Informe final estudiante en práctica

Área de biotecnología
Programa de Variedades
Centro de investigación de la caña de azúcar de Colombia CENICAÑA

Autor:
Karen Caicedo
Aprendiz Sena técnico en alistamiento de laboratorios de microbiología y biotecnología

TUTORES
Fernando silva Aguilar
Alejandra Londoño
Hugo Arley Jaimes
Melissa Montoya Arbeláez

Programa de variedades, área de Biotecnología, Cenicaña

CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA INDUSTRIAL

PALMIRA, VALLE DEL CAUCA
2023
AGRADECIMIENTOS

Agradezco a:
Contents
1. Resumen....................................................................................................................................4
2. Introducción...............................................................................................................................5
3. Objetivos....................................................................................................................................6
3.1 Objetivo general................................................................................................................6
3.2 Objetivos específicos.........................................................................................................6
4. Materiales y métodos.................................................................................................................7
4.1 Localización del experimento............................................................................................7
4.2 Obtención de cultivo monosórico de Puccinia kuehnii provenientes de las variedad CC
01-1940 .........................................................................................................................................7
4.3 Incremento del cultivo monosórico proveniente de la variedad CC 01-1940...........8
4.4 Recolección de uredosporas mediante bomba de vacío...................................................8
4.5 Re inoculación del cultivo monosórico proveniente de la variedad CC 01-1940..............8
4.6 Confirmación de la pureza del inóculo de Puccinia kuehnii recolectado..........................8
5. Resultados y discusión...............................................................................................................9
5.1 Localización del experimento............................................................................................9
5.2 Obtención de cultivo monosórico de Puccinia kuehnii provenientes de las variedad CC
01-1940..........................................................................................................................................9
5.3 Incremento del cultivo monosórico proveniente de la variedad CC 01-1940...................9
5.4 Recolección de uredosporas mediante bomba de vacío...................................................9
5.5 Re inoculación del cultivo monosórico proveniente de la variedad CC 01-1940..............9
5.6 Confirmación de la pureza del inóculo de Puccinia kuehnii recolectado........................10
6. Conclusiones y recomendaciones............................................................................................10
7. Bibliografía...............................................................................................................................10
Lista de figuras

Figura 1. Soro esporulado del inoculo proveniente de la variedad CC 01-1940.................................8

Lista de cuadros

Obtención e incremento de los cultivos monosóricos de la roya café

(Puccinia melanocephala) y de roya naranja (Puccinia kuehnii) para
procesos de investigación genómica

Colecta de uredosporas
 1. Resumen

Puccinia kuehnii es un hongo fitoparásito obligado causante de la enfermedad roya naranja en

el cultivo de la caña de azúcar. Este patógeno presenta un ciclo de vida complejo que consta de
cuatro fases espóricas asexuales y una sexual. En caña de azúcar el hongo es encontrado
principalmente en la fase asexual donde se producen uredosporas que forman pústulas en el
envés de las hojas. Puccinia kuehnii es un patógeno que no se puede cultivar en condiciones de
laboratorio, lo cual ha dificultado que se realicen estudios básicos de conocimiento del
microorganismo y que todo lo que se haya estudiado sea poblacional. Por lo anterior, el
objetivo de este trabajo es obtener un cultivo monosórico de Puccinia kuehnii que garantice
que el inóculo incrementado proviene de un soro o pústula individual. Para esto, se inocularon
plantas sanas provenientes de cultivo in vitro de la variedad CC 01-1940, utilizando un pincel de
cabello fino. Después de la inoculación, las plantas se mantuvieron durante 24 horas en una
cámara de inoculación a 23°C y con una humedad relativa mayor al 80%. Una vez las plantas
fueron inoculadas se esperó a que empezaran a mostrar síntomas y signos de la enfermedad
para colectar uredosporas. Como resultados se obtuvieron plantas de CC 01-1940 con un grado
de reacción de 6 y severidad del 80%. De estas plantas se colectó 71 mg de uredosporas, las
cuales provienen de un cultivo monosórico de Puccinia kuehnii. En conclusión, se cuenta con
una metodología que permite obtener, incrementar y mantener un cultivo monosórico de P.
kuehnii. Este protocolo puede ser extrapolado para el estudio de otras royas, tratando de
garantizar la pureza y cantidad de esporas del patógeno adecuadas para futuros análisis como
secuenciación del genoma completo de este microorganismo o análisis de filogenia, entre
otros.
Palabras Clave: Puccinia kuehnii, roya naranja, caña de azúcar, monosórico, Extracción de ADN

