¡Bienvenidos!

Unidad Didáctica N. 4
1. VIRUS DE INMUNOIDEFICIENCIA ADQUIRIDO: Diagnóstico, monitoreo y genotiicación
VIH/SIDA
 FAMILIA RETROVIRUS

ONCOVIRUS LENTIVIRUS ESPUMAVIRUS

(Virus ARN tumorales ) (Virus lentos)

TIPO B TIPO C VIH 1 (HTLV III) No asociados

Virus de HTLV I VIH 2 (HTLV IV) con enfermedad
tumor HTLV II VIS específica
mamario VIF
ratón
El VIH consiste de cuatro partes
principales:
1. El material genético del VIH consiste de
dos moléculas idénticas de ARN (ácido
ribonucleíco)
2. capas de proteína, donde hay dos
capas: una capa interna en forma de
almendra llamada cápsula que rodea el
material genético y una externa llamada
matriz;
3. una envoltura, hecha de lípidos y
proteína, que rodea al virus; y
4. enzimas que ayudan al virus a infectar a
la célula y construir nuevos virus
 VIH GENES Y SU FUNCIÓN
TRES GRUPOS DE GENES
ESTRUCTURALES
•env: Glucoproteìnas de
transmembrana y superficie
•pol: transcriptasa reversa, integrasa y
proteasa
•gag: antígeno de grupo, proteínas de
matriz y cápside
GENES REGULADORES :
• tat : regulador de expresión viral
• rev : regulador expresión mRNA
• vif: incrementa la infectividad viral
• vpr: replicación viral
• vpu (VIH-1) : liberación viral
• Vpx( VIH-2) : infectividad viral
• nef : regulador inmunológico.
CICLO DE VIDA
DEL VIH

Entrada del VIH en una célula CD4 mediante el correceptor CCR5 . Imagen: US
National Institutes of Health
Patogenia de
la infección
VIH
HISTORIA
NATURAL
DEL
VIH
 CARGA VIRAL PARA EL VIH-1

La carga viral es el término empleado

para referirse a la cantidad de VIH en
sangre. Cuanto más virus haya en ese
fluido (y por tanto, mayor sea la carga
viral), más rápido disminuirá el recuento
de células CD4 y mayor será el riesgo de
enfermar.
EPIDEMIA DEL VIH
VIH EN EL MUNDO
VIH EN AMERICA LATINA
RETOS PARA EL CONTROL DE LA INFECCIÓN POR EL VIH
EPIDEMIA DEL VIH EN EL PERÚ
CASOS DE SIDA: VÍA DE TRANSMISIÓN
1983 - 2017
Continuo de la atención en PVV 2016-Perú

70000 : PVV
53750 (77%): PVV diagnosticados
42509 (61%): PVV en TARV
24377(35%): PVV con Supresión Viral
 TRANSMISION del VIH
 Contacto sexual
 Compartir agujas o jeringas
(drogadictos)
 Transfusión sanguínea
 Transmisión vertical (antes o durante el
nacimiento) 20-40%
 Lactancia materna
 Riesgo profesional de infección VIH
 Tras pinchazo accidental 0.3%

 Tras contaminación de mucosas

0’09%

 La transmisión del personal sanitario

a los pacientes es excepcional
Prevenir
DIAGNOSTICO DEL VIH
PRUEBAS DE TAMIZAJE

ENZIMOINMUNO ENSAYO (ELISA)

INMUNOCROMATOGRAFIA (PRUEBAS RÁPIDAS)

PRUEBAS CONFIRMATORIAS

WESTERN BLOT
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
INMUNOENSAYO EN LINEA
PCR ADN CUALITATIVO
 PRUEBAS DE LABORATORIO
• Métodos Directos:
Evidencian/cuantifican la
presencia de antígenos
en la muestra.
– PCR cualitativa,
– PCR cuantificada
– cultivo y aislamiento viral,
– antigenemia P-24)
 PRUEBAS DE LABORATORIO

