Protocolo de extracción de ARN con mini kit RNasay

Parte 1
Notas antes de empezar:
 Almacenar el kit a temperatura ambiente (15°- a 20 °C ) y una vez abierto este tiene una duración de 9
meses.
 Si purifica ARN de líneas celulares ricas en ARNasas o tejido, agregue 10 μl de β-mercaptoetanol (β-ME)
o 20 μl de ditiotreitol 2 M (DTT) a 1 ml de tampón RLT. El tampón RLT con β-ME o DTT se puede
almacenar a temperatura ambiente hasta por 1 mes.
 Agregue 4 volúmenes de etanol (96–100 %) a Buffer RPE para obtener una solución de trabajo.
 Retire el tejido estabilizador con RNAprotect® del reactivo con unas pinzas.
 Para el mini kit RNeasy Protect (n.º de catálogo 74124 y 74126), comience con el reactivo de tejido
RNAprotect del protocolo de inicio rápido, los tubos de tejido RNAprotect y los kits RNeasy Protect.

Pasos:
1. Células: Coseche un máximo de 1 x 107 células, como sedimento celular o por lisis directa en el
recipiente. Agregue el volumen apropiado de Buffer RLT y seleccione un método adecuado para la
disgregación y homogeneización (consulte la Tabla 1).

Tejido: No use más de 30 mg de tejido. Rompa el tejido y homogeneice el lisado en el volumen

adecuado de Buffer RLT (consulte la Tabla 1). Centrifugar el lisado durante 3 min a máxima velocidad.
Retire con cuidado el sobrenadante pipeteando y utilícelo en el paso 2.

2. Agregue 1 volumen de etanol al 70 % al lisado y mezcle bien pipeteando. No centrifugar. Continúe

inmediatamente con el paso 3.

3. Transfiera hasta 700 μl de la muestra, incluido cualquier precipitado, a una columna giratoria RNeasy
Mini colocada en un tubo de recolección de 2 ml (suministrado). Cierre la tapa y centrifugue durante 15
s a ≥8000 x g. Deseche el flujo continuo.
Opcional: Para la digestión con ADNasa, siga los pasos 1 a 4 de "Digestión con ADNasa en columna" en
el Protocolo de inicio rápido RNeasy Mini Kit, Parte 2.

4. Agregue 700 μl de tampón RW1 a la columna de centrifugado RNeasy. Cierre la tapa y centrifugue
durante 15 s a ≥8000 x g. Deseche el flujo continuo.

5. Agregue 500 μl de tampón RPE a la columna de centrifugación RNeasy. Cierre la tapa y centrifugue
durante 15 s a ≥8000 x g. Deseche el flujo continuo.

6. Agregue 500 μl de tampón RPE a la columna de centrifugación RNeasy. Cierre la tapa y centrifugue
durante 2 min a ≥8000 x g.
 Opcional: Coloque la columna de centrifugación RNeasy en un nuevo tubo de recogida de 2 ml
(suministrado). Centrifugar a máxima velocidad durante 1 min para secar la membrana.

7. Coloque la columna de centrifugación RNeasy en un tubo de recogida nuevo de 1,5 ml (suministrado).

Agregue de 30 a 50 μl de agua sin ARNasa directamente a la membrana de la columna de centrifugado.
Cierre la tapa y centrifugue durante 1 min a ≥8000 x g para eluir el ARN.

8. Si el rendimiento de ARN esperado es >30 μg, repita el paso 7 con otros 30–50 μl de agua libre de
ARNasa o con el eluato del paso 7 (si se requiere una concentración alta de ARN). Reutilice el tubo de
recolección del paso 7.

Tabla 1. Volúmenes de tampón RLT para fragmentación y homogeneización de muestras.

