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UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN

FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA – MICROBIOLOGÍA

RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS VIABLES EN

LECHE CRUDA DESTINADA A USO COMERCIAL MEDIANTE EL RECUENTO EN

PLACA DE SIEMBRAPOR EXTESIÓN EN SUPERFICIE SEGÚN ICMSF, 2000

Estudiante

Grecia L. Espinoza Monzón 2018-118048

Helen Vanessa Inga Rosas 2018-118018

Fabiola Maytee Bellido Mamani 2018-118043

Curso:

Microbiología de Alimentos

Docente:

Anacelly Valera

Tacna – Perú

2023
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CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN.....................................................................................................4

2. BACTERIAS AEROBIOS MESÓFILOS.................................................................5

3. LECHE......................................................................................................................7

3.1. Composición de la Leche...................................................................................7

3.2. Propiedades y clasificación de la Leche Cruda..................................................7

3.3. Calidad de la Leche..........................................................................................10

3.4. Fuentes de contaminación de la leche..............................................................11

4. Microbiología de la Leche.......................................................................................11

4.1. Bacterias Gram Positivas..................................................................................11

4.2. Bacterias ácidas Lácticas..................................................................................12

5. Criterios microbiológicos de la Leche Cruda..........................................................13

5.1. Normativa para Leche Cruda............................................................................13

6. Protocolo de Recuento en Placa de siembra por extensión en superficie................13

6.1. Objetivos..........................................................................................................16

7. MATERIALES........................................................................................................16

7.1. Materiales para la Toma de muestra.................................................................16

7.2. Materiales para las diluciones..........................................................................17

7.3. Materiales para el Recuento.............................................................................18

8. PROCEDIMIENTO.................................................................................................19
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8.1. Muestreo...........................................................................................................19

8.1.1. Tipo de muestra.............................................................................................19

8.2. Preparación de la Muestra................................................................................19

8.2.1. Condiciones para la recepción de las muestras según MINSA.....................19

8.3. Preparación de Diluciones................................................................................21

8.4. Procedimiento de Recuento en Placa de siembra por extensión en superficie.22

9. RESULTADOS.......................................................................................................26

10. CONCLUSIONES...................................................................................................28

11. BIBLIOGRAFÍA.....................................................................................................29

12. ANEXOS.................................................................................................................32
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1. INTRODUCCIÓN

La leche es un producto esencial de gran importancia, debido a la cantidad de nutrientes

que posee, tales como grasa, proteína, lactosa, vitaminas A, B1, B2, calcio y minerales. Debido

al incremento de la población humana, se aumentó la demanda de este alimento para la nutrición

de la sociedad, pero principalmente para infantes, por ello se ha impulsado la expansión de la

producción de la leche y sus derivados, lo que exige una óptima calidad en los productos

elaborados para que de esta manera se dé un adecuado aprovechamiento del alimento y

contribuir a la buena salud de los consumidores (Buñay & Peralta, 2015).

La leche es un alimento completo para la dieta de los seres humanos y un medio de

cultivo ideal para el crecimiento de una gran variedad de microorganismos. Un estudio realizado

en la ciudad de Cuenca – Ecuador, con objeto de determinar la presencia de microorganismos

Aerobios mesófilos en la leche cruda que se expende en carros repartidores en esta zona,

muestran que un 43.90% de los carros repartidores expenden leche no apta para el consumo

humano (Rojas Pesántez, 2013), razón por la cual es preocupante observar la calidad sanitaria de

la leche expendida y comercializada.

Por otra parte, la leche recién ordeñada contiene alrededor de 3 log UFC (ml en bacterias

cuando se han llevado condiciones higiénicas y pueden ser ≥ 6 log UFC/ml, cuando se ha

contaminado la leche por el equipo de ordeño, agua, utensilios, la vaca, el mismo ordeñador que

pueden aportar bacterias cuando no se lleva un control de la temperatura de almacenamiento de

la leche (Flores, s.f.).

Debido a lo mencionado anteriormente, el presente trabajo desea aportar información valiosa

sobre la calidad microbiología de la leche expendida en mercados populares de la ciudad de

Tacna, lo que permitirá establecer medidas de prevención en cuanto al manejo de la leche e

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informar a los consumidores acerca de la calidad sanitaria de los productos lácteos expendidos.

Para ello, nos basaremos en explicar la relevancia de los exámenes microbiológicos en alimento

más utilizados como lo es el recuento en placa que requiere investigar el contenido de

microorganismos viables en un alimento lo cual se basa en evaluar la calidad sanitaria,

condiciones higiénicas de la materia prima y forma como fueron manipulados durante su

evaluación.

