Trabajo Práctico N° 1: LECHE.

CONTROL DE CALIDAD
Propósito : Conocer los diferentes ensayos para el control de calidad las leches. Revisión del
C.A.A. registro de los valores normales y comparación con los obtenidos en la practica
Contenidos : Ensayo extracto seco. Acidéz titulable. pH. Densidad. Catalaza.
Lugar de realización: Laboratorio del ITA, Sede Capital. Laboratorio Química y Microbiología-
Sede Aimogasta. Crédito Horario : 4 hs.
Actividad: Análisis de laboratorio

Leche
Parte II

Análisis microbiológico de la leche

Prueba de la Reductasa (Reducción del Tiosanato de azul de metileno)

Se basa en la observación del cambio de color que sufre el azul de metileno, las bacterias
decolorarán el azul de metileno al cabo de cierto tiempo, y devolverán a la leche su color blanco
primitivo. El tiempo que requiere este cambio depende del número de bacterias, del consumo de
oxigeno y de la multiplicación de dichas bacterias.
Este método de reducción del azul de metileno mide indirectamente la actividad de los
microorganismos. Los diferentes intervalos o tiempo de reducción del azul de metileno permiten la
clasificación rápida de las muestras en clases: A, B, y C.
En el caso de utilizar pipetas de vidrio, para medir tanto la leche como la solución de azul de
metileno, se incluirá algodón hidrófilo dentro del extremo superior de la misma (extremo de
aspiración).
La temperatura de incubación. Se ha elegido la temperatura de 37oC porque a mayor o menor
temperatura se ha observado que la reducción es más rápida, a mayores temperaturas, en general,
se aceleran las reacciones químicas y se provoca eliminación de oxígeno.

Reactivo

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Prof.Titular: Ing. Sergio Manuel Moreno; Prof.Adj.: Ing. Viviana Noemi Maldonado; Prof.J.T.P.:Ing. Gerardo Calvo
Carrera: Ingeniería en Alimentos
CATEDRA: Tecnología Alimenticia II

- Azul de metileno.

Instrumentos:
• Tubos de ensayo (estéril)
• Recipiente para muestra de leche (estéril)
• Pipeta de 1 mL (estéril)
• Pipetas de 10 mL (estéril)
• Gradillas
• Baño de agua termostatizado.

Procedimiento:
Rotular los tubos de ensayo esteriles para identificar las muestras.
Agregar en los tubos de ensayo 10 mL de leche.
Agregar 1 mL de solución de azul de metileno.
Sellar el tubo de ensayo (con parafilm, tapones de goma o rosca)
Se mezclan ambos líquidos, volteándolos con suavidad.
Se Introducen en el baño María y se ajusta la temperatura del equipo, hasta que el agua esté entre
36°C y 37°C
Se observan a intervalos regulares las variaciones de color que pudiera sufrir la muestra, y se anota
el tiempo que tarda en producirse la decoloración.

Resultados:
El resultado de la prueba depende de la fase de crecimiento de las bacterias presentes en el
momento de hacer la prueba.
Un tiempo de reducción muy corto indica descuido en la producción de leche. Malas prácticas de
ordeño, uso de utensilios (baldes, porta filtro, pichingas) mal lavados y desinfectados, falta de
enfriamiento a temperaturas favorables para el crecimiento de microorganismos.
Cuanto más rica sea la leche en microorganismo, más rápido se efectuará la decoloración. Por
tanto, se podría establecer una correlación entre el tiempo transcurrido en completarse la
decoloración y el número de microorganismos presentes.
La prueba de la Reductasa, es por consiguiente, una prueba destinada a establecer el grado de
conservación de la leche, más que una forma precisa de estimar el número total de
microorganismos.
Realizar los controles y tomar nota de las decoloraciones, cuando se ha decolorado las dos terceras
partes del tubo se considera éste decolorado.

Comparar los resultados con la tabla.

Tiempo de decoloración Calidad de la leche

De 5 a 6.5 horas A (Leche Excelente)
De 4 a 4.5 horas B (Leche Buena)
De 1 a 3.5 horas C (Leche Mala)

Estos tiempos de reductasa están basados en leche caliente (30 a 33oC), ósea, leche que está
recibiendo el centro de acopio o la planta llegada desde las fincas después de realizado el ordeño,
en este caso no se hace mención del tiempo de decoloración de la leche fría (4oC), la cual está
basada o dada por la empresa compradora de dicha leche.

