Protocolos para la extracción y

purificación de antígenos de
membrana de Toxoplasma gondii
Consideraciones
• No existe un protocolo único para la purificación de proteínas de membrana, son las
etapas iniciales de la solubilización de proteínas de membrana donde se encuentran los
problemas con mayor frecuencia.
• Las proteínas de membrana tienen la tendencia a formar agregados, incluso en presencia
de detergentes, lo que reduce la eficiencia de las técnicas de separación posteriores.
• La elección del detergente también puede afectar la eficiencia de los procedimientos de
purificación de proteínas aguas abajo.
• Las proteínas periféricas de la membrana se pueden disociar utilizando técnicas
relativamente suaves que rompen los enlaces electrostáticos o de hidrógeno entre las
proteínas periféricas y la membrana, sin que la membrana se rompa por completo.
• Las proteínas de membrana integrales son extremadamente hidrofóbicas y, a menudo,
requieren altas concentraciones de detergentes para la solubilización.
Protocolo N°1
1. Resuspender los pellets en el volumen 5X de tampón de lisis Triton X-114 (HEPES 20 mM, pH 7.4,
NaCl 150 mM, Triton X-114 al 2 % e inhibidor de proteasa completo [Roche]) e incubados en hielo
por 30 minutos.
2. El lisado celular se centrifugó a 15 000 x g a 4 °C durante 10 min y luego se recogió el
sobrenadante como fracción soluble en detergente.
3. Después de calentar a 30°C/37°C durante 3/5 min, la fracción soluble en detergente se centrifugó a
1500 g durante 5 min a temperatura ambiente.
4. La capa acuosa se recogió y luego se volvió a centrifugar a 1500 x g durante 5 min para eliminar la
contaminación de la capa enriquecida con detergente y se guardó como la fracción acuosa (Ag).
5. La capa enriquecida con detergente se diluyó con tampón basal (HEPES 20 mM, pH 7.4, NaCl 150
mM) al mismo volumen de la fracción soluble en detergente y se volvió a centrifugar a 1.500 × g
durante 5 min.
6. La capa enriquecida con detergente lavada se diluyó con el tampón basal al mismo volumen que la
fracción acuosa y se guardó como fracción detergente (Det).
 Protocolo N°2
1. Resuspender los pellets en buffer de lisis TBS frío (10 mM TRIS, 140 mM NaCl pH 8.02) +2% de tritón X-114, con
inhibidores de proteasa: leupeptin 1 en 1000, pepstatin 1 en 1000 y pefabloc 1 en 100 (Se agrega 500 ul de
buffer al pellet, dependiendo si el pellet es grande agregar más)
2. Incubar por 90 minutos a 4°C en hielo y vortexear cada 15 minutos
3. Centrifugar a 10000 x g por 15 minutos a 4°C. El pellet y sobrenadante que se obtenga se trabajaran por
separado
4. El sobrenadante se recuperará en un tubo eppendorf de 1.5 ml (aparte alicotar 100 o 20 ul en otro tubo más
pequeño para cuatificación de proteínas) y se incubará a 37°C por 5 minutos.
5. Centrifugar a 10000 x g por 1 minuto a temperatura ambiente, se observará dos fases: fase acuosa y fase
detergente.
6. Recuperar la fase acuosa (sobrenadante) y se le agregará 100 ul de buffer de lisis y se incubará a 37°C por 3
minutos con la finalidad de quitar toda la fase detergente posible.
7. Se centrifugará a 10000 x g por 1 minuto a temperatura ambiente
8. Descartar la fase detergente contaminante y guardar a -70°C hasta su uso
9. Para la fase detergente se rescatará el pellet y se agregará TBS solamente para incubar a 37°C por 3 minutos.
10.Se centrifugará a 10000 x g por 1 minuto a temperatura ambiente, se descartará el sobrenadante (fase acuosa)
y se recuparará el pellet (fase detergente), guardar a -70°C hasta su uso.
Resultados del protocolo 1 y 2
• Suero de conejo inmunizado con 1 2 3 4 5 6 7 8 9
TLA 1/100
246
• Conjugado anti IgG 1/1000
180
100
75
Con el protocolo 2
1: Fase acuosa 63
2: Fase detergente
48
3: Fase acuosa
4: Fase detergente
35
Con el protocolo 1
5: Fase acuosa
6: Fase detergente 25

20
-
17
7: Antígeno lisado total (TLA)
8: Antígeno escretor secretor (E/S)
9: Control negativo (Medio + células) 11
Protocolo N°3 - Extracción de proteínas de membrana usando butanol

1. Agregue un volumen igual de N-butanol a la fracción de membrana, y mantener

a 4 °C.
2. Centrifugar a 500 × g a 4 °C durante 10 min para separar la mezcla en una fase
superior que contiene butanol y lípidos de membrana y una fase acuosa inferior
que contiene proteínas solubilizadas. El material rico en lípidos se localiza en la
interfase.
3. Separe las fases acuosas superior e inferior en tubos separados.
4. Dializar la fase acuosa frente a un gran volumen de agua o tampón adecuado.
5. Analizar la fase acuosa dializada para proteínas.
Protocolo N°4 – Fraccionamiento de proteínas de membrana
periféricas e integrales. Uso de pH alto

1. Resuspender la fracción de membrana a una concentración de <2

mg/mL en tampón de pH alto.
2. Homogeneice la suspensión en un homogeneizador Dounce con 6 a
8 pasadas.
3. Mantener a 4 °C durante 30 min. Mezclar mediante agitación
vorticial tres veces durante este período.
4. Pellet la fracción de membrana por centrifugación durante 60 min a
100.000 × g a 4 °C y transfiera el sobrenadante, que contiene las
proteínas de la membrana periférica, a un tubo nuevo y analice la
proteína
Protocolo N°5 – Extracción de proteínas de membrana usando Tritón
X-100

1. Resuspender las células en tampón TE (10 mM Tris–HCl, 2 mM EDTA) a

una concentración de 1×107 células/mL.
2. Centrifugar las células a 40 000 × g durante 10 min. Retire el sobrenadante
y agregue TE fresco.
3. Repita este paso y resuspenda las células en aproximadamente 1 ml de TE.
4. Agregue las células gota a gota al Triton X-100 al 2 % mientras revuelve.
5. Dejar solubilizar durante 30 min a 4 °C.
6. Centrifugar a 100.000 × g durante 30 min a 4 °C.
7. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y analizar la proteína.
 Obtención de suero agudo y crónico
Toxoplasma gondii modelo ratas
• Se infectará con 105 taquizoitos/ml vía intraperitonial
• El día 7 se tomará muestra de las 12 ratas para confirmar la infección por PCR
• Se realizará sangría total de cada 2 ratas infectadas los días:

Día 3 Día 7 Día 15 Día 30 Día 60

Por grupo • 5 infectadas
• 2 controles

• Los sueros obtenidos se enfrentarán a los antígenos de membrana y antígeno excretor secretor para hallar
algún patrón de bandas por Western blot que diferencien la fase aguda y crónica.
• Este modelo servirá para luego probar los antígenos obtenidos con suero humano de pacientes en fase
aguda o en pacientes en donde el parásito se haya reactivado.
Gracias por su atención