Ejecutando así un adecuado procedimiento en este caso, de recuento en placa de siembra por

extensión en superficie tomando como referencia el protocolo de la ICMSF, 2000, la cual se

basa, principalmente, en cuatro aspectos importantes: El muestreo, la técnica de diluciones

adecuada según normas estandarizadas, procedimiento e interpretación de los resultados

analíticos. (E. et al., 2022)

2. BACTERIAS AEROBIOS MESÓFILOS

Definición:

Según el INEN se define a los microorganismos Aerobios mesófilos como Aquellos

microorganismos que se desarrollan en presencia de oxígeno libre y a una temperatura

comprendida entre 20°C y 45ºC con una zona óptima entre 30°C y 40ºC (INEN, 2006).

Características

El recuento de estos microorganismos, en condiciones establecidas, estima la microflora

total sin especificar los tipos de bichos presentes en la muestra.

Un recuento bajo de aerobios mesófilos no implica o no asegura la ausencia de patógenos

de toxinas, de la misma manera un recuento elevado no significa presencia de flora patógena.

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Ahora bien, en los alimentos obtenidos por fermentación, no son recomendables recuentos

elevados. (E. et al.,2022)

Dentro de este grupo de microorganismos se incluyen todas las bacterias, mohos y

levaduras capaces de desarrollarse a las temperaturas antes mencionadas, y en las condiciones

establecidas (Cano, 2006).

En productos terminados son empleados como indicadores de vida útil.

El número de microorganismos Aerobios mesófilos encontrados en un alimento ha sido

uno de los indicadores microbiológicos de calidad más comúnmente utilizado. Esta

determinación permite obtener información sobre la alteración incipiente de los alimentos, su

probable vida útil, la descongelación incontrolada de los alimentos o los fallos en el

mantenimiento de las temperaturas de refrigeración (Nore & Poveda, 2008).

A este tipo de microorganismos se les encuentra en alimentos almacenados a temperatura

ambiente o en alimentos refrigerados cuando se ha roto la cadena de frío.

Recuentos altos en alimentos estables a menudo indican materias primas contaminadas o

tratamientos no satisfactorios desde el punto de vista sanitario (Campo, 2003). El recuento de

Aerobios mesófilos permite:

 Verificar efectividad de los procedimientos de limpieza y desinfección.

 Determinar si las temperaturas aplicadas en los procesos fueron las adecuadas.

 Determinar el origen de la contaminación durante los procesos de elaboración de

alimentos.

 Verificar condiciones óptimas de almacenamiento y transporte.

 Obtener información acerca de la vida útil de los alimentos.

 Indicar alteración incipiente en ciertos alimentos. (Nore & Poveda, 2008).

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3. LECHE

Es el producto de la secreción mamaria normal de animales bovinos, bufalinos y caprinos

lecheros sanos, obtenida mediante uno o más ordeños completos, sin ningún tipo de adición,

destinada al consumo en forma de leche líquida o a elaboración posterior. (Ministerio de la

Protección Social, 2016).

Se define a la leche como: “El producto integro, no alterado ni adulterado y sin calostros

del ordeño higiénico, regular, completo e ininterrumpido de vacas sanas y bien alimentadas” (del

Rosario, 2000, p.281).

3.1. Composición de la Leche

Tabla 1

Composición media de la leche de vaca

Agua 87 por 100

Proteínas 3,5 por 100 (caseína 2,7 por 100)

Lípidos 3,5 - 4,0 por 100

Glúcidos 5,1 por 100 (lactosa 4,9 por 100) 0,7 por 100

Sales minerales (sodio, potasio, calcio, hierro, magnesio,

fósforo, cloruros, ácido cítrico)
Vitaminas hidrosolubles Vitaminas C, B1, B2 B6, B12 niacina, ácido
pantoténico, ácido fólico, biotina, colina,
inositol)
Vitaminas liposolubles (Vitaminas A, D, E y K)

Nota: Extraído de Rosario, 2000, p.281

3.2. Propiedades y clasificación de la Leche Cruda

Tabla 2
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Características organolépticas de la Leche Cruda

Características
Valores Características
Organolépticas

Por el desarrollo de ciertos

Viscosidad: 1,5-2,0 cp. a 20 Mo’s capaces de producir

Textura
°C polisacáridos aumentan los

valores normales.

