UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

INSTITUTO DE CIENCIA Y TECNOLOGIA DE ALIMENTOS - ICTA-

PLANTA PILOTO DE LECHES

GUIAS DE LABORATORIO

CONTROL DE CALIDAD DE LECHE CRUDA

 TABLA DE CONTENIDO

1. TIEMPO DE REDUCCIÓN DEL AZUL DE METILENO (Ensayo de Reductasa).

2. PRUEBA DEL ALCOHOL.
3. INDICE LACTOMÉTRICO (°L).
4. DENSIDAD.
4.1. DETERMINACION DE LA DENSIDAD DE 15/15°C CON
TERMOLACTODENSIMETRO.
4.2. DETERMINACION DE LA DENSIDAD D 15/15°C CON PICNÓMETRO
5. ACIDEZ.
6. DETERMINACIÓN DE LA MATERIA GRASA (MÉTODO DE GERBER).
7. DETERMINACIÓN DE SÓLIDOS TOTALES EN LECHE.
8. INDICE CRIOSCOPICO.
9. ADULTERANTES.
9.1. HARINA Y ALMIDONES.
9.2. SACAROSA.
9.3. CLORUROS.
9.3.1. MÉTODO DE SELECCIÓN.
9.3.2. MÉTODO CUANTITATIVO - DROST
10. CONSERVANTES.
10.1. IDENTIFICACIÓN DE FORMALDEHÍDO (PRUEBA DE SELECCIÓN).
10.2. IDENTIFICACIÓN DE FORMALDEHÍDO (PRUEBA CONFIRMATORIA).
10.3. IDENTIFICACIÓN DE HIPOCLORITOS-CLORAMINAS-DIÓXIDO DE CLORO.
10.4. IDENTIFICACIÓN DE AGUA OXIGENADA.
11. NEUTRALIZANTES
11.1. IDENTIFICACIÓN DE NEUTRALIZANTES (PRUEBA DE SELECCIÓN).
11.2. IDENTIFICACIÓN DE NEUTRALIZANTES (PRUEBA CONFIRMATIVA).
12. PRUEBA DE LA FOSFATASA.
13. PRUEBA DE LA PEROXIDASA
14. EXAMEN ORGANOLÉPTICO
1. TIEMPO DE REDUCCIÓN DEL AZUL DE METILENO (Ensayo de Reductasa)

OBJETIVOS

General:
Con el fin de evaluar la calidad higiénica de la leche cruda, determinar de manera
indirecta la densidad bacteriana para un intervalo de tiempo de incubación, por
medio de la prueba denominada tiempo de reducción del azul de metileno,
(T.R.A.M.).

Específicos:
• Conocer el fundamento teórico de la prueba.
• Clasificar diferentes tipos de leche según su densidad microbiana.
• Reconocer el método como una prueba indirecta para determinar la calidad de

la leche.

FUNDAMENTO TEÓRICO:

El potencial de óxido - reducción (εh) mide las propiedades oxidantes (+) o

reductoras (-) de solución, que se manifiesta por la corriente eléctrica entre dos
electrones sumergidos en la solución. La leche tiene un (εh) positivo
aproximadamente +0.2 a +0.3 V, lo que indica que capta electrones.

El (εh) de la leche es consecuencia del contenido de O2, sustancias reductoras

naturales (reductasa aldéhica de Schardinger, ácido ascórbico y tratamientos
tecnológicos). El crecimiento de bacterias reduce el potencial de oxido-reducción
por consumo de O2 y producción de sistemas reductores propios de las
bacterias. Este cambio en el (εh) es la base de los métodos de oxido-reducción
para determinar el cambio en la calidad de la leche. El azul de metileno cambia
de color con un (εh) de +0.054 v. la resazurina que se reduce entre +0.18 y +0.19
 v. reacciona antes que el azul de metileno y registra presencia excesiva de
leucocitos.

La decoloración se produce cuando se alcanza un potencial redox aproximado

de +0.06 a +0.01 v., y se dice que la muestra se encuentra decolorada cuando
aparece blanca en sus 2/3 partes.

EQUIPO Y MATERIAL

Pipetas volumétricas de 10 ml.

Pipetas volumétricas de 1 ml.
Tubos con tapa rosca.
Gradillas metálicas
Tapones para tubos.
Baño maría para controlar una temperatura de 37 °C
Frascos de vidrio ámbar con tapa rosca de 250 ml. de capacidad.
Reloj de laboratorio, preferiblemente con alarma.

REACTIVOS

Azul de metileno grado reactivo (C16H18CIN3S.2H2O)C.

PROCEDIMIENTO

Preparación de la solución de trabajo:

* Solución Colorante Madre:

Tomar 200 ml. de agua destilada recién hervida o estéril en un recipiente

debidamente esterilizado de color ámbar, agregar 1.1 g. de cloruro de azul de
metileno, agitar hasta disolver completamente, enfriar y conservar la solución del
 colorante en un lugar oscuro y refrigerado. Esta solución debe prepararse
semanalmente.

* Solución de trabajo:

En un frasco de las mismas características del utilizado para la preparación de la

solución madre preparar 90 ml. de agua destilada estéril con 10 ml. de la
solución madre. Esta solución debe prepararse diariamente.

Cuando se usan tabletas certificadas, se debe esterilizar o hervir 200 ml. de agua
destilada, en un matraz cerrado e impermeable a la luz o en autoclave, debe
cuidarse que al terminar la esterilización hayan 200 ml ± 2 ml. de agua en el
matraz, posteriormente se enfría un poco el agua esterilizada, cuando esta esté
tibia se disuelve una tableta de azul de metileno, tomando las precauciones
necesarias para no contaminar la tableta, dejar enfriar y guardar en un lugar
oscuro y frío. Estas soluciones deben prepararse semanalmente. Para un
análisis lácteo usar la solución en razón de 1 ml. por 10 ml. de muestra.

En el momento de tomar las muestras a analizar del frasco, se debe agitar éste
varias veces de manera rápida, depositar 10 ml. de cada muestra en tubos
estériles, el intervalo entre la agitación y la toma de muestra no debe ser mayor a
3 minutos ; estas muestras deben examinarse en el transcurso de las siguientes
24 horas de la toma. Para comenzar las pruebas de las diferentes muestras al
mismo tiempo se pueden conservar los tubos a una temperatura de 0 - 4 °C
mientras se terminan de tomar las muestras.

Al iniciar el proceso de análisis se deben identificar los tubos de manera tal que
no haya lugar a equivocaciones, además preparar un tubo adicional con 10 ml de
cualquiera de las muestras.

Con una pipeta estéril transferir a cada tubo 1 ml. de solución de trabajo, en este
momento se deben tapar los tubos e iniciar la incubación a 37 °C, cuando se
alcancen los 37 ° C tomar los tubos e invertirlos lentamente 3 veces y registrar
esta hora como la hora inicial de la incubación, colocar un termómetro en el tubo
adicional con el fin de monitorear la temperatura del proceso.

Se deben estar observando los cambios de color en los tubos durante la

incubación, si alguna muestra se decolora antes de 30 minutos de iniciada la
incubación se toma el tiempo y se reporta como T.R.A.M. (Tiempo de Reducción
del Azul de Metileno) : 30, después de efectuar la lectura inicial a los 30 minutos
tomar cada hora lecturas, para ello puede usarse un reloj con alarma con el fin
de recordar el momento de la toma de los datos.

Cuando se observe una decoloración en los 2/3 de la muestra se puede tomar

esta como el momento fina de la decoloración, los T.R.A.M. se toman en valores
 enteros por horas, así si la muestra se decoloro entre 1 :30 horas y 2 :30 horas,
el T.R.A.M. es 2 horas.

Se debe retirar las muestras decoloradas después de cada lectura, anotar los
resultados, invertir completamente los tubos restantes de manera lenta y
continuar con la incubación.

Los datos obtenidos se pueden interpretar de la siguiente manera:

* Leche de primera calidad:

No decolora al azul de metileno en 5 horas y media lo que equivale a menos de

500.000 gérmenes / ml.