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PRUEBA DEL ALCOHOL

Fundamento
Cuando se añade a la leche una cierta cantidad de alcohol etílico se produce una deshidratación,
parcial o total, de ciertos coloides hidrófilos, que puede desembocar en su desnaturalización, y con
ello a la pérdida de su equilibrio y floculación. Este resultado sólo se alcanza con un cierto grado
alcohólico de la mezcla final, por debajo del cual las leches térmicamente estables no floculan,
mientras que la leche anormal, esto es la térmicamente inestable, flocula. Todo sucede como si
existiera un paralelismo entre la resistencia al calentamiento y la estabilidad en presencia del
alcohol. Es posible, por consiguiente, traducir en grado alcohólico la resistencia necesaria a un
procedimiento dado de calentamiento. Por lo que todas las leches estables en presencia de esta
cantidad de alcohol resistirán el calentamiento correspondiente.
Basándose en este principio se ha ideado un método simple de control o de selección, que consiste
en mezclar de golpe volúmenes iguales de leche cruda y de una solución acuosa de alcohol etílico
de concentración conocida. La elección de esta última varía según la modalidad de calentamiento
(pasterización, esterilización, etc.) a que ha de someterse la leche. La mezcla se agita en frío y se
observa, preferentemente después de haberla extendido sobre una superficie de color oscuro o
negra. Si no se produce floculación alguna, la leche resistirá perfectamente el calentamiento
correspondiente al grado de la solución alcohólica. Si se observa floculación, la leche no se
mantendrá estable durante el calentamiento. La concentración de la solución alcohólica,
generalmente fijada a 68% cuando se ensayan leches para la pasterización, y debe elevarse hasta
72° o más (a veces hasta 74°) cuando se trata de seleccionar leches para la esterilización. La mayor
frecuencia de reacciones positivas con leche normal, excluye el empleo de etanol más concentrado
para realizar esta prueba.
Material
• Pipetas de 2 mL y de 5 mL.
• Tubos de ensayo de 10 mL.

Reactivos
• Alcohol de 68° (se prepara llevando 72 mL de alcohol etílico neutralizado de 95° hasta 100
mL con agua destilada).
• Alcohol de 72° (se prepara llevando 76 mL de alcohol etílico neutralizado de 95° hasta 100
mL con agua destilada).
Procedimiento
• Poner en dos tubos de ensayo 2 mL de leche y añadir 4 mL de alcohol a 68° y de alcohol
72°, respectivamente.
• Una vez cerrado invertir varias veces el tubo de ensayo para permitir una buena
homogenización de la muestra.

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Observaciones e Interpretación
Las leches ácidas inestables en presencia de calor, se coagulan en la prueba del alcohol. Las leches
con un equilibrio salino incorrecto o al menos la mayoría de éstas, se coagulan en las mismas
condiciones. Conviene sin embargo, subrayar que el paralelismo entre la estabilidad térmica y la
inestabilidad en presencia del alcohol sólo se da en el caso de leches cuyo equilibrio salino queda
destruido por un exceso de cationes (particularmente leches demasiado ricas en calcio). En cambio,
las leches cuya inestabilidad térmica depende de un exceso de aniones se mantienen estables en la
prueba del alcohol, pero estas leches son sumamente raras y en la práctica puede utilizarse esta
prueba para eliminar aquellas con un equilibrio salino incorrecto. Las leches que contienen un
exceso de albúmina por causas fisiológicas (como por ejemplo los calostros) ó patógenas (en el
caso de las mastitis), se coagulan siempre cuando se les añade alcohol, incluso cuando su equilibrio
ácido-base es normal y cuando no han sufrido fermentación láctea.
Aunque no existe siempre una correspondencia absoluta entre la inestabilidad térmica y la
inestabilidad al alcohol (ya que se trata de procesos diferentes), esta prueba permite descubrir una
gran mayoría de las leches que no podrían soportar el calentamiento en general ni la esterilización
en particular, ya que incluso algunas muestras de leche fresca, normales en todos los aspectos dan a
veces un resultado positivo

Determinación de aerobios mesófilos.

