RESUMEN SOBRE CROMATOGRAFÍA EN PAPEL

ESPOL-ECUADOR GRUPO A
Luis Carreño Torres
Ana Murillo Abril
Laila Santana

CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
La cromatografía en papel es la técnica de separación e identificación de sustancias químicas
en la cual la fase estacionaria es el agua absorbida y adsorbida que hay en el papel (papel filtro
hecho de celulosa) y el soporte es el mismo papel. La fase móvil es una solución que consiste
en un disolvente o de una mezcla de varios líquidos que contiene agua.

La palabra cromatografía proviene de kromatos, color y graphos, escrito. El nombre de la

técnica deriva de los primeros ensayos en los que se separaron pigmentos de plantas como la
clorofila, los cuales tienen colores definidos Estos primeros pasos los dio el botánico ruso de
origen italiano Mijail Tswett cuando separo diversos pigmentos de las plantas.

Fundamento de la cromatografía en papel

En todo proceso cromatográfico la fase móvil es la que provoca un movimiento de las

distintas especies para que abandonen el medio soporte (papel), y la fase estacionaria la
que suministra el efecto retardador, selectivo para cada componente, que condiciona que
cada uno de ellos se desplace con distinta velocidad.

La movilidad de los componentes de la mezcla a separar depende de la afinidad química o

propiedades similares entre estos componentes y cada una de las fases del sistema
cromatográfico. Si uno de los componentes de la mezcla presenta propiedades químicas
muy similares a la fase móvil tendrá gran movilidad, es decir, el efecto de retención que
provocaría la fase estacionaria sería nulo. Lo contrario sucedería con un componente de la
mezcla que tenga una gran afinidad con la fase estacionaria.

Por lo tanto, la técnica se basa en la velocidad de desplazamiento diferencial de los solutos

al ser arrastrados por una fase móvil sobre una estacionaria. Esta diferencia será la que
nos permita identificar cuantos componentes tiene una disolución y cómo separarlos.

Método de la cromatografía en papel

Sobre el papel (papel filtro hecho de celulosa) se seca una gota de extracto de la muestra
(mezcla). Para evitar evaporación se cuelga el papel dentro de una cámara cromatográfica
en forma tal que la mancha pueda ser irrigada con la fase móvil, tanto hacia abajo por
gravedad, hacia arriba u horizontalmente por capilaridad (Imagen 1). Cuando la fase móvil
ha saturado el papel hasta una distancia predeterminada para lograr la separación, se saca
el papel de la cámara y se desarrolla el cromatograma por aspersión de sustancias, que lo
hagan visible (reactivos reveladores). En el caso de sustancias coloridas, tales como
colorantes para alimentos, la separación puede ser evidente sin el uso de agentes
reveladores. Las sustancias no polares también se pueden separar cubriendo el papel con
compuestos no polares y utilizando disolventes polares como fase móvil.

A B

Imagen 1. Cromatografía ascendente(A) y

descendente (B)

Las cámaras cromatográficas son de

varios tipos, de forma cilíndrica, de unos 30-40 cm de altura deben cerrar perfectamente,
para evitar la evaporación del disolvente que satura la atmósfera, se trabaja con papel
cromatográfico (IMAGEN 2).

Constante Rf

Los contornos de las manchas así «reveladas» se señalan con lápiz y constituyen la
referencia para la identificación de las sustancias aisladas. Como medida en cromatografía
sobre papel se emplea el Rf (del inglés: Retention factor).

Se define como el cociente de dividir el recorrido de la sustancia por el del disolvente, o

sea la distancia que media desde el origen hasta el centro de la mancha (X) dividida por la
distancia que media desde el origen hasta el frente del disolvente (S). Rf = X/S (imagen 3).

Imagen 3. Medición del factor de

retención
Fuerzas que actúan en la cromatografía

Cuando el disolvente avanza sobre las manchas de las sustancias, comienzan a actuar dos
tipos de fuerzas opuestas: unas que arrastran y otras que retardan. Las fuerzas
propulsoras actúan apartando las sustancias de su punto de origen y despasándolas en
dirección del flujo de origen. Las fuerzas retardantes tratan de impedir el movimiento de
las sustancias, llevándolas fuera del disolvente que fluye y hacia atrás en el papel. La
distancia recorrida por cada sustancia a partir del origen, en un tiempo dado, es la
resultante de estas dos clases de fuerzas.

Fuerzas propulsoras

Cuando se realiza un cromatograma en papel, las fuerzas propulsoras más importantes

son: el flujo de disolvente y la solubilidad de cada sustancia en le disolvente.

Flujo del disolvente

Si la sustancia sometida a la cromatografía fuera completa e instantáneamente soluble en
el disolvente que avanza, por ejemplo agua y azúcar, y no actuaran fuerzas de retardo la
sustancia ascenderá desde el origen hasta donde llega el diluyente. En cambio si la
sustancia fuera completamente insoluble en el disolvente en movimiento no se movería
del origen. La corriente del disolvente es la misma para todas las sustancias de la mancha,
así pues, si el disolvente fuese capaz de disolver instantánea y completamente todas las
sustancias, estas avanzarían juntas hasta el final de la trayectoria del disolvente y
terminaríamos donde empezamos con todas las sustancias juntas.

