INMUNOHISTOQUIMICAS

INMUNOFLUORESCENCIA
 REACCIONES
INMUNOHISTOLOGICAS

Los anticuerpos unidos a colorantes fluorescentes

o enzimas con sustratos cromogénicos (ELISA) se
pueden usar para visualizar un antígeno
microbiano en estado libre o dentro de los tejidos.

Es posible aumentar la sensibilidad del método y

adaptarlo para la detección de anticuerpos,
marcando un segundo anticuerpo en una prueba
indirecta. Ejemplo, demostrar la presencia de
anticuerpos contra Treponema pallidum.
 INMUNOFLUORESCENCIA

La inmunofluorescencias una técnica muy utilizada para detectar

autoanticuerpos y anticuerpos frente a antígenos tisulares y
celulares.

La utilización de cortes tisulares (que contiene gran número de

antígenos) permite identificar anticuerpos frente a varios antígenos
diferentes.

La inmunofluorescencia permite detectar Ag in situ. En primer

lugar se corta una sección de un bloque de tejido congelado a
temperaturas muy bajas en un criostato. La refrigeración impide
que los Ag lábiles sean dañados por los fijadores.
 INMUNOFLUORESCENCIA
DIRECTA

Se cubre la sección con una gota de disolución de Ag fluorescente, se

incuba y se lava.
Los Ab fijados pueden ser visualizados mediante microscopía; al iluminar
la sección con luz Uv procedente del objetivo del fondo del campo queda
oscuro, mientras que las zonas a las que se ha unido el Ab presenta una
fluorescencia verde.
 INMUNOFLUORESCENCIA
INDIRECTA

Se aplica un Ab a la sección, y
luego este Ab se visualiza
mediante la utilización de una
antiinmunoglobulina conjugada
con una molécula fluorescente.
 INMUNOFLUORESCENCIA
INDIRECTA AMPLIFICADA POR EL COMPLEMENTO

Se basa en el método indirecto para la detección de Ab que fijan el

complemento. En el segundo paso se añade complemento fresco, que
queda fijado alrededor de las zonas a las que se ha unido el Ab. El Ab
induce la unión de moléculas C3b a la sección, estas moléculas de C3b
pueden ser visualizadas mediante anti-C3b marcado con fluoresceína.
APLICACIONES
PRUEBA DE ANTICUERPOS ANTITREPONÉMICOS
FLUORESCENTES (FTA)

La prueba de FTA es un ejemplo del uso de un antígeno marcado con

colorante fluorescente (Treponema pallidiun marcado con fluoreceina), para
detectar la presencia de anticuerpos antitreponémicos en el suero del
paciente.
PNEUMOSLIDE multitest de inmunofluorescencia para detectar
simultáneamente las bacterias y virus más frecuentemente asociados a las
infecciones respiratorias en humanos.
Puede investigar en forma independiente las IgM o IgG.
 APLICACIONES
Anticuerpos anti-Toxoplasma
gondi.

Virus respiratorios.
Virus Influenza B Deteccion
de antigenos
ANTICUERPOS ANTI
TRYPANOSOMA CRUZI
(ENFERMEDAD DE CHAGAS)
 APLICACIONES IFI
IFI es utilizada en los estudios de autoinmunidad
La técnica se basa en el reconocimiento de los anticuerpos que reconocen
estructuras antigénicas celulares nativas.
La interacción se evidencia por medio de un anticuerpo antiinmunoglobulina
humana, producido en conejo, cabra o cobayo, dirigido contra las fracciones
constantes (Fc) de las inmunoglobulinas IgG, IgA y/o IgM.
Este anticuerpo antiinmunoglobulina humano está conjugado o acoplado a un
fluoróforo (generalmente isotiocianato de fluoresceína [FITC]).
Los resultados del reconocimiento de los antígenos por los autoanticuerpos
presentes en el suero, plasma o cualquier otro líquido, se evalúan en un
microscopio de fluorescencia.
 APLICACIONES IFI
La IFI se utiliza en los estudios de autoinmunidad para la detección de
anticuerpos anti-DNA de doble cadena (DNAcd) o DNA nativo (DNAn)
utilizando como sustrato Crithidia luciliae.
Para la detección de anticuerpos que reconocen antígenos nucleares se utilizan
como sustratos líneas celulares epiteliales humanas como las células HEp-2 o
las células HeLa.
En el caso de los anticuerpos contra componentes de los gránulos primarios y
específicos de los polimorfonucleares o anticuerpos anticitoplasma de
neutrófilos (ANCA), se utilizan neutrófilos fijados con etanol y formalina
Para los anticuerpos que reconocen antígenos órgano-específicos, se utilizan
como sustratos cortes de tejidos específicos (v. g. tiroides, esófago, estómago,
glándulas suprarrenales, glándulas salivales, etc.).
 ANA
Los ANA son los marcadores
serologicos mas caracteristicos
de padecimientos reumaticos y
no reumaticos de las
enfermedades del tejido
conjuntivo lo que evidencia una
respuesta inmune dirigida
contra lo propio

Los anticuerpos fluorescentes

revelan los ANA de un paciente
con LES
Patrones de tinción IF por ANA
 ANA
Patrón nucleolar