* Leche de calidad mediana:

Se mantiene coloreada durante dos horas y media pero se decolora dentro de

dos horas lo que equivale a un número de 500.000 a 4.000.000 de gérmenes/ml.

* Leche de mala calidad higiénica:

Se mantiene durante 20 minutos pero se decolora dentro de dos horas lo que

equivale a un número de 4 millones hasta 20 millones de gérmenes/ml.

* Leche muy mala:

Se decolora en menos de 20 minutos lo que corresponde a más de 20 millones

de gérmenes/ml.

Si la muestra no decolora en 6 a 7 horas, debe descartarse la presencia de

sustancias antibióticas o inhibidoras. La legislación colombiana (Decreto 2437 de
1983, Art.27, 28, 33 y 34 Min Salud, establece para la leche cruda entera un
tiempo mínimo de reducción del azul de metileno de 4 horas para la leche
proveniente de los hatos de primera categoría, cuando sea para consumo
humano directo y mínimo 7 horas para la leche higienizada entera ,
semidescremada o descremada.
2. PRUEBA DEL ALCOHOL.

Este método debe ser utilizado para la prueba del alcohol en cantinas o recipientes para
determinar la estabilidad de la proteína de la leche frente a agentes deshidratantes.

OBJETIVOS

General:
Determinar en forma general si la leche presenta una acidez superior a la
permitida, la cual generalmente está entre 0,14 y 0,19% expresada como ácido
láctico o si presenta condiciones fisico-químicas que no le permiten ser sometida
a calentamiento.

Específicos:
* Conocer el fundamento teórico de la prueba.
* Implementar una técnica rápida para la clasificación de la leche como ácida o
normal.

FUNDAMENTO TEÓRICO:

En una leche que posee un valor alto de acidez la micela de caseina pierde sus
cargas eléctricas, lo cual la hace sensible a la acción deshidratante del alcohol,
efecto que se manifiesta al presentarse una precipitación de grumos debido a
que el alcohol deshidrata la micela y al no poseer sus cargas completas, no
puede mantenerse en suspensión. Una leche con un pH inferior a 6.4 o una
ácidez titulable superior a 0,19% expresada como ácido láctico precipitará con
alcohol etílico de 68% en peso o 75% en volumen.
EQUIPO Y MATERIAL

1. Dosificador tipo Neurex o similar.

2. Agitador para cantinas de leche

REACTIVOS
Alcohol etílico neutro de 68% en peso libre de aditivos.

PROCEDIMIENTO
Agitar adecuadamente la muestra poco antes de realizar la prueba.

Tomar el tanque del dosificador con la mano con el tubo hacia arriba.

Tapar con el índice la perforación en la tapa que sirve de respiradero al tanque.

Introducir la punta del tubo en la leche, sacarla verticalmente, en este momento

se han tomado 2 ml. de muestra con en dosificador, darle entonces un giro de
180 ° al aparato, con lo cual la leche tomada caerá en la copa situada en el
inferior del dosificador junto con 2 ml. de alcohol etílico de 68 - % m/m.

Mezclar la leche con el alcohol, procurando agitar lentamente.

Observar el aspecto de la mezcla

INTERPRETACION :

Cuando la leche posee una acidez que se encuentra entre el rango normal (0.14
a 0,19%) se observa que en las paredes de la copa la mezcla desliza sin dejar
grumo alguno, más cuando la leche posee una acidez alta se deben observar en
las paredes de la copa grumos que quedan adheridos, los cuales corresponden a
caseina albúmina precipitada. En caso de que el alcohol tenga mayor
concentración, la prueba será más exigente en grado de acidez y en balance
mineral, lo que puede dar mayor garantía en el caso de leche que vaya a ser
sometida a tratamientos térmicos muy intensos.
3. INDICE LACTOMÉTRICO (°L).

OBJETIVOS

General :
Detectar la concentración de sólidos no grasos de la leche a través de la
refracción de la luz.

Específicos :
* Conocer el fundamento teórico de la prueba.
* Reconocer el método como una prueba para la determinación de la
calidad de la leche, en cuanto a su alterabilidad con agua o sólidos extraños a la
leche.

FUNDAMENTO TEÓRICO :

El índice de refracción (n) de un medio transparente se define comúnmente

como el ángulo de desviación de la luz al pasar del aire al medio. El índice de
refracción es característico de cada sustancia particular, pero también depende
mucho de la temperatura, de la presión y de la longitud de onda (λ) de la luz.

El índice de refracción de la leche (n20D ≈ 1.338) esta determinado por el del

agua (n20D = 1.3330) y el de la sustancias disueltas. Los glóbulos grasos, las
burbujas de aire y los cristales de lactosa no influyen en el n de los productos
lácteos, pero si lo hacen las micelas de caseína, incluso los que son
comparativamente grandes, posiblemente porque no son homogéneas y no
tienen un límite neto. La lectura del refractómetro de Bertuzzi se expresa
directamente en porcentaje de sólidos no grasos, esperando valores de grados
 lactométricos (°L), entre 8.4 y 9.2. Valores por debajo de este rango pueden
hacer sospechar de aguado y valores por encima, adición de sólidos extraños .

EQUIPO Y MATERIAL

Refractómetro de Bertuzzi con soporte y lámpara

REACTIVOS

Solución de calibración: solución salina al 9.0 % p/v.

PROCEDIMIENTO

Limpiar bien el prisma del refractómetro con agua destilada. Colocar el

refractómetro en el soporte, tomar agua destilada a temperatura ambiente y
agregársela al prisma. Dejar caer suavemente la parte superior del prisma sin
hacer presión. Esperar un minuto, encender la lámpara y hacer la lectura. Si la
línea de separación de la zona clara y oscura se encuentra por debajo de 0, esta
desviación debe adicionarse cuando se haga la lectura con la muestra de leche,
más si la línea de separación se encuentra por encima del 0 se debe entonces
restar de la lectura que se realice a la muestra. Secar adecuadamente el prisma
con un trapo cuidando no rayarlo, ni dejar residuos líquidos en el prisma.

Agregar la muestra de leche a temperatura ambiente empapando el prisma,

cerrar el refractómetro y realizar la lectura.

Realizar la corrección antes mencionada. Este resultado corresponde al extracto

seco desengrasado % m/v a 15 °C.
Para la calibración del refractómetro se debe colocar en el prisma la solución
salina a temperatura ambiente, la cual debe dar una lectura corregida de 9.0 ±
0.2 %. El índice lactométrico para la leche cruda entera debe ser mínimo 8.4°L
4. DENSIDAD.

OBJETIVOS

General :

Establecer la relación masa / volumen de la leche con el fin de verificar si ha

tenido algún tipo de adulteración con agua adicional o con sustancias extrañas.

Específicos :

* Conocer el fundamento de la prueba

* Operar dos métodos para la determinación de la densidad con las
adecuadas consideraciones.
* Determinar las ventajas y desventajas entre los dos métodos utilizados.

FUNDAMENTO TEÓRICO :

La densidad de la leche no es una propiedad con valor constante por estar

determinada por dos factores opuestos, la concentración de sólidos no grasos
que la incrementan y la proporción de grasa que la disminuyen.

La densidad de la leche puede fluctuar entre 1,0285 y 1.0320 gramos por ml a 15

°C, con un promedio de 1,030 y corresponde a la densidad de los diversos
componentes en la proporción en que entren a formar parte del producto total.
Así por ejemplo el agua posee una densidad de 1,000 g/cc ; la grasa de 0,930 la
lactosa de 1,666; las proteínas de 1,346 y los minerales de 5,500; resultando
para los sólidos no grasos 1,661 gramos por ml. La densidad puede verse
afectada por varios factores : puede incrementarse por adición de substancias
que disuelven en el agua de constitución de la leche como sal, azúcares, féculas,
etc. ; también por descremado y disminución de la temperatura al momento de
hacer el análisis. Puede disminuir por factores opuestos como son : el aguado, la
adición de grasas y el aumento de temperatura al análisis.
4.1. DETERMINACION DE LA DENSIDAD DE 15/15°C CON
TERMOLACTODENSIMETRO.

