezcla de componentes de una mezcla en función de
sus mayores o menores coeficientes de reparto.
De manera similar a la Cromatografía en papel, se puede determinar el denominado Rf.
Las sustancias más insolubles en la fase móvil tendrán, un Rf próximo a cero, mientras las
más solubles en esta fase se acercarán a uno.
La cromatografía en capa fina se puede emplear para separar distintos grupos de
biomoléculas. En esta práctica, emplearemos aminoácidos, pero podrían emplearse los
distintos fosfolípidos obtenidos de la yema de huevo, o azucares presentes en un alimento,
componente de la clorofila, entre otros. Lógicamente, en cada caso cambiaría la fase móvil
empleada. Finalmente para reconocer las sustancias separadas, se emplean compuestos
reveladores. Para el reconocimiento de aminoácidos, la placa se revelará mediante la acción
de la ninhidrina.

3. PRELABORATORIO
1. Qué se entiende por cromatografía
2. Cuántas clases de cromatografía hay.
3. ¿Qué es el factor de retención?
4. En cromatografía cuál es la fase estacionaria y cuál es la fase móvil
5. ¿Qué se entiende por cromatografía en placa fina bidimensional?

4. MATERIALES Y REACTIVOS
4.1.Cromatografía en papel
Estufa eléctrica, capilares de vidrio, lápiz Nº 2, papel Whatman N° 1, vasos de precipitados,
pipeta, frasco revelador (ninhidrina), regla, caja de Petri.
Muestras de aminoácidos al 1%, ninhidrina (1mg/ml en acetona), fase móvil: fenol saturado
en agua.
4.2. Cromatografia en capa fina

Placa fina de sílice, micropipeta de hasta 10 ml, frasco revelador (ninhidrina), cubeta
cromatográfica, pinzas de madera, lápiz nº 2, regla de 20 cm.
Muestras de aminoácidos al 1%, ninhidrina (1mg/ml en acetona), fase móvil: n-
butanol-acetona- acético-agua (35/35/20/10).Me están escuchando?

5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
5.1. Cromatografía en papel
Para la realización de esta experiencia Ud. debe utilizar guantes quirúrgicos o de
laboratorio de látex, porque en sus manos se encuentran presentes diversos aminoácidos y
contaminarían todo el material.
Capilar de Papel
Leucina Glicina

Solución Ácido
problema Aspartico

Colóquese los guantes. En el papel Whatman N° 1 trazar dos líneas con lápiz tal como se
ilustra en la figura. Realizar un orificio central y proceda a aplicar lo más próximo a este
orificio y en forma de gota las soluciones de aminoácidos y la solución problema de
acuerdo a la distribución que orienta la figura o la que determine el docente.
Coloque el capilar de papel dentro del orifico y ubíquelo junto con el papel circular sobre la
placa de Petri que contiene solvente apolar. Tape la placa de Petri, cuidando que el capilar
no quede doblado y deje correr el solvente hasta el borde del papel.
Extraiga el papel de filtro de la caja de Petri y séquelo por exposición al calor generado por
la estufa eléctrica. Tenga cuidado de no quemar el papel.
Rocíe el papel seco con ninhidrina y séquelo nuevamente en la estufa hasta que aparezcan
manchas.
a.Represente en el dibujo siguiente el resultado obtenido y calcule el valor de Rf de cada
uno de los aminoácidos conocidos, así como el de o los que se encuentran en la solución
desconocida.

Suponga el siguiente resultado y que el solvente se desplazó hasta el borde del papel.

Cromatografía circular en papel Calcule de los valores de Rf

b. Explique la razón por la cual se produce esta separación de los aminoácidos?

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c. Que conclusiones puede deducir Ud. sobre la solución desconocida?

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5.2. Cromatografía en capa fina

Coloque aproximadamente 25 ml de fase móvil en la cubeta y ciérrela, para saturar su
atmósfera. La cromatografía se efectuará en esa cubeta cerrada.
Trace con un lápiz, sin apretar demasiado para no dañar la placa, una línea horizontal a 1,5
cm del borde inferior de la placa. Marcar, sobre ella, 4 puntos (3 puntos de muestras
conocidas: alanina, acido glutamico e histidina y un punto de muestra problema) con igual
separación entre sí, Colocar las placas de sílice para cromatografía sobre una estufa para
que se sequen de la humedad ambiental. Marque con una línea el límite superior de
desplazamiento del solvente a 1 cm del borde. Aplicar sobre los puntos 0,5 mL de cada
aminoácido con la micro pipeta. Es importante que las gotas se extiendan lo menos posible,
dejar secar las gotas. Volver a colocar la misma cantidad de muestra en cada uno de los
puntos para concentrar las muestras (repetirlo 5 veces). Anotar las posiciones en que se han
colocado las muestras de diferentes aminoácidos la muestra problema.

Toma de muestras en Aplicación de muestras en la placa

los tubos etiquetados

Coloque la placa en la cubeta, cuidando de que el nivel de disolvente quede por debajo de
la línea de aplicación de las muestras. Cierre y espere entre 30 y 45 minutos. La fase móvil,
en todo caso, no debe llegar al extremo superior de la placa. En ese tiempo, realizar otros
apartados de la práctica.
Saque la placa, marque en un borde el nivel alcanzado por la fase móvil, séquela en la
estufa (si huele algo a disolvente orgánico, elimine los últimos residuos con aire caliente
del secador de cabello) y rocíela con el revelador (ninhidrina). Coloque la placa en la estufa
unos 3 min, a 105 ºC, o hasta la aparición de manchas.
a. Observe las manchas aparecidas. Represente en el dibujo siguiente el resultado obtenido
y calcule el valor de Rf de cada uno de los aminoácidos conocidos, así como el del
aminoácido que se encuentran en la solución desconocida.

Tenga en cuenta el siguiente ejemplo, valido también para la cromatografía circular en

papel:

El factor de Retención (Rf) = Distancia recorrida por cada muestra

Distancia recorrida por el disolvente
Suponga el siguiente resultado:

b. Identifique el nombre de cada aminoácido y las características de cada uno de ellos.

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c. Con una fase móvil más polar, la separación para cada aminoácido o la muestra
problema ¿sería mejor o peor? ¿Por qué?
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d. Describa la reacción de ninhidrina con los aminoácidos, y los colores que se

presume obtener.
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e. ¿Se podrían diferenciar, por una cromatografía de este tipo, los 20 aminoácidos
proteicos? ¿Qué ventajas tendría utilizar la Cromatografia bidimensional?
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5. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

Grupo de trabajo N°. _______________________________________________________

Integrantes ______________________________________________________________
Fecha de práctica__________________________________________________________
Fecha de entrega de informe_________________________________________________

Consulte el siguiente link:https://www.youtube.com/watch?v=3xHzSXkRslg