Blanco: normal
Se atribuye a reflexión de la
Azulado: adulterada con agua
luz por las partículas del
Gris amarillento: mastitis
complejo caseinato – fosfato
Color Rosado: presencia de sangre
– cálcico en suspensión
o crecimiento de ciertos Mo’s
coloidal y por los glóbulos de
Amarilla-verdosa: adulterada
grasa en emulsión.
con suero de quesería

A veces se presenta con cierto

sabor salado por la alta

Ligeramente dulce gracias a
Sabor concentración de cloruros que
su contenido en lactosa
tiene la leche de vaca

(lactancia o mastitis)

Olor Su olor característico es Un olor penetrante puede

debido a la presencia de deberse a la presencia de

compuestos orgánicos cambios químicos o

volátiles de bajo peso microbiológicos que el

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molecular, entre ellos, ácidos,

producto puede experimentar
aldehídos, cetonas y trazas de
durante su manipulación.
sulfato de metilo

Nota: extraído de Celis & Juárez, 2009, p.4

Tabla 3

Propiedades Físicas de la Leche Cruda

Propiedades Físicas Valores Normales Características

Dependiente de la cantidad

Densidad 1, 028 a 1, 034 g/cm3 a 15°C de: agua, grasas, proteínas,

lactosa, minerales

Valores distintos de pH se

producen por deficiente

estado sanitario de la

glándula mamaria, por la

pH 6,5 - 6,65 cantidad de CO2 disuelto;

por el desarrollo de Mo’s

(convierten la lactosa en

ácido láctico) o por la acción

de Mo’s alcalinizantes

>0,15%: Mastitis o alteración

Acidez 0,15 a 0,16% por productos alcalinizantes.

<0,16% acción de Mo’s.

Viscosidad 1,7 a 2,2 Cp -

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Consecuencia de la presencia
- 0,54ºC (varía entre -0,513 y
Punto de congelación de las sales minerales y de la
- 0,565 ºC)
lactosa

Punto de Ebullición 100,17 ºC. -

Calor Específico 0, 93 – 0,94 cal/g ºC

Nota: Extraído de Celis & Juárez, 2009, p.4

3.3. Calidad de la Leche

Se entiende por leche de calidad a la que proviene de vacas sanas, bien alimentadas y que

reúne las siguientes características: (MIDAGRI, 2007).

 Cantidad y calidad apropiada de los componentes sólidos (grasa, proteínas, lactosa y

minerales).

 Con una carga microbiana mínima.

 Libre de bacterias causantes de enfermedades (ej. brucelosis, tuberculosis o bacterias

que producen mastitis) y toxinas (sustancias tóxicas) producidas por bacterias o por

hongos.

 Libre de residuos químicos e inhibidores.

Se puede tratar el tema calidad de leche desde dos aspectos:

 Calidad composicional.

 Calidad higiénico – sanitaria.

Para la obtención de una leche de calidad es necesario: (MINAGRI, 2011).

 Realizar una correcta rutina de ordeñe, en instalaciones adecuadas.

 Manejar con sumo cuidado la leche producida.

 No adicionar ninguna sustancia extraña a la leche.

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 Lograr una alimentación adecuada en cantidad y calidad.

 Hacer un correcto manejo sanitario y reproductivo.

3.4. Fuentes de contaminación de la leche

La calidad de la leche puede determinarse por la existencia de diversos tipos de

contaminantes. Estos se pueden dividir en dos grupos:

Contaminantes Químicos

Los que más frecuentemente son posibles de hallar en la leche derivan del medio que

rodean a la leche en el camino desde la ordeña a su proceso industrial. Es posible encontrar

insecticidas (DDT, aldrin, dieldrin, heptacloruro fenol), herbicidas, fungicidas, sustancias

higienizantes (cloro, peróxido de hidrogeno, sustancias amoniacales, etc.) y algunos antibióticos

(penicilinas, estreptonicinos, clorotetraciclinos, etc.) (Celis & Juárez, 2009, p.12).

Contaminantes Biológicos

Existe la posibilidad de que la leche se encuentre afectada de un gran número de agentes

microbianos desde el momento de su producción, dependiendo en gran medida de las prácticas

de higiene y sanidad observadas en el manipuleo durante la producción, transporte, proceso y

venta. (Celis & Juárez, 2009, p.12).

4. Microbiología de la

Leche

La leche por sus características y composición es un medio propicio para el desarrollo de

los siguientes microorganismos:

Las más importantes son las bacterias lácticas y las bacterias coliformes. (Celis & Juárez,

2009).
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4.1. Bacterias Gram Positivas

Se encuentran en el suelo, y en cualquier lugar donde existan altas concentraciones de

carbohidratos, proteínas, vitaminas y poco oxígeno. Su forma puede ser bacilar, cocoide u

ovoide; soportan ph 4 en la leche y son anaeróbicas facultativas, mesófilas y termófilas y de

crecimiento exigente. Pueden ser homofermentativas (más del 90% de su metabolismo resulta en

ácido Láctico) o heterofermentativas (producen además de ácido láctico, otros ácidos y gases).