EQUIPO Y MATERIAL

•Probeta de vidrio que permita el libre movimiento del termolactodensímetro y la

total inmersión del vástago graduado.
•Termolactodensímetro de Quevenne a 15/15°C con graduaciones en la escala
de un grado lactodensimétrico, debidamente calibrado con picnómetro provisto
de termómetro.

Datos de calibración del termolactodensímetro los cuales son generados de la

siguiente manera :

A una leche normal preferiblemente homogenizada se le determina la densidad

con picnómetro.

Calcular los grados lactodensimétricos L 15/15 por la siguiente fórmula :

L 15/15 = 1000( D 15/15 -1 )

Efectuar 5 determinaciones completas con el termolactodensímetro que se va a

emplear efectuando la corrección por temperatura, sacar el promedio. Denominar
l 15/15 este promedio.

La corrección del aparato es igual a L 15/15 - l 15/15

PROCEDIMIENTO

Si la muestra no presenta en la superficie acumulación de grasa, solamente se

debe mezclar unas tres veces trasvasándola de un recipiente a otro evitando la
 formación de espuma. Si se presenta algún grumo de grasa la muestra debe ser
calentada a unos 36 °C antes de homogenizar, en este momento se puede tomar
el volumen necesario de leche para realizar la determinación de la densidad.

Por medio de mezclado trasvasando la muestra de un recipiente a otro llevar la

temperatura a 15 °C ± 5 °C, agregar la muestra a la probeta, cuidando de no
formar espuma, hasta un volumen tal que el cuerpo del lactodensímetro quede
totalmente cubierto de leche.

Introducir suavemente el lactodensímetro cuidando de no dejar que este pegue

con las paredes de la probeta, esperar un minuto antes de hacer la lectura.

Estimar la lectura del lactodensímetro con exactitud de 0.1 grado

lactodensimétrico.

Efectuar esta lectura en la parte superior del menisco, haciendo la observación

en forma perpendicular a éste.

CALCULOS

La lectura realizada corresponde a los grados lactodensimétricos aparentes, por

lo cual para obtener los grados reales, se deben hacer dos correcciones :

La debida al error sistemático del termolactodensímetro, determinados en los

datos de calibración.
Corrección por temperatura, por no estar la muestra a 15 °C.

Se deben aplicar entonces las siguientes fórmulas :

L 15/15°C = l + 0.24( t -15 ) + CA

D 15/15°C = 1 + ( L 15/15°C)/ 1000
Donde :

L 15/15°C : grados lactodensimétricos 15/15 corregidos.

t : temperatura de la muestra en grados centigrados.
CA : corrección sistemática de los grados lactodensimétricos
determinados con picnómetro.
l : lectura en la escala de los grados lactodensimétricos.
D 15/15°C: Densidad de la leche 15/152°C.
4.2. DETERMINACION DE LA DENSIDAD D 15/15°C CON PICNÓMETRO

EQUIPO Y MATERIAL

Balanza analítica con aproximación de 0.1 mg.

2.Picnómetro con tapón esmerilado, preferiblemente provisto de termómetro de
0° a 40°C
3.Baño de maría con control termostático a 15 °C

PROCEDIMIENTO

Calibración del picnómetro :

Lavar el picnómetro con detergente y enjuagar con agua destilada,

posteriormente lavar con alcohol y luego con éter, dejar secar al ambiente, llevar
el picnómetro a 15 °C y pesar, tomar este peso como P1.

Llenar el picnómetro con agua destilada de manera tal que cuando se coloque el
tapón reboce el agua por el tubo lateral. Se debe procurar que dentro del
picnómetro no queden burbujas de aire.

Llevar el picnómetro lleno a 15 °C y pesar, tomar este peso como P2.

El peso del agua a 15 °C será entonces : P2 - P1

Para la determinación del peso de la leche, se repite la operación de secar el

picnómetro como se había indicado anteriormente.

Proceder igual que con el agua destilada y llamar a este peso P3.

Peso de leche a 15 °C = P3 - P1
Para obtener la densidad 15/15°C
D 15/15°C = (P3 - P1) / (P2 - P1)
Una densidad menor de 1.028 gramos /litro en leche entera significa que puede tener
agua adicional, mientras que una densidad mayor de 1.033 g/litro en leche entera
puede presentarse en una leche a la cual se le adicionaron sólidos seguramente para
disimular el fraude de aguado. La densidad a 15/15 °C de la leche cruda e higienizada
entera según la legislación colombiana debe ser de 1,0300 a 1,0330 gramos / cc; la de
la leche higienizada semidescremada: 1.0310 a 1.0335 g/cc y la de la leche
descremada higienizada de 1,0340 a 1,0360 g/cc. Estos valores son algo difíciles de
alcanzar durante todo el año por la raza Holstein en nuestro medio.
5. ACIDEZ.

OBJETIVOS

General :
Establecer el nivel de acidez titulable de una muestra determinada de leche.

Específicos :
Comprender el principio en que la prueba de determinación de acidez titulable se
basa.
Valorar la acidez de la leche como uno de los parámetros más relevantes a la
hora de decidir el proceso en el que será utilizada.

FUNDAMENTO TEÓRICO :

La leche posee una reacción iónica cercana a la neutralidad ; el pH normal

fluctúa entre 6.6 y 6.8 por la presencia de caseína y los aniones fosfóricos y
cítricos principalmente.

La acidez de la leche se define como la cantidad en mililitros de una solución

alcalina de normalidad conocida, necesaria para neutralizar los componentes de
acidez de 100 ml. de leche, utilizando fenolftaleina como indicador. Su
determinación es menos específica que la toma del pH pero por su sencillez y
bajo costo se utiliza a nivel universal.

Esta acidez corresponde a la valoración de tres reacciones según se aprecia en

la figura
 Acidez
Desarrollada
Acidos Orgánicos

Acidos Orgánicos Acidez de

Valoración
Materias minerales (global)
(Fosfatos, CO2,,etc.
Acidez de
valoració
n natural
Caseina

“over run”

Leche Leche Acida

Fresca

La acidez natural corresponde a la reacción de los componentes de la leche

principalmente las proteínas y que puede variar considerablemente al
incrementarse la concentración de sólidos por la raza explotada.

La acidez desarrollada, es la producida por la degradación de la lactosa con

producción de ácido láctico y que depende de la carga bacteriana que posea la
leche y el tiempo y temperatura de almacenamiento de la leche cruda.

Reacciones secundarias conocidas como “over-run” o “sobreaumento”, producto

de las reacciones de la sustancia de titulación con los fosfatos y producción de
ácido fosfórico con los fosfatos y producción de ácido fosfórico que debe ser
neutralizado posteriormente.

La suma de estas tres acideces corresponde a la acidez total o titulable que es la

determinada en el laboratorio y que puede variar para leches frescas entre 0.14 y
0.19 % expresada como ácido láctico viéndose incrementada hasta valores
 cercanos al 1% en leches que han sufrido procesos de acidificación . También
puede expresarse en grados de acidez de acuerdo con los métodos elegidos.

La fijación de los parámetros de acidez titulable no puede hacerse bajo los

mismos criterios para todas las regiones ya que se puede cometer errores al
desechar leches cuya calidad es superior por mejor concentración de sólidos,
pero por lo mismo, su acidez titulable es mayor.

EQUIPO Y MATERIAL

Bureta de 10 ml de capacidad graduada en divisiones de 0.05 ml. 0 .01 ml.

Pipeta volumétrica de 10 ml. de leche.
Recipiente para realizar la titulación.

REACTIVOS

Solución de fenolftaleina al 1% m/v en alcohol etílico de 95 a 96°G.L

neutralizado.
Solución valorada de hidróxido de sodio 0.1 N, libre de carbonatos

PROCEDIMIENTO

En primera instancia se debe procurar que en la leche a analizar no se observen

grumos de grasa, por lo cual si es necesario se debe mezclar, trasvasándola de
un recipiente a otro y si es necesario calentar.

La determinación se debe hacer con la muestra aproximadamente a 20 °C.

Se toman 10 ml, de la muestra y se colocan en el recipiente para la titulación,

agregar 5 gotas de solución indicadora de fenolftaleina y titular con la solución de
 hidróxido de sodio hasta observar un color rosado claro en la muestra. Tomar el
dato de ml. de hidróxido utilizado en la valoración.