2. Introducción

Puccinia melanocephala (roya café) y P. kuehnii (roya naranjaDurante siglos la caña de

azúcar ha desempeñado un papel crucial en la historia y economía de Colombia. Este país
sudamericano cuenta con condiciones geográficas y climáticas ideales para el cultivo de la
caña de azúcar. Las regiones del valle del cauca, cauca, Risaralda, Antioquia y Santander
son reconocidas por sus extensas áreas de cultivo de caña, generando importantes
beneficios económicos y sociales al país. La producción de caña de azúcar genera alrededor
de 286.000 empleos directos e indirectos, contribuyendo a la economía del país
(Agronegocios,2023). Los ingenios azucareros del Valle del Cauca no producen solamente
azúcar, sino que producen bioetanol, También, emplean el bagazo que queda de la caña
para producir energía eléctrica (Asocaña,2017). Sin embargo, la caña de azúcar, como
cualquier otro cultivo, también se ve expuesta a diferentes enfermedades debido a las
condiciones climáticas, del suelo y por factores biológicos que muchas veces limitan el
desarrollo del cultivo, ocasionando pérdidas económicas. Este cultivo es afectado

Durante siglos la caña de azúcar ha desempeñado un papel crucial en la historia y

economía de Colombia. Este país sudamericano cuenta con condiciones geográficas y
climáticas ideales para el cultivo de la caña de azúcar.

Las regiones del valle del cauca, cauca, Risaralda, Antioquia y Santander son reconocidas
por sus extensas áreas de cultivo de caña, generando importantes beneficios económicos
y sociales al país. La producción de caña de azúcar genera alrededor de 286.000 empleos
directos e indirectos, contribuyendo a la economía del país (Agronegocios,2023).
 Los ingenios azucareros del Valle del Cauca no producen solamente azúcar, sino que
producen bioetanol, También, emplean el bagazo que queda de la caña para producir
energía eléctrica (Asocaña,2017).

Sin embargo, la caña de azúcar, como cualquier otro cultivo, también se ve expuesta a
diferentes enfermedades debido a las condiciones climáticas, del suelo y por factores
biológicos que muchas veces limitan el desarrollo del cultivo, ocasionando pérdidas
económicas.

Este cultivo es afectado principalmente por enfermedades de origen fungí, entre las
cuales se encuentra la roya, cuyo agente causal son dos especies pertenecientes al género
Puccinia: Puccinia melanocephala (roya café) y puccinia kuehnii (roya naranja).

3. Objetivos

3.1 Objetivo general

Incrementar los cultivos monosóricos de la roya naranja (Puccinia kuehnii) para procesos de
investigación genómica.

3.2 Objetivos específicos

 Incremento de cultivos monosóricos ya establecidos de roya naranja (Puccinia kuehnii) de

la variedad CC 01-1940.
  Identificación molecular de P. kuehnii y P. melanocephala mediante marcadores
moleculares ITS.

4. Materiales y métodos

4.1 Localización del experimento

El experimento se llevó a cabo en las instalaciones de la Estación Experimental San Antonio de

los Caballeros (EESA) de Cenicaña, ubicadas en el municipio de Florida (Valle del Cauca), a 3°
21' de latitud Norte, 76° 18' de longitud Oeste y 1024 metros sobre el nivel del mar. La
temperatura media anual es de 23.3°C, precipitación media anual de 1141 mm y humedad
relativa de 80%.

4.2 Obtención de cultivo monosórico de Puccinia kuehnii provenientes de las variedades CC 01-
1940
Para la obtención de un cultivo monosórico de Puccinia kuehnii, agente causal de la roya naranja
en caña de azúcar, se tomó una hoja de caña de azúcar de la variedad CC 01-1940 (Error:
Reference source not found)parasitada bajo inóculo natural en campo que contara con soros o
pústulas individuales esporulados.