(Celis & Juárez, 2009).

4.2. Bacterias ácidas Lácticas

Son bacilos o cocos, Gram – positivos, no esporulados y en general catalasa – negativos,

con una amplia distribución y adaptabilidad a diferentes ambientes. Pueden producir un pH 4,0

en los alimentos con carbohidratos fermentables, inhibiendo el desarrollo de otras bacterias.

Aunque son mesofílicas pueden crecer a 5 – 45 ºC. (Audisio M. C, 2007)

Están formadas por Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus,

Lactobacillus, Carnobacterium, Enterococcus, Vagococcus, Aerococcus, Tetragonococcus,

Alloiococcus, Bifidobacterium. (Celis & Juárez, 2009)

Género Lactobacillus, comprende de:

a) Homofermentativos obligados: L. acidophilus, L. delbrueckii subespecie

bulgaricus, etc, son termobacterias que no fermentan pentosas,

b) Heterofermentativos facultativos: L. casei, L. plantarum, etc., que fermentan

pentosas.

c) Heterofermentativos obligados: L. brevis, L. reuterii, etc., que producen CO2 de

glucosa

Género Enterococcus:
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Hay tres grupos genéticamente diferentes de estreptococos

a) Streptococcus en la ubre y la cavidad oral

b) Enterococcus: E. faecalis, E. faecium, etc., propios del intestino

c) Lactococcus, en la leche

5. Criterios microbiológicos de la Leche

Cruda

Tabla 4

Especificaciones de calidad sanitaria e inocuidad que establece el Ministerio de Salud

Agente Límite por ml

Unidad Categoría Clase N c
microbiano
m M
Aerobios
UFC/ml 3 3 5 1 5 6
mesófilos 5 x 10 10

Nota: Extraído de MINAGRI, 2017

5.1. Normativa para Leche Cruda

Toma de muestra

La toma de muestra se lleva a cabo según la normativa sanitaria para servicios de

alimentación colectiva NTS N° 13 – MINSA/2021/DIGESA.

Sus objetivos son:

- Higiénico – sanitaria: Para investigar defectos del producto que pueden perjudicar a la

salud del consumidor

- Control de calidad: Es un control de rutina para verificar si el producto

comercializados, corresponde a la calidad declarada

- Control epidemiológico.
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6. Protocolo de Recuento en Placa de siembra por extensión en superficie

FUNDAMENTO

Este método resulta útil para muchos alimentos, debido a que nos indica si la limpieza y la

desinfección y el control de la temperatura durante los procesos de tratamiento industrial,

transporte, y almacenamiento se han realizado de forma adecuada. (ICMFS,2000, pp.117-123)

Esta determinación permite también obtener información sobre la alteración incipiente de

los alimentos, u probable vida útil, la descongelación incontrolada de los alimentos congelados o

los fallos en el mantenimiento de las temperaturas de refrigeración en los alimentos refrigerados.

Así mismo, resulta adecuada cuando se desea poner de manifiesto el origen de la contaminación

durante los procesos de elaboración de los alimentos. (ICMFS,2000, pp.117-123)

El recuento en placa tiene especial aplicación en los alimentos importados porque en este

caso el país importador no tiene la posibilidad de poder controlar el grado de limpieza y

desinfección practicado en las industrias productoras. (ICMFS,2000, pp.117-123)

Existen tres métodos utilizados habitualmente para el recuento de la flora aerobia mesófila

en el cual para el presente informe se enfocará a explicar el método de recuento en placa de

siembra por extensión en superficie.

En los métodos de recuento en placa utilizados para la enumeración de grupos de

microorganismos que se multiplican dentro de rangos de temperatura diferentes, se debe

especificar la temperatura de incubación. (ICMFS,2000, pp.117-123)

Debido a que la temperatura elegida dependerá del fin que se pretende con la realización

del recuento. Así, por ejemplo, para determinar la calidad bacteriológica general de leche de

granja refrigerada en tanque y/o la eficacia y duración de su refrigeración se determinarán mejor

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llevando a cabo un recuento de la flora psicotrofa durante 10 días a 7°C; un recuento a 25-30°C

proporcionaría la información más adecuada sobre la limpieza y desinfección observadas en la

industria de alimentos. (ICMFS,2000, pp.117-123)

Cualquiera que sea la temperatura de incubación elegida, es fundamental su control en

todos los procedimientos de recuento. En muchos alimentos, los recuentos en placa son más

elevados cuando la temperatura de la estufa de incubación se fija entre 20 y 30°C. Cuando se

trata de leche, la experiencia indica que los recuentos son más altos si la temperatura de la estufa

se mantiene a aproximadamente 32°C. (ICMFS,2000, pp.117-123)