CALCULOS :

La acidez de la leche se expresa en porcentaje (m/v) de ácido láctico (gramos de

ácido láctico contenidos en 100 ml de leche)

Grados Thorner de Acidez = ml de NaOH 0.1Normal necesarios para titular 100

ml de leche

Grados Dornic de Acidez: ml de NaOH 0,1Normal necesarios para titular 90 ml

de leche.

Grados Soxhlet-Henkel : ml de NaOH 0.25 Normal necesarios para titular 100 ml

de leche.

Porcentaje de acidez expresado como ácido láctico :

grados thorner x 0.009
grados dornic x 0.01

Porcentaje de acidez: VB x NB x 9 / VL
Donde VB: volumen de Soda gastados
VL volumen de leche utilizados
NB Normalidad de la Soda
6. DETERMINACIÓN DE LA MATERIA GRASA (MÉTODO DE GERBER).

OBJETIVOS

General :
Cuantificar el porcentaje de materia grasa que posee una determinada muestra
de leche.

Específicos :
* Sustentar la prueba conceptualmente.
* Reconocer el porcentaje de grasa como una de las características de la
leche, que determina su posterior utilización en procesos de manufactura de
derivados lácteos.

FUNDAMENTO TEÓRICO :

La materia grasa es sintetizada en la glándula mamaria a partir de los ácidos

grasos presentes en la sangre. La glicerina que forma los triglicéridos proviene
de la glucosa sanguínea. Se presenta en la leche dentro de la fase de emulsión
formada por glóbulos grasos cuyo diámetro puede variar, dependiendo de
múltiples factores. La materia grasa puede ser separada por medio de desnatado
centrífugo

Se han ideado numerosos métodos para el análisis a gran escala de la grasa en

condiciones prácticas ; los más precisos proporcionan una desviación relativa
estándar que se diferencia de la de Röse-Gottlieb1 en aproximadamente un 1 %
en muestras individuales. Los métodos volumétricos, que emplean recipientes
especialmente diseñados dotados de vástagos graduados estrechos ; un
volumen de leche se digiere, generalmente, con ácido sulfúrico concentrado que
 disuelve toda la proteína y las membranas de los glóbulos grasos ; la grasa se
recoge entonces en el vástago graduado por centrifugación. Los métodos más
utilizados son el de Babcock y el de Gerber. Este último emplea un recipiente
especial, llamado corrientemente butirómetro, y alcohol amílico para facilitar la
coalescencia de los glóbulos grasos desnudos ; esto convierte el método en más
válido y versátil pero también en más elaborado. Los métodos volumétricos son
en gran parte empíricos y deben calibrarse frente a un método gravimétrico. La
grasa dividida muy finamente (como la de la leche homogenizada) no se
recupera totalmente ; el resultado depende mucho de las condiciones de trabajo
(fuerza de ácido sulfúrico, cantidad de reactivos, temperaturas y tiempo de
digestión, aceleración y tiempo de centrifugación.

EQUIPO Y MATERIAL

1. Butirómetros Gerber original para la determinación de grasa en leche con

graduación de 0 a 7% ó a 8%.
2. Soporte para butirómetros
3. Pipetas aforadas de 11 ml de capacidad.
4. Dosificador para ácido sulfúrico que entregue 10 ml.
5. Dosificador para alcohol isoamílico que entregue 1 ml.
6. Tapones adecuados para butirómetros.
7. Llave para butirómetro.
8. Centrifuga adecuada para butirómetro Gerber.
9. Baño maría con control termostático a temperatura de 65 °C, de profundidad,
tal que permita la inmersión vertical de los butirómetros hasta el bulbo
terminal.

REACTIVOS

1
El método Röse-Gottlieb se puede consultar en “Química y Física Lactológica”, Walstra Pieter, De.
 Alcohol Isoamílico certificado para la prueba de Gerber.
Acido Sulfúrico libre de grasa, de peso específico a 15.6 °C de D = 1.820 - 1.825.

PROCEDIMIENTO

Llevar la muestra a una temperatura aproximada de 20 °C, mezclar hasta que

esté homogénea, vertiéndola varias veces de un recipiente a otro. Si la muestra
presenta grumos de grasa, calentar en baño de maría a 38 °C antes de
homogenizar, luego enfriar a 20 °C.

Colocar en el butirómetro Gerber 10 ± 0.2 ml de ácido sulfúrico. Con una pipeta

de 11 ml medir la muestra de leche debidamente preparada a no más de 24 °C.
La pipeta llena hasta que la parte superior del menisco coincida con la línea de
graduación. Al principio se debe dejar escurrir la leche lentamente por las
paredes del butirómetro para evitar la reacción con el ácido la cual es muy
exotérmica; luego dejar vaciar la pipeta. Agregar 1 ml de alcohol isoamílico y
colocar el tapón de seguridad.

Tapado el butirómetro, agitarlo hasta que desaparezcan las partículas de color

blanco, esto se debe hacer con mucho cuidado ya que el butirómetro se calienta
bastante, invertirlo completamente unas tres veces para que el ácido contenido
en el bulbo también se mezcle.

Centrifugar el butirómetro con el bulbo hacia arriba durante 5 minutos contados

después que el centrifugador alcance una velocidad estable, no se debe olvidar
que la centrifuga debe quedar equilibrada.

Transcurridos los 5 minutos pasar el butirómetro con el tapón hacia el fondo a un

baño de maría a 65 °C procurando que el baño cubra completamente la columna

Acribia S.A., España.

 de grasa del butirómetro, pasados de 5 - 7 minutos realizar la lectura
presionando con la llave el tapón para que la columna de grasa quede a nivel de
una columna principal.

Anotar la lectura y registrarla como el porcentaje de grasa en la leche m/m .

La legislación colombiana exige un contenido mínimo de materia grasa de 3.0%
m/m para leche cruda e higienizada entera, 7.5% m/m para la leche esterilizada
evaporada entera; un valor entre 1.5 y 2.0% m/m para la leche higienizada
semidescremada y entre 0.1 y 0.5% m/m para la leche higienizada descremada.
7. DETERMINACIÓN DE SÓLIDOS TOTALES EN LECHE

OBJETIVOS

General :
Especificar el porcentaje de sólidos totales (sólidos grasos y no grasos) en una
muestra de leche determinada por medio de la gravimetría.

Específicos :
* Conceptualizar sobre la prueba gravimétrica para determinar el porcentaje
de sólidos totales.
* Diferenciar variedades de leche, en cuanto a su porcentaje de sólidos se
refiere con el fin de determinar su calidad y posterior utilización.

FUNDAMENTO TEÓRICO :

Los sólidos totales de la leche representan entre un 11 a un 13 %, los cuales se

dividen de manera general en sólidos grasos y sólidos no grasos

EQUIPO Y MATERIAL

1. Cápsulas metálicas o de vidrio de altura aproximada de 2 cm., de diámetro

alrededor de 6 - 8 cm con tapas apropiadas.

2. Balanza analítica

3. Estufa para secar

4. Desecador

5. Baño de maría

PROCEDIMIENTO
 Calentar la leche a 35 - 40 °C mezclando suavemente y luego enfriarla a una
temperatura de 20 ± 2 °C.

Secar la cápsula y la tapa en la estufa a 102 ± 2 °C por media hora.

Dejar enfriar la cápsula tapada a la temperatura ambiente en un desecador y

pesar.

Pipetear alrededor de 3 ml. de la leche en la cápsula ; tapar la cápsula y pesar.

Poner la cápsula destapada a baño maría hirviendo durante 30 minutos.

Poner la cápsula en una estufa para desecado a 102 ± 2 °C por 2 horas. La tapa
debe ser puesta al lado de la cápsula.

Cubrir la cápsula con la tapa, ponerla en el desecador y dejar enfriar.

Pesar

Colocar por una hora más en la estufa de desecar, dejar enfriar y pesar.

Repetir la desecación hasta que la diferencia de peso entre las dos pesadas
sucesivas no exceda a 0.5 mg.