• Métodos Indirectos:
– Evidencian la presencia o
ausencia de anticuerpos
totales en la muestra.
– Son los más utilizados.
• Pruebas rápidas
• ELISA
 Diagnóstico de VIH
 Se usan dos niveles de prueba :
 Pruebas de Tamizaje: serológicas
 Ensayos inmunoenzimáticos
 Test de aglutinación
 Test de detección rápida
 Tienen alta sensibilidad.
 La posibilidad de tener falsos negativos es bajo.
 Pruebas rápidas disponibles en el mercado

Multispot
HIV-1/HIV-
Uni-Gold 2
Recombigen

OraQuick
Advance

Reveal
G2
 INMUNOCROMATOGRAFÍA

Flujo lateral en el dispositivo

Control
Antígeno
de VIH

- CORE HIV
PRINCIPIO: Flujo a lo largo de un dispositivo

Añadir
Línea de Línea de
Muestra Conjugado control
prueba

Anticuerpos a IgG Oro Coloidal Antígeno de VIH Anticuerpos Anti-

conjugado a antígeno IgG/Oro coloidal
Anticuerpos a VIH
de VIH
 PRINCIPIO: Flujo a lo largo de un dispositivo

Banda De Prueba Banda Control

* La muestra fluye a lo largo de la membrana y los anticuerpos anti-
VIH (si están presentes) se unen al antígeno de VIH conjugado al oro
coloidal formando una banda roja visible.
* Los anticuerpos anti-IgG/Oro Coloidal en la línea control se une a
cualquier partícula de Oro coloidal no unido formando una banda roja
visible.
 PROCEDIMIENTO
PASOS A SEGUIR:

1. Kit a Temperatura ambiente

2. Abrir la bolsa individual y extraer el test

3. Codificación del test

4. Añadir dos gotas de suero, plasma o sangre total en

el pocillo marcado como A

5. Añadir cinco gotas de buffer en el pocillo B

6. Lectura e interpretación a los 15 minutos

C T A B
 INTERPRETACION

C T A B

REACTIVO

C T A B

NO REACTIVO
 VENTAJAS PRUEBAS RAPIDAS

• Fácil uso, con entrenamiento mínimo

• Fácil conservación

• No necesidad de equipo

• Toma de muestra utilizando sangre total

• A ser utilizado en sistemas periféricos de salud

• Resultados de 10 a 30 minutos

• Para el diagnostico y estrategia de prevención de la transmisión

vertical de VIH
 ELISA
 ELISA = ensayo inmunoenzimático ( Enzyme
Linked Inmuno Sorbent Assay).

Se basa en la detección de antígeno o anticuerpo inmovilizado

sobre una fase sólida, mediante anticuerpos que directa o
indirectamente producen una reacción cuyo producto
coloreado puede ser medido espectofotométricamente.
 PRUEBA ELISA

H2SO4

Fase * Antígeno Muestra Conjugado Sustrato Stop

Sólida (1°,2°,3°,4° Gen) Antígeno Ag/AbM + +
(Poliestireno) * AnticuerpoM Anticuerpo Enzima Cromógeno
 Evolución del Diagnóstico del VIH

1st gen 2nd gen 3rd gen 4th gen

Proteínas Proteínas Proteínas
recombinantes recombinantes recombinantes
Antígeno usado Lisado
y péptidos y péptidos y péptidos
Viral sintéticos sintéticos sintéticos

Elisa indirecto indirecto sandwich indirecto y directo

anti-HIV Ig IgG IgG IgG Ac

detección IgM Ag P24

Sensibilidad + ++ +++ ++++

Especificidad + ++ + +++ +++

Año aparición 1985 1987 1989 1997

 ELISA
Antígenos inactivados ,parcialmente purificados
pre-cubiertos sobre una placa de ELISA

Suero de paciente contiene anticuerpos,que se

unirán a los antígenos de la placa

Inmunoglobulina antihumana conjugada a

una enzima . Este segundo anticuerpo se
une a los anticuerpos humanos

Cromógeno o substrato el cual cambia de

color cuando es dividido por la enzima
unida al segundo anticuerpo.
H2 O2
 Elisa: Reacción Antígeno-Anticuerpo