Muchos laboratorios prefieren utilizar el método de recuento en placa de siembra por

extensión en superficie y el método de recuento en placa por siembra de gotas de superficie,

sobre todo cuando se trata de analizar muestras con fines exploratorios. La razón de esta

preferencia radica en que en ambos métodos se requiere de una menor cantidad de medio, menos

números de placas Petri y pipetas más baratas. (ICMFS,2000, pp.117-123)

Independientemente de estos motivos económicos, ambos métodos de siembra en

superficie poseen ciertas ventas e inconvenientes, que señalamos a continuación, comparados

con el método de recuento estándar en placa por siembra en todo el medio. (ICMFS,2000,

pp.117-123)

Ventajas:

 No es esencial que el medio sea translúcido, como ocurre en el método estándar en

placa.

 Al desarrollarse todas las colonias en la superficie del medio, su aspecto puede ser

estudiado con mayor facilidad, resultando también más fácil estimar la proporción

de los distintos tipos de colonias presentes en placa

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 Al depositar diversas diluciones en la superficie de una placa, se puede comprobar

más fácilmente la exactitud del sistema de dilución.

 Los microorganismos sensibles al calor no son inactivados, como puede ocurrir al

poner en contacto las células con el agar fundido (a 45°C) en el método de recuento

estándar en placa

 Las placas con el medio, preparadas de antemano, pueden guardarse y trasladarse

fácilmente tanto dentro del laboratorio como a laboratorios de campo para estudios

“in situ”

Desventajas

 Debido al pequeño volumen de muestra utilizado (0,02 o 0,1 ml) el alimento

suspendido puede interferir, actuando como nutriente o ejerciendo un efecto

inhibidor sobre los microrganismos.

 Por la misma razón, los métodos de recuento en placa por siembra de gotas en

superficie y de siembra por extensión en superficie no dan resultados totalmente

satisfactorios cuando se trata de muestras que contienen pocos microorganismos

(por ejemplo, menos de 100/g). Sin embargo, las normas microbiológicas para

gérmenes mesófilos en alimentos están muy por encima de la cifra.

6.1. Objetivos

 Adquirir habilidades y/o destrezas para la siembra y cultivo de microorganismos.

 Analizar la calidad sanitaria en la muestra de leche cruda.

 Realizar el recuento de Bacterias Mesófilas Aerobias a través del método de

siembra por extensión en superficie en muestra de leche cruda

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7. MATERIALES

7.1. Materiales para la Toma de muestra

Materiales

 Envase de vidrio con tapa de plástico - 720 ml

 Recipiente inerte

 Plumón indeleble

 Guantes quirúrgicos

Material biológico

 Leche cruda destinada a uso comercial

7.2. Materiales para las diluciones

Materiales de vidrio

 04 tubos de ensayo (100mm)

 Matraz (250 ml)

 Probeta (100ml)

 01 propipeta

 Pipetas (10ml)

 Placas Petri (100 x 15 mm)

Reactivos y agares

 Agua Peptonada (2.25g)

 Plate Count Agar (PCA) (2.025gr)

 150 ml de agua destilada

Equipos y otros:
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 Gradillas

 Balanza analítica (capacidad no inferior a 2.500g y sensibilidad de 0,1g.)

 Autoclave

 Papel aluminio

 Papel Kraft

 Espátulas

 Pavillo

 Lápiz

7.3. Materiales para el Recuento

Materiales de Vidrio

 Asa Digralsky

 Pipetas graduadas de 1ml de capacidad

 Pipetas bacteriológicas de 1,5 y 10ml

 Placas Petri de vidrio (100 x 15 mm) o de plástico (90x 15 mm)

Equipos

 Contador de colonias

 Dispositivo de registro automático del número de colonias contadas

 Estufa de aire o baño de agua (para templar y mantener el medio fundido a 44-46)

 Estufa de incubación, 29-31°C

 Estufa de desecación

Agares

 Agar para recuento en placa

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Nota: Algunos materiales en el presente protocolo fueron modificadas o adecuadas según

los alances que se obtendrían en el laboratorio de Microbiología por ejemplo, según el manual de

la ICMSF nos indica el uso del contador de colonias y dispositivo de registro del número de

colonias contadas para lo cual en el presente informe se realizó un conteo manual para la

expresión de resultados debido a la deficiencia de materiales e equipos, esto con la finalidad de

adiestrar a los estudiantes lo que se debería usar en un protocolo formal según la empresa e

normativa que se indique.