CÁLCULOS :

El contenido de materia seca expresado como porcentaje se calcula como :

% materia seca = Peso después de desecar / Peso antes de la desecación * 100
. El contenido de sólidos no grasos y de sólidos totales puede estimarse con cierto
grado de aproximación a partir de fórmulas que correlacionan la densidad y el contenido
de materia grasa con el contenido de sólidos no grasos o de sólidos totales. La
legislación colombiana acepta la fórmula de Richmond:

% SNG= 250 (D-1) + 0.2 G + 0.14

donde: SNG= porcentaje de sólidos no grasos o extracto seco desengrasado
D= Densidad de la leche a 15/15 °C
G= Porcentaje de materia grasa m/m en la leche.
Para la leche cruda e higienizada entera y semidescremada se exige mínimo
8.3% de extracto seco desengrasado calculado por fórmula de Richmond; para la leche
higienizada descremada se exige mínimo 8.7% m/m de extracto seco desengrasado.
8. INDICE CRIOSCOPICO.

OBJETIVOS

General :
Distinguir la adición de agua o de sólidos por medio de la determinación del
índice crioscópico.

Específicos :
•Manejar la prueba de determinación de índice crioscópico con fundamento
teórico.
•Reconocer el índice crioscópico como una característica que indica la
adulterabilidad de la leche.

FUNDAMENTO TEÓRICO :

El punto de congelación de la leche es la propiedad más constante ya que esta

dada por la lactosa y los minerales en solución que son los componentes menos
variables. Puede variar entre -0.530 y -0.550 °C y es muy útil para detectar el
fraude por aguado que eleva el punto hacia 0 °C y también por adición de sales
que los disminuyen. En leches con acidez superior a 0.16% hay necesidad de
restar 0.005 °C por cada 0.01 % de acidez. También en leches conservadas con
bicromato de potasio deben restarse 0.018 °C por cada gramo de bicromato por
litro de leche. El calentamiento de la leche eleva su punto de congelación debido
a la desnaturalización de proteínas y mayor ligado de agua lo mismo que a
modificación de los equilibrios salinos. El vacío utilizado para desodorizar la
leche también eleva su índice crioscópico por eliminación de gas carbónico. El
llamado “aguado tecnológico” durante los tratamientos térmicos es difícil de
 demostrar, pero se considera que una elevación del punto de congelación de
0.005 °C equivale a un aguado de 1 %.

EQUIPO Y MATERIAL

Crioscopio con termistor con sus respectivos accesorios.

REACTIVOS

Soluciones de patrones primarios.

* Solución patrón de sacarosa -0.406°C. :

Disolver 7.00 g. de sacarosa pura de calidad S.R.M. 17 o de pureza equivalente,
en un balón volumétrico de 100 ml, completar hasta la marca con agua destilada,
recientemente hervida y enfriada a 20 °C.

* Solución patrón de sacarosa -0.598 °C :

Disolver 10.00 g. de sacaloras pura de las especificaciones anteriores en un
balón volumétrico de 100 ml, completar hasta la marca con agua destilada
recientemente hervida y enfriada a 20 °C.

Los microorganismos atacan la sacarosa después de un corto tiempo de

conservación aún en refrigeración, cambiando los valores del punto de
congelación.

Emplear estas soluciones patrones o las primarias suministradas por el

fabricante del equipo para la calibración del aparato.
 Soluciones de patrones secundarios :

•Solución de patrón de cloruro de sodio -0.406 °C. Pesar 100 g. de agua

destilada recientemente hervida y enfriada a 20 °C en un balón volumétrico de
100 ml. Agregar 0.6892 g. de cloruro de sodio, grado reactivo (secado a peso
constante momentos antes de pesar). Agitar, conservar en frascos de polietileno
con tapa rosca.

•Solución patrón de cloruro de sodio -0.598 °C. Pesar 100 g. de agua destilada
recientemente hervida y enfriada a 20 °C. en un balón volumétrico de 100 ml.
Agregar 1.0206 g. de cloruro de sodio, grado reactivo, secado a peso constante.

Agitar, conservar en frascos de polietileno con tapa rosca. Los patrones

secundarios también pueden ser suministrados por los fabricantes del aparato.
Estos patrones secundarios deben emplearse para controlar el aparato antes de
efectuar la determinación de índice crioscópico en la leche.

Preparación de la muestra :
La muestra debe estar bien mezclada. No debe tener una acidez titulable
superior a 0.18 g/100 ml, expresada como ácido láctico.

PROCEDIMIENTO

Para la utilización del crioscopio se deben seguir las instrucciones del manual de
operaciones del equipo correspondiente.

CALCULOS

Determinación de la cantidad de agua adicionada :

Para calcular el agua mínima adicionada aplicar la siguiente fórmula :

Agua adicionada % = (T - T1)/T

Donde :
T = índice crioscópico establecido para la leche auténtica.
T1 = índice crioscópico de la muestra examinada.
9. ADULTERANTES.

OBJETIVOS :

General :
Implementar diferentes pruebas para determinar elementos adulterantes de la
leche.

Específicos :
•Conocer la fundamentación teórica en que se basan las pruebas de
determinación de adulterantes en la leche.
•Especificar diferentes pruebas para determinar la presencia de harinas y
almidones, así como sacarosa y cloruros.

FUNDAMENTO TEÓRICO :

Tanto la leche, como los productos lácteos pueden contener muchos otros
componentes en concentraciones muy pequeñas (unos µg⋅kg-1) llamados
contaminantes o adulterantes; es difícil diferenciarlos de los componentes lácteos
naturales. Los contaminantes se pueden definir como productos químicos
inexistentes en la leche de las vacas mantenidas en condiciones naturales
(aunque las condiciones naturales son difíciles de definir). Los contaminantes
comprenden principalmente productos químicos elaborados por el hombre ;
algunos también se presentan en la naturaleza (por ejemplo todos los
oligoelementos) en cuyo caso la contaminación puede ser cuestión de
concentración o de vía de llegada a la leche más que de presencia ; en los
pezones de las vacas pueden haber sustancias naturales, como toxinas
microbianas y venenos endógenos vegetales que llegan de esta forma a la
leche ; por lo tanto, se denominan corrientemente también contaminantes.
9.1. HARINA Y ALMIDONES.

EQUIPO Y MATERIAL

Tubos de ensayo de vidrio refractario, de 16 * 150 mm.

Mechero
Recipiente con agua-hielo.

REACTIVOS

Solución de yodo-yoduro de potasio :

Yodo 1 g.
Yoduro de potasio 2 g.
Agua destilada 300 ml.

PROCEDIMIENTO

Colocar en un tubo de ensayo 5 ml. de muestra, hervir, enfriar en el agua hielo,

agregar 5 gotas de reactivo.

INTERPRETACIÓN :

Positivo : Color azul, indica presencia de almidón o harina

Negativo : Color amarillento.
El color azul debe desaparecer por calentamiento.

Preparar un testigo negativo con leche pura fresca y un testigo positivo con la
misma leche adicionada de almidón.
9.2. SACAROSA.

EQUIPO Y MATERIAL

Baño maría termostatado a 50 °C

Termómetro
Tubo de ensayo de 16 * 150 mm.
Probeta graduada de 10 ml.

REACTIVOS

Solución acuosa al 2 % de bilis de buey.

Bilis de buey desecada para bacteriología 2 g.
Agua destilada c.s.p. 100 ml.
Acido Clorhídrico fumante, analítico de 37% D 20/4 = 1.19

PROCEDIMIENTO :

En un tubo de ensayo colocar 4 gotas de leche, 4 gotas de solución de bilis de

buey y 3 ml de ácido clorhídrico (medido con probeta). Mezclar, colocar en baño
de maría a 50 °C exactamente durante cinco minutos.

Preparar un testigo negativo con leche cruda, fresca y pura.

Preparar un testigo positivo con la misma leche anterior a la que se le ha

adicionado sacarosa en la proporción del 0.02 %.

