CATEDRA DE MICROBIOLOGIA

FACULTAD DE MEDICINA

Técnicas aplicadas al
Diagnóstico Inmunológica y
Microbiológico
 Que nos permiten determinar?
 Evaluar funcionalidad de la respuesta humoral y
celular del SISTEMA INMUNE

POR Ejemplo:
En procesos de
 Inmunodeficiencias
 Hipersensibilidad

 Autoinmunidad

 Histocompatibilidad
 Evaluación de la
Respuesta Inmune

Innata Adaptativa

Celular Humoral
 Determinar en el PROCESO INFECCIOSO

✓ La calidad de paciente SUSCEPTIBLE

 Infección presente o pasada?
➢ Infección crónico o aguda?
✓ Infección Congénita?
• Puede recibir profilaxis activa artificial?(vacunas?)
o Definir el agente etiológico. ( Diagnostico Directo o
Indirecto)
 CONCEPTOS

 TECNICAS
In vitro – In vivo
Humorales – Celulares
Cuantitativas (TITULO) Cualitativas
Lectura directa – Lectura indirecta

 TECNICAS QUE PERMITEN :

Diagnóstico directo
Diagnóstico indirecto (IgM- Muestras pareadas)
 IN VITRO
 Búsqueda de Antígenos o Anticuerpos en Plasma, LCR,
Orina, Tejidos etc.
 Evalúa la funcionalidad de poblaciones leucocitarias
 IN VIVO
Evalúa la capacidad de un
individuo de montar una
propuesta celular y /o humoral
Ej REACCION DE LA
TUBERCULINA
INMUNIDAD HUMORAL : TITULO DE ANTICUERPOS
 Propiedades de una técnica
 SENSIBILIDAD
Proporción de positivos que tenemos entre los que tienen
una patología. Según el método diagnóstico podemos tener
sensibilidades muy distintas.

 ESPECIFICIDAD
Proporción de negativos que hay en el grupo de los que no padecen
la enfermedad que estudiamos. Que quien no esté enfermo nos dé
negativo en la prueba
VALOR PREDICTIVO POSITIVO (VPP):
Probabilidad cuando la prueba es positiva, que
corresponda a un verdadero positivo.

VALOR PREDICTIVO NEGATIVO (VPN):

Probabilidad cuando la prueba es negativa, que
corresponda a un verdadero negativo.
SITUACIÓN IDEAL: ALTA SENSIBILIDAD
Y ALTA ESPECIFICIDAD

Ejemplo de mala técnica diagnóstica

Da positivo cuando NO hay enfermedad
Da negativo cuando hay enfermedad.

En este caso tenemos baja tanto la sensibilidad

como la especificidad.

Casi todos son FALSOS POSITIVOS O

FALSOS NEGATIVOS
Valor de la prueba de detección de anticuerpos anti virus
de inmunodeficiencia humana por técnica de ELISA.
( Ejemplo con datos ficticios.)

Detección de
Pacientes HIV (+) Pacientes HIV (-) Total
anticuerpos
a) 99
Positivo b) 99 a+b 188

c) 1
Negativo d) 9801 c+d 9802

Total a+ c 100 b+d 9900 a+b+c+d 10000

Sensibilidad = a/a+c= 99/100 = 99 %

Especificidad = d/b+d = 9801/9900 = 99 %

V.P.P. = a/a+b = 99/188 = 50%

V.P.N. = d/b+d = 99.99 %.

 Técnicas basadas en ala
Interacción Antígeno -Anticuerpo
  Técnica de precipitación :
Inmunodifusión

DIFUSIÓN DE UN ANTÍGENO Y UN ANTICUERPO

EN UN GEL
 CUANTIFICACIÓN DE CUALQUIERA
INMUNOGLOBULINA:
TECNICAS DE AGLUTINACION
 TÉCNICA DE AGLUTINACION LÁTEX en LCR
DIAGNOSTICO DE MENINGITIS

GERMENES en LCR LATEX

AGLUTINACION + AGLUTINACION -
Prueba de Coombs
ENFERMEDAD HEMOLÍTICA DEL RECIÉN NACIDO

La forma de evitar la eritroblastosis fetal es identificar a las

madres Rh- en los primeros meses del embarazo mediante
un análisis de su sangre. Las que poseen anticuerpos anti
Rh deben recibir inmunoglobulina Rh en los primeros
meses de gestación y una segunda dosis a las 72 horas de
producido el parto.
 FUNDAMENTO Permite demostrar la presencia de
anticuerpos incompletos mediante el uso
de un segundo anticuerpo, que es una
antiglobulina.
PARÁMETROS DETERMINADOS
POR ESTA TÉCNICA Prueba de COOMBS DIRECTA: se
emplea la antiglobulina para la detección
de anticuerpos incompletos
antieritrocitarios, que ya se encuentran
unidos "in vivo" a los hematíes.

