UNIVERSIDAD DEL NORTE

PROGRAMA DE MEDICINA – II SEMESTRE

EXTRACCIÓN DE ADN A PARTIR DE SANGRE HUMANA

Técnica adaptada por la profesora Alma Polo Barrios de la desarrollada por Ian Garner

1. OBJETIVO
Conocer, comprender y analizar cada uno de los pasos necesarios para obtener ADN genómico a partir de
sangre total humana mezclada con anticoagulante.

2. RESPONSABLE
La responsabilidad de esta práctica es del docente de la asignatura, el auxiliar de trabajo y de los
estudiantes que están realizando el procedimiento. Todos ellos están regidos por los códigos de conducta y
las normas de trabajo establecidas en el laboratorio de Biología Molecular.

3. PALABRAS CLAVE
ADN: es la sigla para el ácido desoxirribonucleico. Esta molécula es un polímero, de tipo orgánico,
responsable de mantener la información genética que identifica a cualquier ser vivo y a algunos virus. Como
macromolécula está formada por unidades menores que para este caso se denominan nucleótidos, los
cuales dependiendo de su ordenamiento identifican las características específicas y el funcionamiento de un
organismo. En las células humanas el ADN está situado en el núcleo de la célula, pero también
encontramos esta molécula en las mitocondrias.

Agua Milli Q: es un agua que se empezó a producir en equipos de purificación de la empresa Millipore.
Posteriormente otras marcas empezaron a comercializar equipos que producían este mismo tipo de agua y
la denominaron ultra pura. También es conocida con el nombre de agua Tipo I. Los equipos que producen
agua tipo I utilizan varios pasos sucesivos de filtración y desionización que producen agua libre de iones y
de trazas de enzimas como la ADNasa y la ARNasa. Este agua es muy utilizada en los laboratorios de
biología molecular y genética molecular.

EDTA: es la sigla para el ácido etilendiaminotetraacético. Es una sal utilizada como agente quelante que
puede crear complejos con iones metálicos polivalentes que terminan por formar compuestos cíclicos no
iónicos, solubles en agua y no disociables.

Tris: es la sigla del tris hidroximetil aminometano. Es una base utilizada en la preparación de las soluciones
tampón. Como amina primaria genera propiedades tamponantes a pH entre 7.0 y 9.2.
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SDS: es la sigla para el dodecilsulfato de sodio que también recibe el nombre de lauril sulfato de sodio. Esta
molécula funge como un detergente aniónico que por sus propiedades tensioactivas es utilizado para la
disolución de sustancias que en condiciones fisiológicas normales son insolubles en agua o soluciones
salinas. Su utilización en muestras celulares genera mezclas en las que algunas moléculas permanecen en
estado sólido mientras que otras adquieren la propiedad de solubilizarse en el solvente.

Tritón X-100: es un detergente no iónico, de acción suave y biodegradable. En biología molecular es muy
utilizado en diversos procesos debido a su estabilidad en soluciones ácidas y alcalinas. En las técnicas de
extracción de biomoléculas es utilizado con la finalidad de disolver lípidos y proteínas sin alterar la estructura
de otras moléculas celulares.

4. FUNDAMENTO
El tejido sanguíneo se encuentra formado por células nucleadas como los leucocitos y por células
anucleadas como los eritrocitos y las plaquetas. El ADN genómico celular se localiza en el núcleo, por lo que
su extracción a partir de muestras sanguíneas requiere de la separación de las diferentes estructuras
celulares. Para obtener los núcleos, se utilizan sales, soluciones tampón y detergentes que generan una
diferencia de presión osmótica y un cambio en la estructura de la membrana plasmática de la célula que
permiten la lisis celular y la obtención de los núcleos casi intactos. Estos núcleos son separados del resto de
componentes celulares mediante un proceso de centrifugación. El ADN se extrae del núcleo después de la
lisis de la membrana nuclear con solución detergente y se separa del resto de componentes nucleares por
aumento de la fuerza iónica con sales y por precipitación selectiva en etanol absoluto seguido de un proceso
de centrifugación. Para purificar este ADN y descartar las sales y restos de agentes orgánicos adheridos a
él, es necesario lavarlo de manera sucesiva en una mezcla de etanol y agua. Finalmente el ADN genómico
puro se disuelve en agua Milli Q y se conserva a -20°C.