INTERPRETACIÓN :
 La aparición de color rojo violeta se considera POSITIVO para sacarosa
La aparición de un color rojizo tenue se considera NEGATIVO

9.3. CLORUROS.

Los cloruros se determinan corrientemente por reacción con la Ag con la que forman un
precipitado insoluble. La titulación directa de la leche con nitrato de plata y cromato potásico
como indicador da resultados que son erróneamente altos y variables. La incineración previa de
la leche lleva consigo la pérdida de cloruro por volatilización. El mejor procedimiento es la adición,
directamente a la leche, de un exceso de nitrato de plata normalizado y la titulación del exceso
con tiocianato potásico (KSCN) normalizado. Como indicador se emplea sulfato férrico amónico,
el ión Fe3+ forma con el tiocianato una sal roja.

9.3.1. MÉTODO DE SELECCIÓN

EQUIPO Y MATERIAL

Tubo de ensayo de 16 * 150 mm

Pipeta volumétrica de 5 ml
Pipeta volumétrica de 1 ml.
Frascos gotero

REACTIVOS

Solución acuosa de nitrato de plata de concentración 1.3415 g/litro

Solución acuosa de cromato de potasio al 10 % m/v.

PROCEDIMIENTO

Colocar en un tubo de ensayo 5 ml. de solución de nitrato de plata, agregar dos gotas de solución
de cromato de potasio.
Agitar y adicionar 1 ml. de leche. Mezclar.
INTERPRETACIÓN :

Si se produce una coloración rojo ladrillo, la cantidad de cloruros en la leche expresada como
cloruro de sodio es inferior a 2.3 g/litro.

Si la cantidad de cloruros en la leche, expresada como cloruro de sodio es de 2.3 g/litro de leche
o mayor, se produce inmediatamente una coloración amarillo canario. En este caso, la muestra
es sospechosa de haber sido adicionada con cloruros, por lo tanto debe efectuarse la
determinación cuantitativa.
9.3.2. MÉTODO CUANTITATIVO - DROST

EQUIPO Y MATERIAL

Erlenmeyer de 100 ml.

Pipeta volumétrica de 5 ml.
Pipeta volumétrica de 10 ml.
Pipeta volumétrica de 1 ml.
Bureta de 10 ml. con graduaciones a 0.02 ml.
Probeta graduada de 10 ml.

REACTIVOS

Acido nítrico al 25 % m/m

Solución acuosa saturada en frío de sulfato de hierro III y amonio
Solución de nitrato de plata 0.1 N.
Solución de tiocianato de amonio 0.1 N.

PROCEDIMIENTO

Colocar 10 ml. de leche en el erlenmeyer. Agregar 5 ml de ácido nítrico y 1 ml de la solución de

sulfato de hierro III y amonio, mezclar, esperar 5 minutos. Agregar 5 ml de la solución de nitrato
de plata, mezclar bien y titular inmediatamente con la solución de tiocianato de amonio agitando
vigorosamente (evitar la luz directa), hasta obtener un color pardo rojizo.

CALCULOS :

g de NaCl/litro = (5 - n)* 0.585

Donde :
n = Volumen en ml. de solución de tiocianato de amonio gastado en la titulación.
10. CONSERVANTES.

A la leche se le adicionan conservantes con el fin de retardar los procesos que causan deterioro durante
el transporte y almacenamiento. Es de notar que la legislación Colombiana no permite el uso de ninguno.

OBJETIVOS :

General :
Emplear diferentes técnicas para determinar sustancias que ayuden a retardar el deterioro de la
leche.

Específicos :
• Especificar diferentes pruebas para determinar la presencia de formaldehido, hipocloritos,
dióxido de cloro, cloraminas y agua oxigenada.

10.1. IDENTIFICACIÓN DE FORMALDEHÍDO (PRUEBA DE SELECCIÓN).

EQUIPO Y MATERIAL

1. Tubo de ensayo de vidrio refractario de 16 * 150 mm

2. Mechero

REACTIVOS

Solución acuosa de cloruro férrico al 1 %, recién preparado

Acido sulfúrico densidad 1.820 - 1.825
Solución diluida de formaldehido : Diluir 1 gota de solución de formaldehido del 38 % - 40 % en
100 ml de agua.
PROCEDIMIENTO :

Mezclar la muestra, asegurando homogeneidad.

Colocar 3 ml de la muestra en un tubo de ensayo, agregar 3 gotas de la solución de cloruro

férrico, agitar ; por las paredes del tubo agregar con cuidado, sin que la mezcle con la leche,
ácido sulfúrico en cantidad suficiente para que forme una capa de 1 a 2 cm de espesor.

INTERPRETACION :

En presencia de formaldehido aparecerá inmediatamente un anillo violeta en la interfase del ácido

y la leche.

OBSERVACIONES :

Cuando la concentración de formaldehido en la leche es alta, la prueba es menos sensible ; para

hacerla más sensible se debe hacer diluciones de la muestra con leche pura.

Preparar un testigo negativo con la leche pura fresca y un testigo positivo agregando una gota de
solución diluida de formaldehido a 5 ml de leche.

10.2. IDENTIFICACIÓN DE FORMALDEHÍDO (PRUEBA CONFIRMATORIA).

EQUIPO Y MATERIAL :

Equipo de destilación Kjeldahl con balón de 800 ml.

REACTIVOS :

Acido fosfórico R.A. de 85 %.

Acido sulfúrico de 72 %
Acido sulfúrico de 95 - 98 %
Agua destilada
Solución de sal sódica de ácido cromotrópico.
PROCEDIMIENTO :

Disolver 500 mg de sal sódica de ácido cromotrópico en 100 ml de ácido sulfúrico al 72 %, esta
solución deberá tener color pajizo claro.

Mezclar la muestra, consiguiendo su homogeneidad.

Colocar en un balón Kjeldhal 100 ml de leche y 100 ml de agua destilada, acidificar con el ácido
fosfórico, adicionar 1 ml de exceso. Conectar el condensador a través de la trampa y destilar
lentamente hasta obtener 50 ml de destilado.

En un tubo de ensayo colocar 5 ml de la solución de ácido cromotrópico, adicionar 1 ml de

destilado, mezclar, colocarlo en el baño maría hirviente, por 15 minutos, observando el color
durante el calentamiento.

INTERPRETACION :

La presencia de formaldehido está indicada por la aparición de un color púrpura claro a púrpura
profundo dependiendo de la cantidad de formaldehido presente.

10.3. IDENTIFICACIÓN DE HIPOCLORITOS-CLORAMINAS-DIÓXIDO DE CLORO.

EQUIPO Y MATERIAL :

Baño maría

REACTIVOS :
 Solución de yoduro de potasio. Disolver 7 g. de yoduro de potasio en 100 ml de agua destilada.
Preparar cuando se vaya a usar.

Acido clorhídrico diluido a 100 ml de ácido clorhídrico (36.5 a 38.5 %). Agregar 200 ml de agua
destilada.

Solución de almidón. Hervir un gramo de almidón soluble en 100 ml de agua destilada. Enfriar
antes de usar.

PROCEDIMIENTO :

PRUEBA I
Colocar 5 ml de leche en un tubo de ensayo, agregar 1.5 ml de solución de yoduro de potasio,
mezclar bien por agitación. Anotar el color de la leche.

PRUEBA II
Si no cambia el color de la leche, agregar 4 ml de ácido clorhídrico diluido, mezclar bien con una
varilla de vidrio de extremo plano y observar el color de la cuajada.

PRUEBA III
Colocar luego el tubo en baño maría calentado previamente a 88 °C y dejar en reposo 10
minutos, (durante este tiempo la cuajada sube a la superficie), enfriar rápidamente colocando el
tubo en agua fría. Anotar el color de la cuajada y el líquido.

PRUEBA IV
Agregar luego al líquido por debajo de la cuajada 0.5 a 1 ml de solución de almidón. Observar el
color inmediatamente. Determinar la concentración de cloro disponible según la tabla siguiente :
Concentración de 1000 ppm 500 ppm 200 ppm 100 ppm 50 ppm 20 ppm
cloro disponible ppm

PRUEBA I Pardo Amarillo Amarillo ------- ------- -------

Amarillento Intenso pálido difuso

PRUEBA II Pardo Amarillo Amarillo Claro ------- ------- -------

Amarillento Intenso

PRUEBA III Pardo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillento

Amarillento Intenso pálido

PRUEBA IV Azul Azul Azul Violáceo Rojo Violáceo Rojo Rojo Violáceo
Violáceo Violáceo oscuro Violáceo pálido

10.4. IDENTIFICACIÓN DE AGUA OXIGENADA

EQUIPO Y MATERIAL :

Tubos de ensayo de 16 * 150 mm.