Patrón homogéneo

Patrón moteado

Patrón periférico
ANA
 Anticuerpos antinucleares
ANA
La identificación y cuantificación ANA) incluye antígenos que se localizan en
el núcleo de células HEp-2 y antígenos del citoplasma
Se usa células HEp-2 como sustrato porque tienen:
Un núcleo más grande de lo normal debido a su gran cantidad de antígenos
nucleares (masás de 46 cromosomas, más de 3 nucleolos, abundantes
ribonucleoproteínas, etc.)
Un citoplasma (mitocondrias, lisosomas, ribosomas, etc.) lo que permite hacer
una fácil detección e identificación de los antígenos reconocidos por los
autoanticuerpos presentes en los sueros de los pacientes con enfermedades
autoinmunes.
Por ser una línea celular muy activa, se pueden observar todas las fases del
ciclo celular en los cultivos, con lo que se facilita la identificación de
antígenos presentes solo en las fases de división, como los centrómeros o
aquellos conocidos como proliferating cell nuclear antigens (PCNA)
Antígenos reconocidos por los
autoanticuerpos ANA
Patrón Antígeno
Homogéneo DNAcd, histonas, Ku
Nuclear Moteado grueso RNP, Sm, Scl-70, SSB, RNA
Perinuclear DNAcd, DNAcs
Ciclo celular Nucleolar RNA, RNP
Citoplásmico SSA, Clatrina
Mitocondriales, fosfolípidos de la
Mitocondrial
Citoplásmico mitocondria
Filamentos
Vimentina, actina, desmina, etc.
intermedios

DNAcd: DNA de cadena doble;

DNAcs: DNA de cadena sencilla;
RNP: ribonucleoproteínas.
 Anticuerpos anticitoplasma
del neutrófilo ANCA
La IFI se utiliza también como prueba de tamizado inicial
Se observan los 3 patrones de tinción que se relacionan con manifestaciones
clínicas de autoinmunidad., estos son:
El citoplásmico o cANCA,
El perinuclear o pANCA y
El atípico o xANCA.
El patrón cANCA se caracteriza por presentar una tinción citoplásmica en
neutrófilos fijados con etanol o acetona. Los anticuerpos que dan el patrón
cANCA reconocen proteínas débilmente catiónicas o neutras como la
proteinasa-3 (PR-3) y la proteína catiónica de 57kDa (CAP-57), las cuales se
liberan de los gránulos específicos por el tratamiento de las células con alcohol
o acetona y se distribuyen de manera homogénea en el citoplasma de los
neutrófilos
USOS
 USO
LES
LES inducido por
medicamentos
Esclerosis múltiple
Enfermedad mixta del
colágeno
Hepatitis autoinmune
Anticuerpos anticitoplasma
del neutrófilo ANCA
El citoplásmico o cANCA,
Se caracteriza por presentar una tinción
citoplásmica en neutrófilos fijados con
etanol o acetona.
Los anticuerpos que dan el patrón cANCA
reconocen proteínas -3 (PR-3) y la proteína
57kDa (CAP-57)
Las cuales se liberan de los gránulos
específicos por el tratamiento de las células
con alcohol o acetona
Se distribuyen de manera homogénea en el
citoplasma de los neutrófilos
 Anticuerpos anticitoplasma
del neutrófilo ANCA
PEl perinuclear o pANCA y
A. Los anticuerpos que reconocen las proteínas fuertemente catiónicas
mieloperoxidasa (MPO) elastasa y azuricidina dan el patrón periférico
del núcleo en neutrófilos fijados con alcohol o acetona.
B) Estos mismos anticuerpos cuando se prueban en neutrófilos fijados
con formalina dan un patrón citoplásmico.
Anticuerpos anticitoplasma
del neutrófilo ANCA
Patrón xANCA o atípico.
Los anticuerpos que reconocen las
proteínas catepsina G, lisozima y
lactoferrina dan el patrón xANCA
o atípico en neutrófilos fijados con
alcohol, acetona o formalina.
Anticuerpos órgano específico
Mediante IFI se identifica la reactividad de los autoanticuerpos presentes en
las muestras de pacientes con enfermedades autoinmunes, los cuales
reconocen antígenos específicos de determinados órganos.
Para la detección de anticuerpos órgano específico, se emplean laminillas que
contienen cortes de tejidos de órganos, en su mayoría de primates.
Cortes de glándulas adrenales, músculo cardiaco, esófago (para identificar
anticuerpos antiendomisio)
Corte de riñón (para identificar anticuerpos antimembrana basal glomerular)
Corte de páncreas (para identificar anticuerpos anticélulas de los islotes
pancreáticos).
Anticuerpos órgano específico

Marcaje del citoplasma de las células

del córtex adrenal, mediante
inmunofluorescencia indirecta sobre
glándula adrenal de mono

inmunofluorescencia indirecta sobre

riñón de rata: fluorescencia granular
de la mitocondria en el citoplasma de
las células de los túbulos renales
AMA
Los AMA están presentes en el suero
de aproximadamente el 90-95% de
pacientes con cirrosis biliar primaria