MÉTODOS DE ESTUDIO Y DIAGNÓSTICO VIRAL

INTRODUCCIÓN

Gran parte de las técnicas utilizadas en el diagnóstico clínico se basan en pruebas serológicas
que identifican anticuerpos específicos frente a diversas proteínas antigénicas.

En algunas infecciones virales es posible detectar la presencia de antígenos virales

previamente al desarrollo de la seroconversión.

En la última década se han desarrollado una serie de técnicas para el diagnóstico viral basadas
en la detección de ácidos nucleicos. De ellas la Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es la
más utilizada.

En el momento actual, la tendencia en el diagnóstico virológico consiste en emplear nuevas y

más sensibles tecnologías de detección de antígenos y de investigación de ácidos nucleicos
con el propósito de lograr un diagnóstico viral más rápido.

• Métodos DIRECTOS. Son aquellos que detectan:

1. El virus como agente infeccioso (aislamiento viral).

2. La presencia de antígenos virales (técnicas inmunológicas): Inmunofluorescencia

(IF), Enzimoinmunoanálisis (EIA), Test de Aglutinación.

3. La presencia de ácidos nucleicos virales PCR e hibridización (sondas, ADN

ramificado) etc.

4. El virus como partícula viral (microscopía electrónica).

Aislamiento viral en cultivo: Los virus son microorganismos intracelulares y para

evidenciarlos, se deben utilizar sistemas basados en líneas celulares que permitan su
desarrollo. La invasión viral se evidencia a través de un cambio celular o efecto citopático.

a) Cultivos primarios. Se caracterizan por tener varios tipos de células. La mayoría son de
crecimiento limitado in vitro, generalmente resisten 5 a 10 subcultivos y son permisivas a un
amplio rango de virus; p. e., células de riñón embrionario humano (REH).

b) Cepas de células diploides. Derivadas de tejidos normales, se utilizan en la producción de

vacunas, aislamiento viral y como sustratos para probar materiales tóxicos.

c) Líneas celulares. Son células inmortalizadas en el laboratorio, resisten (n) número de

pases y se caracterizan por derivarse de tejidos normales o de tumores malignos y se han
pasado por los menos 70 veces in vitro; p.e., células Vero (riñón de mono verde africano), LLC-
MK2 (riñón mono rhesus) y BSC-1 (también de tejido normal de riñón de mono) y HeLa y
HEp-2 derivadas de células humanas malignas
La hemabsorción. Consiste en que cuando el virus infectante incorpora proteínas virales con
propiedad de hemaglutininas en la membrana celular, las células infectadas se pueden
descubrir por la adsorción de eritrocitos de ciertas especies animales, que se puede observar
al microscopio de luz.

MICROSCOPIA ELECTRÓNICA

Mediante el microscopio electrónico es posible observar la morfología de los viriones

presentes en muestras clínicas.

-Se necesita de una alta concentración de viriones (aproximadamente 109 partículas

virales/ml, dependiendo del virus) presentes en la muestra, por ello es poco sensible.

-Pero se pueden utilizar técnicas que aumenten la visualización, por ejemplo, la

inmunoelectromicroscopía, que consiste en el agregado de anticuerpos específicos antivirales
y la formación de agregados de partículas que son más fácilmente visibles que las partículas
solas.

Detección de Antígenos - Técnicas Inmunológicas

Las siguientes técnicas inmunológicas pueden utilizarse tanto para la detección de antígenos
(métodos directos), como de anticuerpos (métodos indirectos). En el caso de detección de
antígenos, se utiliza un anticuerpo específico antiviral (por lo general IgG) a cuya fracción Fc
se ha conjugado una molécula marcada, que puede ser isotiocianato de fluoresceína
(Inmunofluorecencia), un isótopo radioactivo 125I o 131I (RIA), o una enzima: peroxidasa,
fosfatasa alcalina, o biotina-avidina (EIA), para objetivar la reacción.

Para el procedimiento indirecto (detección de anticuerpos), se emplea un anti-anticuerpo

marcado y la reacción se realiza sobre un cultivo celular infectado por el virus en estudio.

Inmunofluorescencia directa (ID)

Muestras clínicas apropiadas son recolectadas y colocadas sobre portaobjetos donde se dejan
secar y fijar. Luego se agregan anticuerpos especificos marcados con isotiocianato de
fluoresceína que difunden a través de la membrana celular y se combinan con los antígenos
víricos en el interior de las células. La reacción antígeno anticuerpo se visualiza con el
microscopio de fluorescencia, por la aparición de fluorescencia de color verde manzana.

Esta técnica requiere sólo 2-4hs, y se ha reportado una sensibilidad del 70-80 % comparada
con cultivos celulares para la identificación de virus Herpes Simple, 80-95% para VRS y 71%
para Influenza A.