REACTIVOS :

Solución de pentóxido de vanadio al 1 % m/v en ácido sulfúrico diluido.

El ácido sulfúrico diluido se prepara agregando cuidadosamente 6 ml de ácido sulfúrico (95 - 98
% de pureza) a 94 ml de agua.

PROCEDIMIENTO :

En un tubo de ensayo colocar 10 ml de muestra, agregar 10 a 20 gotas del reactivo. Observar el

color.
INTERPRETACION :

La aparición de un color curuba (salmón) indica la presencia de agua oxigenada.

Una coloración amarillenta igual al reactivo es negativa
Preparar un testigo negativo con leche pura fresca
Preparar un testigo positivo con leche pura y fresca adicionada de agua oxigenada.
11. NEUTRALIZANTES

OBJETIVOS :

Emplear diferentes técnicas para determinar sustancias neutralizantes en la leche.

FUNDAMENTO TEORICO :

Varios aditivos (algunos de los cuales son ilegales) aumentan la estabilidad térmica ; el NaOH y
a veces el HCl se utilizan para ajustar pH ; también puede emplearse con este fin el Na2HPO4
que generalmente proporciona una estabilidad térmica incluso mejor debido posiblemente a que
disminuye la actividad del Ca2+.

Los agentes que interfieren con los grupos tiol libres son beneficiosos ; ya se ha estudiado el
efecto de la N-etil-maleimida. La adición a la leche de 0.05 % de H2O2 antes de la evaporación
aumenta considerablemente la estabilidad de la concentrada ; la cantidad de cantidades mayores
puede ser perjudicial. Si después del precalentamiento y antes de la evaporación se añaden 0.5
- 1.0 mg de Cu2+ por kilogramo de leche generalmente se consigue una mayor estabilidad térmica
de la leche evaporada.

11.1. IDENTIFICACIÓN DE NEUTRALIZANTES (PRUEBA DE SELECCIÓN).

EQUIPO Y MATERIAL :

Tubo de ensayo de 16 * 150 mm

Pipetas graduadas de 5 ml

REACTIVOS :

Solución alcohólica de Alizarina

Disolver 0.5 g de Alizarina (C.I.Nr 58000) en 1000 ml de alcohol de 75 °G.L. neutralizado.

PROCEDIMIENTO :
 En un tubo de ensayo colocar 2 ml de la muestra bien mezclada, agregar 3 ml de la
solución de alizarina. Agitar.

INTERPRETACION

La aparición de una coloración color rojo violeta indica presuntivamente la presencia de

neutralizantes.

11.2. IDENTIFICACIÓN DE NEUTRALIZANTES (PRUEBA CONFIRMATIVA).

EQUIPO Y MATERIAL :

Tubos de ensayo de 16 / 150 mm

Mechero

REACTIVOS :

Solución acuosa de oxalato de potasio al 30 % m/v

Solución de fenolftaleína al 2 % en alcohol etílico de 95 ° G.L.

PROCEDIMIENTO :

En un tubo de ensayo colocar 5 ml de leche, calentar hasta su ebullición durante 3 minutos con
agitación. Enfriar. Agregar 5 gotas de la solución de fenolftaleina, sin agitar.

INTERPRETACION :

La coloración rosada indica la presencia de alcalinizantes en la leche. Efectuar la prueba con un

testigo negativo consistente en leche pura fresca y un testigo positivo consistente en leche pura
fresca neutralizada.
12. PRUEBA DE LA FOSFATASA.

OBJETIVO

Determinar la correcta pasteurización de la leche.

FUNDAMENTO TEÓRICO :

La fosfatasa alcalina de la leche es una fosfomonoestereasa. Se han identificado dos isoenzimas

principales, la α- y la β- fosfatasa, localizadas fundamentalmente en el plasma de la leche y en la
membrana del glóbulo graso respectivamente. La fosfatasa se encuentra ligada a la materia
grasa y desaparece en gran parte en la leche descremada. Su actividad aumenta al final de la
lactación y disminuye con la edad de la vaca. Tiene la particularidad de que en medio alcalino,
desdobla los ésteres fosfóricos con producción de fenol, el cual puede ponerse de manifiesto
mediante un colorante. En esto se basa la prueba de la fosfatasa para el control de la
pasteurización de la leche. Se inactiva a temperaturas superiores a las de destrucción de los
patógenos más termorresistentes que pueden estar presentes en la leche, como el
Micobacterium tuberculosis.

Por ello la ausencia de fosfatasa alcalina en la leche es índice de una correcta pasteurización y
garantía de libertad de gérmenes patógenos.

EQUIPO Y MATERIAL :

Tubos de ensayo de 16 * 150 mm

Tapones de caucho
Baño de maría 37 °C ± 1 °C termostatado
Pipetas de 1 ml
Pipetas de 5 ml

REACTIVOS :
 Solución Tampón :
Carbonato de calcio anhidro, 3.5 g.
Bicarbonato de sodio, 1.5 g.
Agua destilada, 1000 ml.

Substrato Tampón :
Colocar 0.15 g de p-nitrofenil fosfato disódico, en un balón volumétrico de 100 ml y
complementar a la marca con solución tampón. Este reactivo puede conservarse hasta
una semana en nevera protegida de la luz, deseche la solución si está ligeramente
coloreada.

Testigos :
• Con leche hervida por 2 minutos, agregar sustrato tampón, testigo negativo.
• Con leche cruda fresca, agregar sustrato tampón, testigo positivo.

PROCEDIMIENTO :

La muestra debe examinarse tan pronto se reciba en el laboratorio. En caso contrario debe
conservarse de 3 - 5 °C. En el momento del examen debe llevarse a la temperatura ambiente. La
muestra que presente evidencia de coloración a que está acidificada no debe someterse a
examen.

Colocar 5 ml de la solución de substrato tampón en un tubo de ensayo, tapar y llevar a 37 °C en

baño maría (aproximadamente tres minutos). Agregar 1 ml de leche, tapar y mezclar bien ;
incubar por dos horas a 37 °C. Luego retirar los tubos del baño de maría y observar
inmediatamente el color.

INTERPRETACION :

Si el color de la muestra se mantiene inalterado, la prueba es negativa para fosfatasa. Si la

muestra presenta color amarillo de intensidad variable, la prueba es positiva para fosfatasa. El
testigo positivo debe presentar coloración amarillo intenso.

13. PRUEBA DE LA PEROXIDASA

OBJETIVOS :
• Determinar la correcta pasteurización de la leche
• Establecer la presencia de agua oxigenada en la leche.

FUNDAMENTO TEÓRICO :

Su diferente sensibilidad al calor permite el control de los tratamientos térmicos a que ha sido
sometida la leche, especialmente en las zonas de temperaturas de pasteurización, también para
la fosfatasa.

Lacto-peroxidasas : se encuentra unida a las proteínas del suero y desdobla el agua oxigenada
en agua y oxígeno atómico que es aceptado por sustancias presentes en el medio como la
bencidina, la parafemilendiamina, el guayacol, etc., las cuales sirven para detectar la enzima en
la leche por medio de la “prueba de la peroxidasa”.

Se inactiva por medio de la acción del agua oxigenada, la acidez alta y la temperatura de 80 °C
durante 2.5 segundos. Se utiliza para el control de leche pasteurizada en la cual debe estar
presente a fin de tener la certeza de que a dicha leche no le fue adicionada agua oxigenada.

EQUIPO Y MATERIAL :

Tubo de ensayo de 16 * 150 mm

REACTIVOS :

Solución de Guayacol :
Guayacol, pureza al 99 % 2g
Alcohol etílico de 75 °G.L. 80 ml
Solución acuosa de fenol al 3 % 20 ml

H2O2, solución al 0.3 %, recientemente preparada

Testigos :
• leche hervida 2 minutos + guayacol, testigo negativo
• leche cruda fresca + guayacol, testigo positivo
PROCEDIMIENTO :

La muestra debe estar bien mezclada y no acidificada.