8. PROCEDIMIENTO

8.1. Muestreo

8.1.1. Tipo de muestra

- Muestra primaria: Unidad o proporción del lote en una sola operación y de una sola

vez (MINSA,2021).

8.2. Preparación de la Muestra

8.2.1. Condiciones para la recepción de las muestras según MINSA

- Envases

Los envases deben estar completamente limpios, secos, herméticos. Pueden utilizarse

frascos de boca ancha, bolsas de plástico o desechables.

Los envases debes ser estériles y si son bolsas plásticas, éstas deben ser de primer

uso.

Los envases con tapa deben ser tipo rosca no metálica, y tienen que ser de material

insoluble, no absorbente e inerte. Las bolsas de plástico desechables deben sellarse

 20

firmemente tras su llenado, de forma que no se produzca goteo o escurrimiento

durante su manipulación posterior.

Las muestras de alimentos envasados deben ser transportados en sus envases

originales.

- Cantidad de muestra

La cantidad de muestra recomendada para los ensayos microbiológicos van de

acuerdo a la cantidad establecida de muestra necesario y condiciones de conservación

y tiempo de transporte.

Debe enviarse la cantidad de muestra que se requiera para cada tipo de ensayo en

particular (microbiológico, parasitológico, fisicoquímico y/o sensorial).

Tabla 5

Cantidad de muestra necesaria y condiciones de conservación y tiempo de transporte

Tipo de Tipo de Tipo de Cantidad Conservación Tiempo máximo para el

ensayo muestra envase de transporte al laboratorio

muestra

Físico- Leche cruda Envase 500 ml 4°C si Tan rápido como sea posible y

químico o procesada original requiere antes de su fecha de vencimiento,

en caso de los que requieren

refrigeración antes de las 24

horas.

Nota: Extraído de MINSA (2021)

- Identificación de las muestras

 21

Las muestras deben estar claramente identificadas mediante un rótulo o etiqueta,

consignando, con letra legible y tinta indeleble, los siguientes datos que deben

coincidir con lo declarado en la solicitud de ensayo:

 Identificación de la muestra

 Lugar de la toma de muestra

 Fecha y hora de la toma de muestra

 Número de lote (si fuera el caso)

 Temperatura de la muestra al momento de ser tomada

La etiqueta deberá colocarse de tal forma, que se evite que el envase sea abierto y la

muestra sea alterada o violada. Por ejemplo: entre la tapa y el frasco, en el nudo o cierre de la

bolsa.

- Conservación, transporte y envío de muestras al laboratorio

La conservación y transporte de todas las muestras colectadas deberá efectuarse de

tal manera que se impida su ruptura, derrame, alteración o deterioro, evitando su

exposición a la luz solar directa.

El transporte de las muestras al laboratorio debe efectuarse en un recipiente limpio e

inerte que ofrezca una protección adecuada contra la contaminación externa y evite el

deterioro de las muestras durante el transporte.

El transporte de las muestras que requieren refrigeración o congelación debe

realizarse en recipientes refrigerados (conservadores) u otro material aislante, que

tenga una capacidad suficiente.

8.3. Preparación de Diluciones

1. Una vez tomada la muestra debe iniciarse el análisis tan pronto como sea posible.
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2. Tarar el vaso del homogeneizador estéril y vacío, en este protocolo se utilizo el

papel aluminio como su reemplazo, donde según normativa nos indica pesar 50g

de la muestra, sin embargo, con fines educativos tras realizar previos cálculos se

pesaron 2,25g de agua peptonada disueltos en 150 ml de diluyente (agua

destilada)

3. Una vez homogenizado se miden 90 ml con la ayuda de una probeta con

capacidad de 100ml y lo transferimos en un matraz

4. Posteriormente en 4 tubos de ensayos previamente esterilizados adicionamos 9ml

en cada uno de la muestra del agua peptonada preparada.

5. Para la preparación del agar (PCA) como medio solidificante se pesó 2,025g

(lavar y arrastrar los restos de la hoja de aluminio con el diluyente) disueltos en

90 ml de agua destilada, estos fueron a ebullición hasta llegar a 100°C con la

ayuda de una estufa.

6. Previamente se mandó a esterilizar junto a los tubos de ensayo y el diluyente con

agua peptonada, previamente forrados con papel Kraft y rotulados con lápiz.

7. Por último, se envuelve con papel kraft las pipetas, placas y asa de drigalsky para

su esterilización en el horno y las diluciones del matraz y tubos de ensayo a la

incubadora.

8.4. Procedimiento de Recuento en Placa de siembra por extensión en superficie

1. Añadir a cada placa de Petri 15 ml de medio para recuento en placa fundido y

enfriado a 45-60 °C y dejar solidificar.