Solubilidad
Una fuerza diferencial es, en efecto, la solubilidad. Pocas son las sustancias que ofrecen la
misma solubilidad en cualquier disolvente. La particular solubilidad de una sustancia en la
corriente del disolvente es una fuerza propulsora que tiende a desplazarla, manteniéndola
en movimiento a lo largo del papel.

Fuerzas retardantes

Hay también dos fuerzas retardantes principales: la adsorción y el reparto.

Adsorción
La celulosa de la que está hecho el papel de filtro, posee propiedades adsorbentes. Las
sustancias depositadas en el papel, en cromatografía, pueden ser más o menos adsorbidas
en el papel. La adsorción es otra de las fuerzas diferenciales, esto significa que unas
sustancias son adsorbidas más que otras y, por consiguiente, la liberación de las sustancias
de las manchas variará de una sustancia a otra. Esto contribuye de nuevo a la separación.
Mientras que se va realizando el cromatograma, las sustancias más fuertemente
adsorbidas se van quedando atrás, mientras que las adsorbidas con menos fuerza avanzan
hacia el frente.

Reparto
La cromatografía se basa, en una medida considerable, en la presencia de dos fases
liquidas individualizadas. Una de ellas es la corriente del disolvente circulando por el papel
de filtro. La otra es la fase acuosa contenida en el mismo papel de filtro. Una hoja de papel
de filtro aparentemente seca contiene entre un 6 y 12% de agua firmemente adherida a la
celulosa. Aquí es donde entra en función el reparto. Cuando una sustancia que es soluble
en dos disolventes no mezclados es expuesta al mismo tiempo a ambos, se repartirá entre
ellos. La cantidad que se encuentre en cada disolvente dependerá de la relativa solubilidad
del soluto en cada uno. El grado de reparto, una vez conseguido el equilibrio, se llama
coeficiente de reparto o razón de distribución.

Solventes específicos para cromatografía de ciertas sustancias (las proporciones

siguientes indican mezclas vol./vol.)

Para separar aminoácidos:

 n-butanol, ácido ácetico, agua [8:2:2]

 n-butanol, etanol 95%, agua [8:2:2]
 metanol, agua [8:2]
 etanol 70%, agua, amoníaco 0,88 mol/L [18:1:1]
 metanol, n-butanol, agua [5:5:1]
 etanol 70%

Para separar indicadores ácido-base:

 isopropanol en atmósfera de amoníaco

 solución acuosa de cloruro de sodio 3%
 alcohol n-amílico en atmosfera de amoníaco
 n-butanol, amoníaco, agua, etanol 70% [20:0,2:8,8:4]
 n-butanol, ácido acético, agua [4:1:5]

Para separar ácidos orgánicos no volátiles:

 n-propanol, amoníaco [3:2]

 etanol absoluto, amoníaco, agua [16:1:3]
 éter dietílico, ácido acético, agua [13:3:1]

Para separar fenoles:

 n-butanol, ácido acético, agua [8:2:2]

 solución acuosa de cloruro de potasio 20%
 n-butanol saturado con amoníaco 5 mol/L
 isopropanol, amoníaco, agua [8:1:1]

Para separar carbohidratos:

 n-butanol, ácido acético, agua [4:1:5]

 n-butanol, etanol, agua [4:1:5]
 n-propanol, acetato de etilo, agua [7:1:2]
 n-butanol, etanol, agua, amoníaco (40:12:16:1)

Reactivos reveladores para cromatografía en papel de sustancias
específicas

 Para aminoácidos: ninhidrina 0,4% en etanol. El color se desarrolla después de

calentar durante varios minutos en la estufa. La coloración que se observa en las
manchas es violeta, con excepción de la prolina que produce las manchas amarillas
al revelar con este reactivo.
 Para indicadores ácido-base: si es necesario exponer el papel a vapores de
amoníaco.
 Para ácidos orgánicos no volátiles: solución de verde de bomocresol 0,04% en
isopropanol, regulada a pH=7 con hidróxido de sodio. Se observan manchas
amarillas sobre fondo azul-verdoso. También se puede revelar con azul de
bromofenol, púrpura de bromocresol o rojo de metilo.
 Para fenoles: bencidina diazotada, se mezcla la solución I con igual volumen de la
solución II justo antes de utilizarla. Calentar en la estufa a 105 ºC hasta que se
observe la aparición de manchas coloreadas.
 Para carbohidratos: nitrato de plata amoniacal, mezclar volúmenes iguales de
nitrato de plata 0,1 mol/L y amoníaco 5 mol/L. Se observan manchas pardas al
calentar la estufa a 105 ºC durante 10 minutos.