En un tubo de ensayo colocar 3 ml de leche preparada. Agregar 10 gotas de la solución de

Guayacol. Agitar. Esperar un minuto. Observar el color. Agregar 5 gotas de la solución de agua
oxigenada. Observar el color.

INTERPRETACION :

Si en el lapso comprendido entre la adición del primer reactivo y el segundo aparece coloración
curuba (salmón), indica la presencia de agua oxigenada y de peroxidasa.

Si después de la adición del segundo reactivo, aparece por debajo de la superficie de la leche un
anillo de color curuba (salmón), indica la presencia de peroxidasa. Esperar 5 minutos después de
la adición del agua oxigenada.
14. EXAMEN ORGANOLÉPTICO

Esta es la primera prueba que debe realizarse “luego de que se levantan las tapas de los tarros”

En este momento puede ser utilizado para verificar la temperatura de la leche ( lo que tiene
importancia cuando se paga premio por leche enfriada).

La “American Dairy Science Association” recomienda la siguiente escala para la clasificación de

la leche según el olor y sabor :

Grado 1º Sin crítica 1º Excelente

Grado 2º Simple y ligero a hierba 2º Buena

Grado 3º Ligero a hierba y ligeramente 3º Regular

oxidado

Grado 4º Fuerte a hierba y ligeramente 4º Mala, se aconseja

a rancio oxidado rechazar ; (tal vez aceptable
para subproductos, efectuar
resazurina 10 minutos)

Grado 5º Muy ácido, pútrido Muy mala, inaceptable.

 DIAGRAMAS DE FLUJO DE
LAS PRUEBAS MAS UTILIZADAS
TIEMPO DE REDUCCIÓN DEL AZUL DE METILENO (Ensayo de
Reductasa)

Agitar las muestras varias veces

Depositar 10 ml. de cada muestra en tubos estériles. (el intervalo entre la

agitación y la toma de muestra no debe ser mayor a 3 minutos)

Identificar cada tubo

Preparar un tubo adicional con 10 ml de cualquiera de las muestras

para monitorear la temperatura del proceso.

Transferir con una pipeta estéril a cada tubo 1 ml. de

solución de azul de metileno

Tapar los tubos

Incubar

no
Temperatura = 37 °C ?
si

Tomar los tubos e invertirlos lentamente 3 veces y registrar esta hora

como la hora inicial de la incubación

Observando los cambios de color en los tubos durante la incubación

no
Decolora la muestra ?
si

Tomar el tiempo y se reporta como T.R.A.M. (Tiempo

de Reducción del Azul de Metileno)
 PRUEBA DEL ALCOHOL

Agitar la muestra antes de realizar la

prueba

Tomar el tanque del dosificador con el tubo

hacia arriba

Tapar con el índice la perforación en la

tapa del tanque

Introducir la punta del tubo en la leche, sacarla verticalmente, darle un giro de

180 ° al aparato, con lo cual la leche tomada caerá en la copa situada en el
inferior del dosificador junto con 2 ml. de alcohol etílico de 68 - 70 % v/v/.

Mezclar la leche con el alcohol, procurando

agitar lentamente

Observar el aspecto de la
mezcla

si
Se observan grumos en las
POSITIVA paredes del frasco ?

no

NEGATIVA
DETERMINACION DE LA DENSIDAD DE 15/15°C CON
TERMOLACTODENSIMETRO

Mezclar la muestra, no dejando grumos

de grasa

Tomar el volumen necesario de leche para realizar la

determinación de la densidad

Llevar la muestra a la probeta, cuidando de no formar espuma,

hasta un volumen tal que el cuerpo del lactodensímetro quede
totalmente cubierto de leche

Introducir suavemente el lactodensímetro cuidando

de no dejar que este pegue con las paredes de la
probeta

Estimar la lectura del lactodensímetro con exactitud de 0.1

grado lactodensimétrico
 ACIDEZ

Mezclar la leche y calentarla con el fin de no

tener grumos de grasa en la muestra a
analizar

Tomar 20 ml. de muestra en un recipiente

adecuado para la titulación, agregar 5 gotas de
fenolftaleina

Agregar ml. de NaOH 0.1 N

no Se observa coloración levemente

rosada ?

si

Tomar este como el punto final de

la titulación
DETERMINACIÓN DE LA MATERIA GRASA (MÉTODO DE GERBER)

Llevar la muestra a una temperatura aproximada de 20 °C, mezclar

hasta que esté homogénea

Colocar en el butirómetro Gerber 10 ± 0.2 ml de

ácido sulfúrico

Con una pipeta de 11 ml medir la muestra de leche

debidamente preparada a no más de 24 °C

Dejar escurrir la leche lentamente por las paredes del butirómetro

para evitar la reacción con el ácido

Agregar 1 ml de alcohol isoamílico

Colocar el tapón de seguridad

Agitar el butirómetro hasta que desaparezcan las partículas

de color blanco, asegurar que el ácido que esta en el bulbo
también se mezcle

Centrifugar el butirómetro con el bulbo hacia arriba durante

5 minutos

Pasar el butirómetro con el tapón hacia el fondo a

un baño de maría a 65 °C

Después de 5 minutos, realizar la lectura en la escala y registrar este

valor como el % de grasa de la muestra
 PRUEBA DE LA FOSFATASA

Tomar 5 ml. de sustrato tampón en tubo de ensayo

Llevar a 37 °C durante 3 minutos

Agregar 1 ml de leche, tapar y mezclar

Incubar por 2 horas a 37 °C

Observar color

no
Se alteró ? Negativa

si

Positiva
 PRUEBA DE LA PEROXIDASA

Mezclar la muestra, temperatura 20 - 30 °C

Colocar en un tubo de ensayo 3 ml de leche

con 10 gotas de guayacol

Observar color

si Color curuba salmón en la

Cambia de color ?
superficie, positiva para H2O2
no

Agregar 5 gotas de H2O2

Observar color

no
Cambia de color ? Prueba negativa
si

Anillo curuba salmón debajo de la

superficie, positiva para peroxidasa
 CARACTERISTICAS Y CONDICIONES GLOBALES DE DIFERENTES TIPOS DE LECHE
SEGÚN LAS DISPOSICIONES SANITARIAS DEL MINISTERIO DE SALUD

TIPO DE LECHE DENSIDAD2 % DE GRASA3 E. S. T.4 E. S. D.5 ACIDEZ6 I. CRIOSCOPICO °C T.R.A.M. ALCOHOL
CRUDA ENTERA 1.030 - 1.033 >3% > 11.3 % > 8.3 % 0.14 - 0.19 - 0.54 > 4 Hr. Negativa
HIGIENIZADA
ENTERA 1.030 - 1.033 >3% > 11.3 % > 8.3 % 0.14 - 0.19 - 0.54 > 7 Hr. Negativa
SEMIDESCREMADA 1.031 - 1.0335 1.5 - 2.0 % > 9.8 % > 8.3 % 0.14 - 0.19 - 0.54 > 7 Hr. Negativa
...DESCREMADA 1.034 - 1.036 0.1 - 0.5 % > 8.7 % > 8.6 % 0.14 - 0.19 - 0.54 > 7 Hr. Negativa
7
POLVO HUMEDAD
ENTERA < 4.5 % > 26 % ------ ------ 1.0 - 1.3 ------ ------ Negativa
SEMIDESCREMADA < 5.0 % 12 - 15 % ------ ------ 1.2 - 1.5 ------ ------ Negativa
...DESCREMADA < 5.0 % 1.5 % ------ ------ 1.4 - 1.7 ------ ------ Negativa

2
Densidad, a 15/15 °C
3
Materia Grasa, porcentaje expresado m/m
4
Extracto Seco Total, porcentaje expresado m/m
5
Extracto Seco Desengrasado, porcentaje expresado m/m
6
Acidez expresada como porcentaje de ácido láctico
7
Humedad, expresada en m/m