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2. Secar las placas preferiblemente a 50°C durante 1,5-2 horas. Si las placas se preparan

con antelación, no deben guardarse más de 24 horas a temperatura ambiente o de 7

días en frigorífico a 2-5 °C.

3. Preparar las muestras de alimento siguiendo los procedimientos recomendados en el

procedimiento dedicado a la preparación y dilución de los homogenizados de

alimentos.

4. Tomar dos alícuotas de 0,1ml de la dilución más elevada y depositarlas en la

superficie del medio contenido en 2 placas de Petri (2 placa por dilución, sembrado

en cada una 0,1ml).

5. Repetir esta operación con cada dilución hasta llegar a la más concentrada utilizando

siempre la misma pipeta que se vaciará y llenará tres veces antes de transferir a cada

placa los 0,1 ml.

6. Deben sembrarse por lo menos tres diluciones aun en el caso de que se conozca el

número aproximado de microorganismo presentes en la muestra de alimento.

7. Extender las alícuotas de 0,1 ml sobre la superficie del medio tan pronto como sea

posible, utilizando el asa Digralsky (emplear una varilla de vidrio para cada placa).

8. Dejar secar las superficies de las placas durante 15 minutos.

9. Incubar las placas invertidas durante 24 a 48 hrs. a 29-31 °C

10. Calcular el número de gérmenes por gramo o mililitro de muestra siguiendo las

indicaciones señaladas.

Reproductibilidad y error personal

 El resultado obtenido al contar por segunda vez las colonias de una placa determinada

debe presentar:
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 Una diferencia máxima del 5% en el caso de que este recuento lo haya realizado la

misma persona

 Una diferencia máxima del 10% en el caso de que este recuento lo haya realizado otra

u otras personas

 Cuando las diferencia entre ambos supera estos límites, la razón puede achacarse a

defectos visuales, a la dificultad de reconocer las colonias muy pequeñas o, lo que es

frecuente, a la incapacidad para diferenciar las colonias de las partículas más

pequeñas.

CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS

Según la FDA las reglas para seleccionar las cajas para los cálculos son las siguientes:

- Una vez seleccionadas las cajas y hechos los promedios correspondientes, se aplica el

factor de dilución, que es el inverso y se redondea el número a 2 cifras significativas

(o dígitos) y potencias de 10. Cuando el tercer dígito del promedio es 4 o menor, se

omite dejando el número de 2 cifras significativas . Por ejemplo, si en una caja se

cuentan 312 UFC, se debe reportar como 31 X 101 , porque el tercer dígito es 2 y se

redondea al segundo dígito. Cuando el tercer dígito es 5 o superior, el segundo dígito

se redondea al siguiente, por ejemplo si en una caja se cuantifican 199 UFC se

reportará como 20 x 101 UFC, porque el tercer dígito es superior a 5. En el ejemplo 5

del cuadro 2, el promedio es de 237.5 en la dilución 10 -3, por lo que se reportará como

24 x 104 UFC. (FDA,2003)

- Cuando las 2 placas de una dilución contienen un número de colonias características

dentro del rango de sensibilidad del método, se promedian los números y se

multiplica por el inverso de la dilución.

 25

- Cuando una de las 2 placas de una dilución es representativa y la otra no, se

consideran ambas y se promedian.

- Si en las placas no hay colonias (o no son características del grupo en estudio),

reportar el resultado como: menos de un (grupo) en 10-x (la más baja utilizada), por

ejemplo < 100 / g si la dilución más baja fue 10-2 ó < 1 / mL si la muestra se sembró

directamente, sin diluciones. Se agrega la leyenda: “valor estimado”

- Cuando el número de colonias por placa exceda de 250, contar las colonias en

aquellas porciones de la placa que sean representativas de la distribución de colonias.

Contar por ejemplo, una cuarta parte o una mitad del área de la caja y multiplicar el

valor obtenido por 4 ó 2, respectivamente. Si solamente pueden contarse algunos

cuadros, considerar que el fondo de una caja Petri de 100 mm de diámetro contiene

65 cuadros de la cuadrícula del contador. Agregar la leyenda "valor estimado".

Se cuenta como una sola colonia cuando:

- Cadenas o pequeños grupos no separadas claramente entre sí, que parecen ser

causadas por la desintegración de un cúmulo de bacterias y que están separadas de

otras colonias o cadenas.

- Colonias extendidas como película entre el fondo de la caja y el agar y que se

diferencian claramente de otras.

- Colonias como película en las orillas de la caja, sobre la superficie del agar.