Antígeno Anticuerpo
ELISA: Reacción Ac-conjugado
ELISA: Reacción Substrato
Cromógeno TMB
OPD
O2

H2 O2

H2O
 ELISA

Antigen detection

TMB

Solid phase Sample Conjugate

 ELISA Protocolo estandard :

1.- Dispensar la muestra

Dispensar muestra Lavado
incubar

37°C
 ELISA Protocolo estandard :
2.- Dispensar conjugado

Dispensar conjugado Lavar

incubarar

37°C
 ELISA Protocolo estandard :

3.- Dispensar el substrato

Dispensar substrato
e incubar
TMB
H2O2 Temp. ambiente
H2O2 TMB TMB
TMB H2O2
H2O2 TMB
 ELISA Protocolo estandard :
4.- Stop reaction

H2SO4
 Reacción Enzimática del Substrato

Adición de H2SO4
Absorbancia

2000 Positivo Alto

1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400 Positivo bajo
200
0

30’ Tiempo
 Reacción Enzimática del Substrato
Addición de H2SO4

Positivo alto
Absorbancia
2000
1800
1600
1400
1200 Positivo bajo
1000
800
600
400
200
0

30’ 60’ Tiempo

 Marcadores enzimáticos más comúnmente utilizados

Enzima Substrato Buffer/Substrato Color Filtro

secundario
(OPD) Citrate Phosphate Naranja- 492 nm
o-Phenylene Buffer, 0.02% H2O2
marrón
Diamine
HRP
(peroxidasa (TMB) 30% Hydrogen amarillo 450 nm
de rábano ) 3,3',5,5'- Peroxide (H2O2)
Tetramethyl
benzidine
(ABTS) Citrate Phosphate verde 405 nm
2,2'-azinodiethyl- Buffer, 30% H2O2
benzthiazoline
sulfonate)
 ELISA : controles y muestras

P P P N N B
• Control Negativo: asegura que la
placa no reacciona
inespecíficamente
• Control Positivo: asegura que la
placa reaciona correctamente
frente a una muestra positiva
• Control Negativo y Positivo : Cálculo
del Cut-Off
• Blanco asegura que la adición del
substrato no añada ningún
background a la placa
 TIPOS DE ELISA:

ELISA cuantitativas:

 Son técnicas Elisa que nos indican la cantidad de

antígeno ó anticuerpo presente en la muestra. Los
kits incluyen +/-6 standards (sueros de diferentes
concentraciones del antígeno objetivo) con los cuales
se realiza una curva para así poder determinar la
concentración de la muestra.
 TIPOS DE ELISA:

Técnicas cualitativas:

• Son técnicas Elisa que nos indican la ausencia ó

presencia de un antígeno o anticuerpo
determinando.
• Los kits incluyen controles positivos y negativos para
poder determinar esta presencia o ausencia de
antígenos.
 TIPOS DE TÉCNICAS ELISA:

Técnicas semi-cuantitativas:

• Son técnicas Elisa que nos dan un indicio de la

cantidad de antígeno ó anticuerpo presente en la
muestra con la utilización de un standard ó
calibrador
 Tipos de ensayos ELISA

ELISA DIRECTO (ensayo ELISA simple de dos capas).

• Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos

con las soluciones en las que se sospecha se
encuentra el antígeno
• Se incuban con anticuerpos marcados.
• Indican la presencia de antígeno en la solución
analizada.
• Es necesario incluir controles negativos y positivos
 Tipos de ensayos ELISA
Método competitivo:

• Se basa en la competencia que se establece entre un

antígeno/anticuerpo marcado enzimáticamente y el
mismo antígeno /anticuerpo sin marcar (muestra
problema) al ser colocados frente a una cantidad
limitada del anticuerpo/antígeno fijado a la fase
sólida.
• En estos casos la cantidad de antígeno es
indirectamente proporcional a la cantidad de
producto enzimático formado.
 Tipos de ensayos ELISA

ELISA indirecto.
• Pocillos recubierto con antígeno
• . El sistema de detección emplea dos anticuerpos :
uno primario contra el antígeno, y uno secundario
marcado contra el primario.
• La detección tiene mayor sensibilidad por presentar
una amplificación de señal debida a la unión de dos o
más anticuerpo secundarios por cada primario.
• En estos casos la cantidad de antígeno es
directamente proporcional a la cantidad de producto
enzimático formado
Elisa automatización

sistema Semi automático

Sistema manual
ELISA: Sistema automático
 DIAGNOSTICO DE VIH

PRUEBAS CONFIRMATORIAS

• WESTERN BLOT
• INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
• INMUNOENSAYO EN LINEA
• AISLAMIENTO VIRAL
• DNA PCR
 WESTERN BLOT
• Western Blot o Inmunobloting es una técnica
utilizada para la detección de anticuerpos
específicos generados contra agentes
infecciosos.
• Prueba específica que permite desglosar la
reactividad total detectada por ELISA y
determinar que proteínas del patógeno son
reconocidas por el sistema inmune.
• Permite escoger marcadores serológicos
específicos que indique infección.
 FUNDAMENTO TEORICO
• Separación por electroforesis de mezclas
complejas de proteínas y transferidas a
membranas.
• Proteínas inmovilizadas se enfrentan a sueros
de pacientes,detectándose por medio de un
Ac.anti-inmunoglobulina humana unida a
enzima si hubo el reconocimiento Ag-Ac.
PRINCIPIO DE WESTERN BLOT

• ELECTROFORESIS DE LAS PROTEINAS

• TRANSFERENCIA DE
PROTEINAS

• DETECCION DE ANTICUERPOS
 ELECTROFORESIS DE LAS PROTEINAS

• Separación de mezcla de proteínas en sus diversos

componentes a partir de lisado celular por electroforesis
en gel denaturante SDS-poliacrilamida (PAGE).
• Gel de poliacrilamida compuesto por acrilamida y
bisacrilamida formando malla.
• Proteínas de alto peso molecular :gel de bajo porcentaje
• Proteínas de bajo peso molecular: gel de alto
porcentaje.
• Gel de empacamiento y gel de resolución.
 TRANSFERENCIA DE LAS PROTEINAS

• Proteínas separadas por electroforesis son transferidas y

fijadas a una membrana de nitrocelulosa
• Transferencia electroforética:proteínas migran bajo campo
eléctrico atraídas al ánodo (polo positivo) debido a carga
negativa conferida por SDS.
• Transferencia semi seca (semi-dry blotting): gel y la
membrana colocados horizontalmente entre papeles de
filtro sumergidos en buffer de transferencia, colocado entre
electrodos con la membrana hacia lado anódico.
 DETECCION DE ANTICUERPOS

• ANTICUERPO PRIMARIO (sueros).-

Anticuerpos utilizados a mayor dilución
posible que permita distinguir señal
positiva.rango de dilución 1/100 - 1/1500

• Determinar tiempo mínimo de incubación

para evitar ruidos de fondo por uniones
inespecíficas.
 DETECCION DE ANTICUERPOS

ANTICUERPO SECUNDARIO
• mediante un Ac. secundario: anti-
inmunoglobulina unida en forma covalente a
una enzima
• Fosfatasa alcalina (AP) : 10-50 picogramo de
poteína.
• Peroxidasa (HRPO): 250-500 picogramos de
proteína.
 Western Blot
• Prueba de confirmación
• Principio: Ensayo
inmunoenzimático
• Detecta anticuerpos contra
proteínas específicas del
VIH 1
• Interpretación: visual
• Muestras: suero y plasma
• Volumen: 20 µl
• Tiempo: 3.5 hrs
• Sensibilidad: 100%
• Especificidad: 100%
NEGATIVO
POSITIVO
INESPECIFICO
 RESULTADO POSITIVO
Pocillo Superior Pocillo Inferior
 RESULTADO NEGATIVO