Test de aglutinación

Los ensayos de aglutinación, dependen de la fijación inicial de anticuerpos antivirales

específicos sobre eritrocitos o partículas de látex. Luego este reactivo se incuba con la
muestra clínica en la cual se investiga el antígeno y las partículas se aglutinan si el antígeno
adecuado se encuentra presente. Estas pruebas en general se complementan o se confirman
por medio de otros ensayos debido al elevado porcentaje de reacciones inespecíficas.

El test de aglutinación ha sido usado para detectar antígeno de Rotavirus en heces y detectar
antígenos de Adenovirus.

Enzimoinmunoanálisis (EIA)

Los EIA para la detección de antígeno se basan habitualmente en la captura del antígeno por
anticuerpos específicos unidos a una fase sólida, en general el pocillo de una microplaca o una
pequeña esfera de plástico. El antígeno viral presente en la muestra clínica se combina con el
anticuerpo fijado a la fase sólida y el antígeno viral se detecta mediante la adición de otro
anticuerpo específico conjugado a una enzima. La enzima conjugada suele ser peroxidasa o
fosfatasa alcalina. El sustrato para esas enzimas varía. En la reacción con la fosfatasa alcalina
el sustrato es el paranitrofenilfosfato y para la Peroxidasa es el peróxido de hidrógeno en una
solución de ortofenilendiamina (OPD) que hace visible la reacción.

Los resultados se leen por medio de un espectrofotómetro especialmente diseñado.

Métodos Indirectos.
Son técnicas serológicas para descubrir anticuerpos contra determinado agente viral. La
exposición al agente produce una respuesta inmune por parte del hospedero que genera la
producción de anticuerpos específicos.

Se pueden clasificar en tres grupos con base en la cuantificación de la reacción antígeno-

anticuerpo.

A. Los que dependen de la capacidad del anticuerpo a que se une al antígeno para ejercer
alguna función no relacionada con el virus, por ejemplo: la fijación del complemento
(FC), hemaglutinación indirecta (HI), aglutinación por látex.
B. Los que miden la capacidad de los anticuerpos para bloquear la función viral
específica como la neutralización, la inhibición de la hemaglutinación (IH), la
inhibición de la neuraminidasa (que mide la capacidad de los anticuerpos para
bloquear la infectividad viral), la hemaglutinación viral y la actividad de
neuraminidasa.
C. Los que miden directamente la interacción antígeno-anticuerpo como por ejemplo: la
IFA indirecta, el RIA, ELISA y el Western blot.

Enzimoinmunoanálisis Indirecto (EIA)

Los EIA indirectos se han aplicado para el diagnóstico de anticuerpos virales.

La prueba tiene un principio semejante al de la ELISA directa, sólo que en este caso, un
antígeno específico está unido a una fase sólida que puede ser un tubo, microplaca o perlas de
vidrio; luego se añade el suero del paciente que posee los anticuerpos y después se adiciona el
conjugado constituido por un anti-anticuerpo IgG o IgM unido a una enzima; posteriormente
se adiciona el sustrato específico para la enzima, que lo va a modificar y produce un
compuesto coloreado, cuya intensidad es proporcional a la concentración de anticuerpo en el
suero del paciente. Esta prueba se utiliza ampliamente; más aún, con el advenimiento y la
disponibilidad de los sistemas automatizados se puede efectuar en un periodo de 1 a 2 horas.
Mediante esta técnica se pueden señalar niveles de IgM e IgG con ensayos por separado para
evitar los falsos positivos y negativos. Su utilidad en virología es básicamente para determinar
anticuerpos contra antígenos específicos del dengue, HSV, VIH, RSV, CMV, rubéola, hepatitis A,
B y C principalmente, y en infecciones por EBV se usa para demostrar marcadores serológicos
tempranos de la infección, que se pueden utilizar en el manejo de huéspedes
inmunocomprometidos.

Inmunofluorescencia indirecta

IFA indirecta. En una placa se ponen las células infectadas con un virus determinado, que
tienen antígenos de éste en su membrana, y se fijan; luego se agrega el suero del paciente y
después de una incubación, si hay anticuerpos en el suero, se forma un complejo antígeno-
anticuerpo, que se revela por medio de un conjugado fluorescente.

Este conjugado reacciona con anticuerpos del tipo IgM, IgG e IgA, pero cuando se necesita
descubrir la fase aguda de la infección, el conjugado debe ser específico para las cadenas
pesadas de la IgM

Esta técnica se ha utilizado para descubrir anticuerpos contra rubéola, VIH, CMV y HSV1. Sin
embargo, recientemente ELISA la ha desplazado porque ofrece una especificidad similar y se
puede leer mediante equipos automatizados.

RESUMEN

Técnicas de diagnóstico molecular.

