1.

ANÁLISIS MICROBIOLOGICOS DE IMPORTANCIA EN CALIDAD DE

PRODUCCION DE LECHE

1.1. RECUENTO TOTAL DE BACTERIAS MESOFILAS AEROBIAS EN LECHE

1.1.1. Objeto
Esta técnica describe el método de recuento en placa (SPC), para
determinar el número de microorganismos aerobios mesófilos en leche.

1.1.2. Principio
Es el método utilizado para la determinación del número de unidades
formadoras de colonia (UFC) o células viables en leche

1.1.3. Equipos y Materiales

• Cabina de flujo laminar o cuarto estéril
• Incubadora a 35°C ± 2°C
• Baño de agua o incubadora de 45 a 50°C
• Contador de colonias
• Frascos de dilución aforados a 99 ml
• Cajas de Petri estériles
• Tubos de ensayo tapa rosca de 20 x 180 mm
• Pipetas volumétricas tipo A de 1 ml, 10 ml, y 11 ml estériles
• Gradillas
• Agar Plate Count (Agar peptona de caseína glucosa extracto de
levadura)
• Nevera para mantener las muestras entre 0 y 4°C
1.1.4. Reactivos
• Agua peptonada al 0.1% estéril

1.1.5. Preparación de la muestra

Elaborar una suspensión homogénea de leche conservada a 4°C que
permita la preparación de las diluciones que serán utilizadas en los
métodos de recuento.

Antes de abrir el recipiente que contiene la muestra quitar toda sustancia

que pueda contaminarla. Opcionalmente, limpiar el recipiente con una toalla
o gasa estéril saturada con alcohol etílico al 96%. El intervalo entre mezcla
y la toma de la muestra no debe ser mayor de 3 minutos.

1.1.6. Procedimiento
Preparar una dilución 10-1 con una pipeta estéril, transfiera 11 ml de la muestra a un
frasco que contenga 99 ml de agua peptonada al 0.1%. agitar vigorosamente el frasco.

Preparar una dilución 10-2 transfiriendo 1 ml de la dilución 10-1 a un tubo que

contenga 9 ml de agua peptonada al 0.1%. Agitar cuidadosamente.
Preparar una dilución 10-3 transfiriendo 1 ml de la dilución 10-2 a un tubo que
contenga 9 ml de agua peptonada al 0.1%. Agitar cuidadosamente.

Repetir estos pasos hasta obtener el numero de diluciones necesarias según el criterio
establecido para cada una de las muestras. Siempre se deben sembrar un mínimo de
3 diluciones consecutivas en caja de Petri estériles.

Verter en las cajas de Petri, 15 ml de Agar Plate Count fundido y mantenido a 45°C.
Mezclar el inoculo con el medio de cultivo fundido. No debe transcurrir más de 20
minutos entre la realización de las diluciones y el vertido del medio. La manera más
indicada de mezclar el inoculo con el medio es la siguiente:
Mover la caja hacia arriba y hacia abajo 5 veces.
Rotar la caja 5 veces en el sentido de las agujas del reloj.
Mover la caja 5 veces haciendo ángulo recto sobre el movimiento.
Rotar la caja 5 veces en el sentido contrario de las agujas del reloj.
Hacer control de esterilidad del medio de cultivo incubando una caja que contenga
Agar Plate Count.
Hacer control de esterilidad del agua peptonada al 0.1% incubando una caja que
contenga agua peptonada y Agar Plate Count.

Una vez solidificado el medio de cultivo invertir las cajas e incubarlas a 35°C ± 2°C
durante un tiempo de 48 horas.

1.1.7. Cálculos, Presentación e interpretación de resultados

Seleccionar las dos cajas correspondientes a la misma dilución que presenten

entre 30 y 300 ufc, contar las de cada caja, hallar el promedio aritmético y multiplicar
por el recíproco del factor de dilución usada. El dato se reporta como Recuento de
Mesófilos aerobios ufc/ml.

Si las cajas de diluciones consecutivas tiene recuentos entre 30 y 300 ufc se deben
contar las 4 cajas, calcular el recuento por ml para cada dilución usada e informar el
promedio aritmético como el para cada una de las cajas, a menos que el recuento
mayor contenga dos veces al menor, caso en el que entonces se reporta el recuento
menor.

Si no hay colonias en las cajas correspondientes a la dilución de mayor concentración,

informar el recuento como menor de 1, multiplicado por el factor de dilución mas
concentrado realizado.