EXPRESIÓN DE RESULTADOS FINALES

Reportar como se indica a continuación, con dos cifras significativas y potencias de 10:

Bacterias mesofílicas aerobias en placa en agar ___________incubadas por ____ h. a _____ ºC:

_______ UFC / g (ó / mL) de muestra.

 26

Sustituir “mesofílicas” por termofílicas, psicrofílicas ó psicrotróficas, según corresponda,

anotando el tiempo y la temperatura correspondientes.

Si se analizó un alimento para el cual existe norma y existe especificación sobre el grupo

estudiado, incluir en el reporte si el alimento cumple o no con la norma.

9. RESULTADOS

a. Conteo de colonias

Para el conteo de colonias primero analizamos las muestras que se encuentran dentro de

los parámetros indicados la normativa (30 - 300 UFC):

 27

Dilución: Dilución 10-1: demasiado

10-1 numerosas para contar
(DNPC)

Dilución: Dilución 10-2: demasiado

10-2 numerosas para contar
(DNPC)

Dilución:
10-3 Dilución 10-3: demasiado
numerosas para contar
(DNPC)

Dilución: Dilución 10-4: demasiado

10-4 numerosas para contar
(DNPC)

Dilución 10-5: Registro del

conteo dentro de los
Dilución: valores aceptables para el
10-5 recuento. Por ello tomamos
como muestra referencia la
dilución 10-5

b. Conteo y Cálculos

Formula:

N ° de colonias x factor de dilución

UFC / ml ó UFC / g =
ml de la muestra sembrada
 28

Reemplazamos:

145 x 10−5
UFC/ml =
0 ,1 ml

UFC/ml = 15 x 107

c. Reporte de resultados:

Bacterias mesofílicas aerobias en placa en Plate Count Agar (PCA) incubadas por 24 h. a

29 ºC: 15 x 107 UFC /mL de muestra de Leche cruda comercial muestreados en la esquina de 2

de mayo. Lo cual nos indica según la norma sanitaria que establece los criterios microbiológicos

de calidad sanitaria e inocuidad para los alimentos y bebidas de consumo humano, sobrepasan

los Limites máximos permisibles en la calidad microbiológica de la leche cruda (Tabla 4).

10. CONCLUSIONES

 La presente práctica nos ayudó a comprender la importancia de la técnica de

recuento en placa método por siembra por extensión superficie y cuando podemos

aplicarla, así como saber que una óptima y correcta evaluación de un producto

yace desde la toma de muestra así como su manipulación durante el resto del

procedimiento los cuales implicaría demostrar las habilidades y/o destrezas para

la siembra y cultivo de microorganismos de cada estudiante.

 Según la norma sanitaria que establece los criterios microbiológicos de calidad

sanitaria e inocuidad para los alimentos y bebidas de consumo humano para leche
 29

cruda nos indica que debe oscilar dentro de los valores 5 x 10 5 - 106 UFC/ml ó g

los cuales nos indica que el valor obtenido de 15 x 107 UFC/mL sobrepasan los

Límites máximos permisibles en la calidad microbiológica de la leche, esto podría

deberse a las condiciones sanitarias de donde se obtuvo la muestra, como la falta

de uso de guantes del vendedor, el recipiente almacenada la muestra,

manipulación de la muestras, espacio poco sanitario e higiénico entre otras causas

extrínsecas, de la misma manera al ser nuestra primera practica otro de los

factores que pudieron influenciar dentro de los cálculos obtenidos es la mala

praxis que se ejecutó durante la práctica, siendo uno de ellos la falta de rapidez en

ejecutar el procedimiento en la inoculación de la muestra los que implicaría una

posible contaminación cruzada.

 Se logró realizar con éxito el recuento de Bacterias Mesófilas Aerobias a través

del método de siembra por extensión en superficie en muestra de leche cruda,

donde logramos determinar que la presente técnica nos ayudo a estimar un valor

de la flora microbiana que se encontraría en la muestra asi como también nos

permitió evaluar la calidad sanitaria del producto donde la presencia de un

número elevado de bacterias aerobias mesófilas, significa que pueden haberse

dado condiciones favorables a la multiplicación de los microorganismos.

 30

11. BIBLIOGRAFÍA

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Ochoa - Fernández CIA. LTDA. Universidad de Cuenca Facultad de Ciencias Químicas-Carrera

de Bioquímica y Farmacia.

12. ANEXOS

Flujograma de la toma de muestra de leche Cruda

 33

- Flujograma del procedimiento de diluciones

Inoculación de la muestra
- Resultados

Se descartaron diluciones 10-2, 10-3 y 10-4

Conteo en dilución 10-5