• Comprenden las técnicas que evidencian o descubren el material genético

específico viral conservado y replicable ya sea que se encuentre en un fluido, en una
célula o tejido, ya sea activo o latente.

• Estas técnicas, que son más rápidas que las tradicionales, permiten hacer
estudios en tejidos almacenados y se pueden clasificar en dos categorías:

1. Ensayos de hibridización.

2. Técnicas para la amplificación del ácido nucleico.

Hibridación molecular:

• La hibridación molecular es uno de los pilares de la mayor parte de las

metodologías que se utilizan en el laboratorio de biología molecular. Un grupo de estas
técnicas se ha diseñado para identificar determinadas secuencias en los ácidos
nucleicos.

• La hibridación se refiere al apareamiento específico que ocurre entre cadenas

de ácidos nucleicos con secuencias complementarias, proceso que es análogo a la
reacción antígeno-anticuerpo, pero con la diferencia de que en la hibridación en lugar
de anticuerpos se emplean las llamadas sondas (Mercado & Gamba, 1997).

• Las sondas no son más que fragmentos cortos de ADN o ARN sintetizados in
vitro y que se marcan con sustancias radiactivas fluorescentes o de otro tipo a fin de
hacer posible su posterior detección y de esta manera la identificación de la secuencia
de ADN o ARN de interés.

TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN:

• La hibridación en ocasiones posee una baja sensibilidad debido a la presencia

de un escaso número de copias en la muestra original.

• Por ello en ocasiones como paso previo se realiza una amplificación que no es
más que una clonación in Vitro que permite obtener múltiples copias de ADN.

• También puede realizarse sobre ARN tras su conversión en ADN

complementario (ADNc) mediante una transcriptasa inversa.
EXISTEN DIVERSAS TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR PARA DIAGNÓSTICO:
• Southern, Northern y Slot Blots
• FISH
• Genómica
• Captura de Híbridos
• PCR y sus variantes (RT-PCR, PCR tiempo real, PCR-RFLP, PCR Nested, PCR Multiplex)
• NASBA
• Secuenciación

DIAGNÓSTICO CLÍNICO:

• Detección temprana de patógenos Bacterianos, protozoarios u hongos.

• Detección /Cuantificación / Genotipificación de patógenos Virales (carga viral, carga

pro-viral).

• Monitoreo, elección y evaluación de terapia (enfermedad residual - recaída).

• Detección de cepas resistentes a antibióticos.

• Detección de mutaciones puntuales.

• Detección de marcadores tumorales.

• Polimorfismo genético.

• Filiación.

• Medicina Forense.

APLICACIÓN EN ENFERMEDADES DE ORIGEN INFECCIOSO:

-Detectar el genoma de los agentes patógenos a través de secuencias que difieren de las
secuencias del Genoma Humano (epidemiología de brotes de infección y patógenos
emergentes).

-Permite detectar cantidades mínimas del patógeno en muestras biológicas.

-Diagnóstico de infecciones debidas a microorganismos de lento crecimiento.

-Detección de agentes infecciosos que no pueden ser cultivados (virus).

-Rápida identificación de resistencias a antibióticos.

-Identificación de genes de virulencia o de resistencia a drogas.

- Genotipificación de cepas o subespecies.

PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS IN VITRO

• Se trata de una técnica nueva que ha sido aplicada para el diagnóstico de la

infección perinatal.

Este procedimiento revela la presencia de anticuerpos antivirales producidos in vitro a

partir de los linfocitos B extraídos de sangre total, lo que indicaría que el sistema
inmune del paciente ha sido estimulado por el virus. La producción de Ac antivirales in
vitro promete ser de gran valor en el diagnóstico temprano de niños infectados por
VIH.

Test de Aglutinación.
Los ensayos de aglutinación, dependen de la fijación inicial de anticuerpos antivirales
específicos sobre eritrocitos o partículas de látex. Luego este reactivo se incuba con la
muestra clínica en la cual se investiga el antígeno y las partículas se aglutinan si el antígeno
adecuado se encuentra presente

Dependen de la fijación inicial de anticuerpos antivirales específicos sobre eritrocitos o

partículas de látex. Luego este reactivo se incuba con la muestra clínica en la cual se investiga
el antígeno y las partículas se aglutinan si el antígeno adecuado se encuentra presente.

El fundamento y el procedimiento de la técnica indirecta es parecido al método directo, ahora

lo que se busca es detectar anticuerpos antivirales, por eso se usan partículas de látex
recubiertas con Ag viral.

Aglutinación de látex.
En donde el antígeno se encuentra fijo a la partícula de látex y, por tanto, se espera descubrir
los anticuerpos que se encuentran en la muestra.

Estos ensayos son pruebas de tamizaje pues sólo determinan la presencia o no de anticuerpos.
Los resultados se pueden interpretar como «inmune» (si es positivo) o «susceptible» (si es
negativo).