La hoja colectada se llevó al laboratorio de invernadero de Cenicaña donde se eligió un soro o

pústula cuyo grado de reacción fue superior a 5 de acuerdo a la escala de calificación para la
evaluación de royas en el cultivo de la caña de azúcar descrito por Purdy y Dean (1980). Una vez
ubicado el soro con estas características, y con la ayuda de un pincel Merletto Royal 1,
previamente humedecido en 1- nonanol (0,0002%) - Tween 20 (0,1%) (Sood et al., 2009), se
procedió a desprender todas las uredosporas presentes en el soro, teniendo cuidado de no tocar
en ningún momento otros soros o uredosporas adyacentes y de esta manera evitar la
contaminación cruzada (Santacruz et al., 2017, Santacruz, 2019.

4.3 Incremento del cultivo monosórico proveniente de la variedad CC 01-1940

Se limpiaron las hojas de las nuevas plántulas que vamos a inocular con una solución de 1-
nonanol (0,0002%) - Tween 20 (0,1%) y se inocularon por pincelado en el envés de las hojas TVD y
TVD+1 de plántulas de 1.5 a 2 meses de edad en cámara de inoculación con una temperatura de
22°C y humedades relativas superiores al 90%. Pasadas las 20 horas en cámara de inoculación (16
horas de oscuridad seguido de 4 horas luz), las plantas se llevaron al invernadero y se ubicaron
dentro de cubículos de plástico individuales con dimensiones de 50 cm x 50 cm x 50 cm,
construidos en estructura y base de madera, con paredes de plástico agro lene transparente tipo
invernadero y puerta abatible frontal.

4.4 Recolección de uredosporas mediante bomba de vacío

Pasados aproximadamente 15 días después de cada inoculación (ddi), cuando ya se observó

cumplimiento del periodo de latencia o esporulación, se colectaron las uredosporas de los soros
producidos, y este nuevo inóculo se depositó en cápsulas de gelatina con ayuda de una bomba de
vacío y un mini colector de esporas ciclónico.
4.5 Re inoculación del cultivo monosórico proveniente de la variedad CC 01-1940

Cuando se contó con 71 mg de uredosporas conservadas a -80°C, éstas se llevaron durante 1 hora
a -20°C, 1 hora a 4°C y 20 horas a cámara húmeda. Las uredosporas se suspendieron en Tween 20
(0.02%) y nonanol (0.001%) y se aplicaron sobre las plantas a inocular mediante la aspersión de la
suspensión del hongo utilizando un aerógrafo conectado a un compresor entre 20-30 PSI (Rincón
et al., 2017). Las plantas inoculadas se dejaron durante 15 minutos para su secado y
posteriormente son llevadas a la cámara de inoculación donde se incuban durante 16 h bajo
oscuridad y 4 h con luz, a una humedad relativa por encima del 90% como se ha descrito
anteriormente.

4.6 Confirmación de la pureza del inóculo de Puccinia kuehnii recolectado

Se realizó una verificación de la pureza del inoculo recolectado de P. kuehnii proveniente de la

variedad CC 01-1940, para esto, se introdujo una jeringa de insulina en el tubo eppendorf
almacenado a -80°C con el fin de analizar morfológicamente las uredosporas presentes en la
muestra. Se realizaron observaciones del único estado espórico encontrado (Uredinio-II), del cual
se realizaron micro preparados en lacto glicerina.

5. Resultados y discusión

5.1 Obtención de cultivo monosórico de Puccinia kuehnii provenientes de las variedad

CC 01-1940
5.2 Incremento del cultivo monosórico proveniente de la variedad CC 01-1940

5.3 Recolección de uredosporas mediante bomba de vacío

Karen extrayendo con cosito

5.4 Re inoculación del cultivo monosórico proveniente de la variedad CC 01-1940

Plantas inoculadas
 Patógeno Fecha de recolección Mg recolectados
P. kuehnii 160323 71 mg
0.071

5.5 Confirmación de la pureza del inóculo de Puccinia kuehnii recolectado

6. Conclusiones y recomendaciones

7. Bibliografía

https://www.elpais.com.co/contenido/la-cana-de-azucar-una-agroindustria-que-impulsa-
al-valle-del-cauca.html

https://www.agronegocios.co/agricultura/la-produccion-de-cana-de-azucar-contribuye-
con-286-000-empleos-directos-e-indirectos-3636862
https://www.researchgate.net/publication/
294428089_ENFERMEDADES_OCASIONADAS_POR_LA_ROYA_CAFE_Puccinia_melanoceph
ala_Y_LA_ROYA_NARANJA_Puccinia_kuehnii_DE_LA_CANA_DE_AZUCAR_EN_MEXICO