Pocillo Superior Pocillo Inferior

PROCESOS PRE-PCR

Obtencion de muestras

Extracción de ADN
PRE AMPLIFICACION Y AMPLIFICACION

DETECCION
 Determinación del estado de Infección en
niños expuestos a VIH
FICHA DE SEGUIMIENTO DE LA GESTANTE SEROPOSITIVA Y EL NIÑO EXPUESTO AL VIH menores de 18 meses de edad
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Y RED NACIONAL DE LABORATORIOS EN SALUD PÚBLICA

DATOS GENERALES DE LA GESTANTE

1. Gestante en CPN ( ) / Gestante en parto ( ) / Madre de niño expuesto ( )
Niño < 18 meses de
_______________________________________________________________________________________
(escribir el nombre completo de la gestante en letra de imprenta) edad nacido de
2. Establecimiento de salud u hospital / DIRESA/ DISA en donde recibe atención:
madre infectada
__________________________________________________________ _____________________________
(establecimiento u hospital) (DIRESA / DISA)
3. Fecha de nacimiento 4. Fecha de diagnóstico 5. Edad (día/mes/año)

6. Evidencia de laboratorio: a. prueba rápida - b. ELISA - c. prueba confirmatoria - d. no sabe

( )antes del CPN ( )durante el CPN ( ) durante el parto ( )después del parto
Prueba DNA PCR para
VIH
DATOS DEL PRE NATAL
7. Lugar de atención pre natal:
________________________________________________________________________________
8. Edad gestacional al Dx.: 9. Fecha probable de parto: 10. Estadio SIDA ( )
Si es positiva, repetir la prueba
__________Semanas de gestación a. Si - b. No - c.No sabe
11. Resultado CD4 12. Resultado carga viral 13. Tratamiento antiretroviral ( ) lo más pronto posible.
___________________cel/mm3 ______________ copias/ml a. Si - b. No - c. No sabe
14. Profilaxis materna con Comentarios: Si es negativa, repetir después
antiretroviral ( )
de dos ó tres meses
a. Si, inició en la semana_______de
gestación
b. No inició
c. No sabe

DATOS DEL PARTO

15. Lugar de atención del parto:
_____________________________________________________________________________
16. Edad gestacional al parto:
__________Semanas de gestación
19.Tiempo que la madre recibió
profilaxis ARV antes del parto ( ):
a. Si durante ____________ semanas
b. No usó
c. No sabe
22. Madre fallecida ( ):
a. Si b. No
Comentarios:
17. Fecha del parto: 18. Recibió Control pre natal ( ) Niños < 18meses son no 2 pruebas positivas
infectados si tienen 2 resultados DNA PCR para VIH
a. Si - b. No - c. No sabe
20. Evolución de la gestación 21. Recibe tratamiento con negativos ocurridos en 2 ó más obtenidas en diferentes
( ): antiretrovirales ( ): DNA PCR para VIH ,cuando uno
días confirma la
a. parto vaginal a. Si, esquema___________________ es realizado a los tres meses de
infección por VIH
b. parto por cesárea b. No edad y el otro es realizado
c. aborto c. No sabe
23. Niño ( ): 24. Inicio profilaxis ARV al niño ( ): después de dos ó tres meses(*),
a. Vivo b. Natimuerto a. Si, en las primeras 24 horas
b. Si, después de 24 horas de nac.
c. No se realiza
d. No sabe
ALGORITMO PARA EL DIAGNOSTICO DE INFECCION POR VIH

1er
ELISA
Resultado (+) Resultado (-)
2do se reporta
ELISA no reactivo
Resultado (+) Resultado (-)
IFI se reporta
no reactivo

+ INESPECIFICO -

WESTERN
BLOT

+ INDETERMINADO -

REPETIR
3 MESES

+ INDETERMINADO -

PCR