Si el número de colonias por placa excede a 300, contar las colonias en aquella parte
de la placa que sea mas representativa de la distribución de colonias. Si hay menos de
10 colonias por cm2 contar las colonias en 13 cuadrados seleccionando 7 cuadrados
horizontales y 6 cuadrados verticales. Si la placa tiene 65 cm2 , la suma de las
colonias en los 13 cuadrados representativos por 5 da el número estimado de colonias
por placa. Si hay mas de 10 colonias por cm2 contar las colonias en cuatro cuadrados
representativos y multiplicar el promedio de colonias por cm2 por el factor de 65 cm2
area de la caja. Si se usan cajas de tamaño diferente, debe hallar el diámetro real y
usar ese factor de multiplicación para el cálculo de recuento.
No debe informar el recuento de placas sobrepobladas a partir de la dilución más alta
como incontables. Si el recuento es mayor de 100 colonias por cm2 informar como
mayor de 6.500 veces la dilución más alta, como recuento estimado.

2. RECUENTO DE BACTERIAS PSICROTROFAS

2.1 Objeto
Esta técnica describe el método de Recuento en Placa(SPC) para determinar el
número de microorganismos psicrotrofos en leche.

Principio

Es el método utilizado para determinar el numero de unidades formadoras de colonias

ufc / ml de leche.

2.2 Definición

Los microorganismos psicrotrofos se definen como aquellos capaces de crecer

relativamente rápido a 7|°C ó menos, sin hacer referencia a la temperatura óptima de
crecimiento, en productos lácteos. Su número en la leche depende de las condiciones
higiénicas en el hato, la temperatura y tiempo de almacenamiento antes del
procesamiento.
Responsables del daño en la leche en almacenamiento prolongado.

2.3 Equipos y Materiales

• Cabina de flujo laminar o cuarto estéril
• Incubadora a 7°C ± 2°C
• Baño de agua o incubadora de 45 - 46°C
• Contador de colonias
• Frascos de dilución aforados a 99 ml
• Cajas de Petri estériles
• Tubos de ensayo tapa rosca de 20 x 180 mm
• Pipetas volumétricas tipo A de 1 ml, 10 ml, y 11 ml estériles
• Gradillas
• Agar Plate Count (Agar peptona de caseína glucosa extracto de levadura)
• Nevera para mantener las muestras entre 0 y 4°C

2.4 Reactivos
• Agua peptonada al 0.1% estéril

2.5 Preparación de la muestra

Elaborar una suspensión homogénea de leche conservada a 4°C que permita la
preparación de las diluciones que serán utilizadas en los métodos de recuento.

Antes de abrir el recipiente que contiene la muestra quitar toda sustancia que pueda
contaminarla. Opcionalmente, limpiar el recipiente con una toalla o gasa estéril
saturada con alcohol etílico al 96%. El intervalo entre mezcla y la toma de la muestra
no debe ser mayor de 3 minutos.
2.6 Procedimiento
Preparar una dilución 10-1 con una pipeta estéril, transfiera 11 ml de la muestra a un
frasco que contenga 99 ml de agua peptonada al 0.1%. agitar vigorosamente el frasco.

Preparar una dilución 10-2 transfiriendo 1 ml de la dilución 10-1 a un tubo que

contenga 9 ml de agua peptonada al 0.1%. Agitar cuidadosamente.

Preparar una dilución 10-3 transfiriendo 1 ml de la dilución 10-2 a un tubo que

contenga 9 ml de agua peptonada al 0.1%. Agitar cuidadosamente.

Repetir estos pasos hasta obtener el numero de diluciones necesarias según el criterio
establecido para cada una de las muestras. Siempre se deben sembrar un mínimo de
3 diluciones consecutivas en caja de Petri estériles.

Verter en las cajas de Petri, 15 ml de Agar Plate Count fundido y mantenido a 45°C, es
de especial importancia la temperatura de servido del medio de cultivo dada la gran
sensibilidad a temperatura de microorganismos psicrotrofos. Mezclar el inoculo con el
medio de cultivo fundido. No debe transcurrir más de 20 minutos entre la realización
de las diluciones y el vertido del medio. La manera más indicada de mezclar el inoculo
con el medio es la siguiente:
Mover la caja hacia arriba y hacia abajo 5 veces.
Rotar la caja 5 veces en el sentido de las agujas del reloj.
Mover la caja 5 veces haciendo ángulo recto sobre el movimiento.
Rotar la caja 5 veces en el sentido contrario de las agujas del reloj.
Hacer control de esterilidad del medio de cultivo incubando una caja que contenga
Agar Plate Count.
Hacer control de esterilidad del agua peptonada al 0.1% incubando una caja que
contenga agua peptonada y Agar Plate Count.

Una vez solidificado el medio de cultivo invertir las cajas e incubarlas a 7°C ± 2°C por
10 dias.

Cálculos e interpretación de resultados

Para este efecto aplique de la misma manera que para el recuento de
mesófilos aerobios.

BIBLIOGRAFIA

Equipo regional de Fomento y capacitación en lechería para América Latina. FAO

Manual de Métodos de Análisis Microbiológicos. 1984

SISLAC Sistema Nacional de Análisis de Leche fresca. Manual de análisis de leche

para pago por calidad. 2.005

Ministerio de Salud INVIMA Manual de Técnicas de análisis para el control

microbiológico de Alimentos para consumo humano. 1.998.