Prueba de COOMBS INDIRECTA: se

emplea la antiglobulina para la detección
de anticuerpos incompletos
antieritrocitarios no unidos "in vivo" a los
hematíes. Por ello se realiza en dos fases,
en la primera se enfrentan los
anticuerpos frente a hematíes de
antigenicidad conocida para provocar su
unión, y posteriormente se añade al
antiglobulina hemaglutinante.
Fijación de Complemento
HISTOCOMPATIBILIDAD
CROSS MATCH
HISTOCOMPATIBILIDAD
Microcitotoxicidad para HLA
 Inmunoflurescencia
Técnica de inmunomarcación que hace uso
de anticuerpos unidos químicamente a una
sustancia fluorescente
 DETECCION DE VIRUS RESPIRATORIOS
FONDO OSCURO DIAG DE SIFILIS EN SECRESIONES
Citometría de flujo ( INMUNOFLUORESCENCIA)

Utiliza la luz láser para el recuento y clasificación de células

según sus características morfológicas, presencia
de biomarcadores, y en la ingeniería de proteínas.

USO Trasplantes, hematología, inmunología tumoral, y quimioterapia,

diagnóstico prenatal, genética, inmunodeficiencias otras
 Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

Mide la unión Ag-Ac

mediante colorimetría
TIPOS DE ELISA :
 RADIOINMUNOENSAYO

Técnica cuantitativa basada en la competición que se establece entre un antígeno, marcado

radiactivamente, y el mismo antígeno no marcado por unirse a un anticuerpo específico.
Desarrollada por Solomon A. Berson y Rosalyn Yalow en 1960 para determinar la
concentración de insulina en el plasma sanguíneo

R. Yalow recibió el
Nobel de Medicina en 1977
 se utiliza para detectar y cuantificar sustancias
que se encuentran en cantidades muy pequeñas y
mezcladas con muchas otras. Es por tanto
una técnica muy sensible y muy específica.

SE UTILIZA PARA DETECTAR Y CUANTIFICAR SUSTANCIAS QUE SE

ENCUENTRAN EN CANTIDADES MUY PEQUEÑAS Y MEZCLADAS CON
MUCHAS OTRAS.
ES POR TANTO UNA TÉCNICA MUY SENSIBLE Y MUY ESPECÍFICA.
IgE TOTAL EJ ANAFILAXIA
IgE INMUNOESPECIFICA
CML
INTRADERMOREACCION
ESTALLIDO RESPIRATORIO
Western blot, inmunoblot o
electrotransferencia
 visualización mediante la marcación

SEPARACIÓN POR TAMAÑO por electroforesis en gel

TRANSFERENCIA A UN SOPORTE SÓLIDO una membrana adsorbente ( nitrocelulosa )

VISUALIZACIÓN MEDIANTE LA MARCACIÓN unión antígeno-anticuerpo

por actividad enzimática o fluorescencia
 TÉCNICAS MOLECULARES

Son técnicas altamente específicas y

con gran sensibilidad
DIAGNOSTICO MOLECULAR: incluye técnicas de biología molecular en
beneficio de la salud humana, detectando y/o cuantificando secuencias genéticas
específicas de ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN) o
proteínas.
Amplifica una región en una
enorme cantidad de moléculas
Polymerase Chain Reaccion (PCR)

VIRUS X PRESENTE EN SANGRE DEL PACIENTE????

SANGRE DEL PACIENTE

RT-PCR: Reverse transcription polymerase
chain reaction
A partir de ARN se realiza la transcripción reversa (RT) usando la
enzima TRANSCRIPTASA REVERSA

Genera una copia de la hebra de ARN, pero esta copia es ADN

complementario (ADNc ) estable al calor
PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR)

Reacción de PCR cuya principal

característica es que permite
cuantificar la cantidad de ADN o
ARN presentes en la muestra
original
 RFLP

Corte de una determinada región con

enzimas de restricción para ver si por una
mutación se gana o se pierde un sitio de
restricción

Permite la comparación de aislamientos,

en estudio por ejemplo de BROTES y
definir fuente de infección
 Southern blott

Electroforesis en gel de agarosa

Transferencia a una membrana

Hibridación de la sonda
( fragmento de ADN) marcada )
Muchas Gracias