Muestra Cantidad Dish Buffer RLT (μl) Disrupción y

homogeneización
Células animales <5 x 106 <6 cm 350 Añadir Buffer RLT,
<1 x 107 6–10 cm 600 vórtice (≤1 x 105
células); o usar
QIAshredder,
TissueRuptor® o
aguja y jeringa

Tejidos animales <20 mg – 350 TissueLyser® LT;

≤30 mg – 600 tejido Lyser II;
TissueRuptor, o
mortero y pistilo
seguido de
QIAshredder o aguja
y jeringa
Parte 2

Notas antes de empezar:

Digestión de ADNasa en columna
 Si utiliza el conjunto de ADNasa libre de ARNasa por primera vez, prepare la solución madre de ADNasa
I inyectando 550 µl de agua libre de ARNasa en el vial de ADNasa I con una aguja y una jeringa sin
ARNasa. Mezclar suavemente invirtiendo el vial. No dar vortex.
 Para el almacenamiento a largo plazo de la solución madre de ADNasa I, divídala en alícuotas de un
solo uso y guárdela a –20 °C durante un máximo de 9 meses. Las alícuotas descongeladas se pueden
almacenar a 2–8 °C durante un máximo de 6 semanas. No vuelva a congelar alícuotas después de
descongelar.

1. Añada 350 µl de tampón RW1 a la columna RNeasy, cierre la tapa, centrifugue durante 15 s a ≥8000 x g
(≥10 000 rpm). Deseche el flujo continuo.

2. Agregue 10 µl de solución madre de ADNasa I (ver arriba) a 70 µl de tampón RDD. Mezclar invirtiendo
suavemente el tubo. Centrifugar brevemente.

3. Añada la mezcla de incubación de ADNasa I (80 µl) directamente a la membrana de la columna RNeasy
y colóquela en la mesa de trabajo (20–30 °C) durante 15 min.

4. Añada 350 µl de tampón RW1 a la columna RNeasy, cierre la tapa y centrifugue durante 15 s a ≥8000 x
g. Deseche el flujo continuo. Continúe con el paso 5 de “Purificación de ARN a partir de muestras de
células/tejidos” en el protocolo de inicio rápido RNeasy Mini Kit, Parte 1, o el paso 4 de “Limpieza de
ARN” (a continuación).
Parte 3
Limpieza de ARN
 Agregue 4 volúmenes de etanol (96–100 %) a Buffer RPE para obtener una solución de trabajo.

1. Ajustar la muestra a un volumen de 100 ul con agua libre de ARNasa. De forma alternativa, siga los
pasos de "Digestión con ADNasa del ARN antes de la limpieza del ARN" en el Apéndice E del Manual
RNeasy Mini. Agregue 350 µl de tampón RLT y mezcle bien.

2. Agregue 250 µl de etanol (96–100 %) al ARN diluido y mezcle bien pipeteando. No centrifugar.
Continúe inmediatamente con el paso 3.

3. Transfiera la muestra (700 µl) a una columna giratoria RNeasy Mini colocada en un tubo de recolección
de 2 ml (suministrado). Cerrar la tapa. Centrifugar durante 15 s a ≥8000 x g. Deseche el flujo continuo.
Opcional: si realiza una digestión opcional con ADNasa en columna, siga los pasos 1 a 4 de "Digestión
con ADNasa en columna" (arriba) después de este paso.

4. Añada 500 µl de tampón RPE a la columna de centrifugado RNeasy. Cerrar la tapa. Centrifugar durante
15 s a ≥8000 x g para lavar la membrana. Deseche el flujo continuo.

5. Añada 500 µl de tampón RPE a la columna de centrifugado RNeasy. Cerrar la tapa. Centrifugar durante
2 min a ≥8000 x g para lavar la membrana.
Opcional: Coloque la columna de centrifugación RNeasy en un nuevo tubo de recogida de 2 ml
(suministrado). Cierra la tapa y centrifuga a máxima velocidad durante 1 min.

6. Coloque la columna de centrifugación RNeasy en un tubo de recogida nuevo de 1,5 ml (suministrado).

Agregue de 30 a 50 μl de agua sin ARNasa directamente a la membrana de la columna de centrifugado.
Cierre la tapa y centrifugue durante 1 min a ≥8000 x g para eluir el ARN.

7. Si el rendimiento de ARN esperado es >30 µg, repita el paso 6 utilizando otros 30–50 µl de agua libre
de ARNasa. Alternativamente, use el eluido del paso 6 (si se requiere una alta concentración de ARN).
Reutilice el tubo de recolección del paso 6.