5. REACTIVOS Y ENZIMAS
 Solución de EDTA al 1.5% (como anticoagulante, agregar 34 μl a 3 ml de sangre).
 Tampón hipotónico A: 10mM de Tris-HCI pH 7.6; 10mM de KCI; 10mM de MgCI2; 2mM de EDTA.
 Tampón hipertónico B: 10mM de Tris-HCI pH 7.6; 10mM de KCI; 10mM de MgCl2; 2mM de EDTA; 0.4M de
NaCl.
 65% Tritón X-100
 10% SDS
 6M de NaCI
 Solución de ARNasa 10 mg/ml
 3M de acetato de sodio
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 Etanol absoluto
 70% etanol
 Agua Milli Q

6. MATERIALES Y EQUIPOS
 Jeringa de 3 ml
 Tubo falcon de 15 ml
 500 µl de sangre humana
 Micropipetas de 100 µl, 200 µl y 1000 µl
 Puntas para micropipetas
 Pipetas Pasteur
 Vortex
 Centrífuga
 Shaker-incubadora
 Servilletas de papel

7. PROCEDIMIENTO
 Extraiga 3 ml de sangre humana en un tubo falcon que contenga una solución anticoagulante de
EDTA.
 Mezcle suavemente la sangre para impregnarla con el anticoagulante. Bajo este tratamiento químico la
muestra puede ser almacenada por un periodo de 3 a 10 días en refrigeración.
 Transfiera 500 µl de sangre a un tubo eppendorf.
 Agregue 12.5 µl de Tritón X-100 al 65%. Mezcle en el vortex por 4-7 segundos.
 Añada a la mezcla 600 µl de tampón A.
 Mezcle unas 5 veces por inversión suave hasta lograr la lisis de la membrana plasmática. Incube la
mezcla a temperatura ambiente durante 5 min.
 Centrifugue la muestra durante 10 min a 5000 rpm a temperatura ambiente. Después de centrifugar
notará que los núcleos se encuentran sedimentados y que los puede recuperar del fondo del tubo
eppendorf.
 Descarte el sobrenadante. Notará que queda un remanente de líquido por lo que debe llevar los
núcleos al vortex y agitarlos por unos 30 seg hasta que se desprendan completamente.
 Lave los núcleos resuspendiéndolos en 600 µl de tampón A (para desprender la hemoglobina). No
agregue en esta ocasión el Tritón X-100.
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 Mezcle en el vortex por 10 segundos y corrobore que los núcleos estén libres de hemoglobina.
 Centrifugue la muestra a 5000 rpm durante 10 min. Descarte el sobrenadante (que no quede nada de
líquido) y mantenga el pellet que corresponde a los núcleos. Si la mezcla todavía sigue viéndose de
color rojizo, por la hemoglobina, repita el paso con el tampón A y la centrifugación.
 Resuspenda los núcleos en 300 µl de tampón B y mezcle en el vortex por 15 seg.
 Agregue 20 µl de SDS al 10% y mezcle por inversión unas tres veces.
 Incube la mezcla durante 10 min a 55°C en un baño termorregulado.
 Añada 50 µl de NaCl al 6M y mezcle por inversión suave.
 Centrifugue la muestra durante 3 min a 15000 rpm a 4°C.
 Recupere el sobrenadante y transfiéralo a un tubo eppendorf. Descarte el pellet (desechos celulares).
 Adicione 2 µl de la solución de ARNasa (concentración final de 100 μg/ml) y mezcle suavemente por
inversión.
 Incube la muestra a 37°C en un shaker o en una incubadora durante 5 minutos.
 Agregue 30 µl de acetato de sodio al 3M y mezcle muy suavemente por inversión.
 Añada 2 volúmenes de etanol absoluto frío (aproximadamente 600 µl) y mezcle por inversión suave. El
ADN empezará a precipitarse rápidamente en forma de un floculado de color blancuzco.
 Si el ADN es visible, captúrelo con ayuda de una pipeta Pasteur limpia y estéril y transfiéralo a un tubo
eppendorf, de lo contrario centrifugue la muestra a 8000 rpm a 12°C durante 3 min.
 Descarte el etanol y tome el pellet y lávelo con etanol frío al 70%. Para lograrlo, agregue 600 µl de
etanol al 70%, tape el tubo y mézclelo muy suavemente por inversión.
 Inmediatamente después de mezclar, centrifugue la muestra por 3 min a 8000 rpm y descarte el
sobrenadante.
 Permita que el ADN drene el alcohol sobrante invirtiendo el tubo sobre una servilleta de papel por un
periodo de 10 a 20 min.
 Cuando el tubo esté seco y libre de etanol, añada 80 µl de agua Milli Q al ADN y disuélvalo durante
toda la noche a 25-27°C en un baño de agua termorregulado. Almacene el ADN a -20ºC.
Nota:
1) evite el uso de la heparina como anticoagulante debido a que esta molécula puede adherirse a los sitios activos de las enzimas
que actúan sobre el ADN. In vitro, podría bloquear la acción de las polimerasas y endonucleasas sobre el ADN.
2) El ADN puede ser almacenado a diferentes temperaturas: a 4ºC cuando vaya a ser utilizado diariamente en diferentes protocolos;
en el caso en el que se almacene por tiempo indefinido puede ser congelado a una temperatura de -80ºC.

8. REFERENCIA.
 Ian Garner. Isolation of High-Molecular-Weight DNA from Animal Cells. The Nucleic Acid Protocols
Handbook. Ed R. Rapley © Humana Press Inc., Totowa, NJ.