Obtener la alícuota analítica de 1mL para siembra directa y si se requiere realizar diluciones medir
11 mL y diluir en 99 mL de Agua Peptona esteril.
Agregar 15 a 20 mL de agar Plate Count previamente fundido y mantenido a 47°C ± 2°C.
Mezclar 5 veces siguiendo la dirección de las manecillas del reloj, 5 veces con movimientos
horizontales, 5 veces con movimientos contrario a las manecillas del reloj y finalmente 5 veces con
movimientos verticales).
Una vez solidificado el agar, invertir rápidamente las placas.
Incubar a 37°C ± 1°C por 48 horas.
Recuento:

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Si los recuentos de las placas de dos diluciones consecutivas caen dentro del rango
25-250 colonias calcular el RAM según la siguiente fórmula:

N= ΣC
[ ( 1 x n1 ) + ( 0.1 x n2 ) ] x d
donde :
N= número de colonias por ml o g de producto
Σ C = suma de todas las colonias contadas en todas las placas
n1 = número de placas contadas de la menor dilución.
n2 = número de placas contadas de la dilución consecutiva.
d= dilución de la cuál fué obtenido el primer recuento

Ejemplo
1 : 100 1 :1000
232 y 244 33 y 28

N = 232 + 244 + 33 + 28
[( 1 x 2 )+( 0.1 x 2 )] x 0,01
= 537
0.022
= 24.409
= 24000
Cuando los recuentos de las placas en duplicado caen tanto dentro como fuera del rango 25-250
colonias, usar sólo aquellos recuentos que estén dentro de este rango.

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Determinación de contaminación por Coniformes.

Los métodos utilizados en la determinación de E. coli, coliformes totales y coliformes fecales
como microorganismos indicadores de la calidad sanitaria de agua o como indicador de las
condiciones sanitarias en el procesamiento de alimentos, se basan en la fermentación de la
lactosa. El método de número más probable NMP, es un método estadístico, compuesto por una
etapa presuntiva y una confirmativa. El ensayo consiste en sembrar diluciones seriadas de la
muestra en medios líquidos, basándose en la combinación de tubos positivos se puede estimar el
número de microorganismos presentes por gramo de alimento, con el uso de la tabla estadística
aportada por la referencia.

MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS

Equipos
Estufa de cultivo a 37o ± 1oC
Baño de agua termorregulado a 45,5o ± 0,2o C con agitación y con cubierta

Materiales
Termometro
Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 mL
Placas Petri de 100 mm de diámetro
Botellas de dilución con capacidad para 100 mL, de vidrio borosilicato con tapas
herméticas
Tubos de fermentación de 18 x 180 mm y 16 x 160 mm
Asa de 3 mm de diámetro

Medios de cultivo y reactivos

Caldo Mac Conkey
Caldo Bilis Verde Brillante 2% (BVB)
Caldo EC
Agua Peptonada 0,1%

Procedimiento
Para preparar las diluciones, con una pipeta estéril tomar una alícuota de 1 mL de la muestra
original y llevarlo a uno de los tubos conteniendo 9 mL de agua de dilución estéril, obteniendo de
esta manera una dilución de 10-1.
Agitar el tubo de la dilución 10 -1 ,tomar una alícuota de 1 mL de esta nueva dilución y llevarlo a
otro tubo con 9 mL de agua de dilución estéril para obtener una dilución de 10-2
Proceder de la misma manera hasta obtener una dilución de 10-3o hasta donde sea necesario.
Inocular asépticamente con 1 mL de muestra por triplicado, tubos de fermentación conteniendo
caldo lactosado o caldo lauril triptosa, a partir de las últimas 3 diluciones por triplicado y
conservar todas las anteriores en refrigeración por si se requiere su utilización posterior.
Incubar todos los tubos a una temperatura de 37 °C durante 24horas.
Después de 24 horas de incubación efectuar una primera lectura para observar si hay tubos
positivos, es decir, con producción de ácido, si el medio contiene un indicador de pH, turbidez y
producción de gas en el interior de la campana Durham

Cálculos:
Determinar el NMP a partir de las lecturas positivas.

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Ejemplo de procedimiento de NMP en muestras liquidas

Calcular el recuento de bacterias y observar los distintos fenotipos de colonia crecidos en el agar
MRS.

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