Equipos reactivos y protocolo

Los Reactivos utilizados en el método de Elispot son:

 Solución salina tamponada con fosfato (PBS)

Es uno de los buffers más utilizados porque es
isotónico y no tóxico para las células.
 Tampón de recubrimiento  cultivo de tejidos
 PBS-Tween  solución de anticuerpos de captura
Tween-20  Solución de anticuerpos de detección.
Tensoactivo tipo polisorbato cuya estabilidad y  Solución del conjugado enzimático.
relativa ausencia de toxicidad permiten que sea  Solución de sustrato
usado como detergente y emulsionante
 Tampón de bloqueo (PBS-BSA)

1. Recubrimiento de anticuerpos
En este método se utiliza una placa ELISPOT de 96 pocillos con una membrana de
fluoruro de polivinilideno ,el cual se recubrira con un anticuerpo de captura
específico de citoquinas . 
Para ello:
 Antes de su uso debemos sumergir la placa en etanol al 70% durante 30
segundos.
 Luego Lavamos minuciosamente con PBS para eliminar cualquier residuo de
etanol. (cada lavado realizado en este proceso ayuda a retirar el exceso de
reactivos colocados en la placa).
 Luego colocamos el anticuerpo de captura con un contenido de tampón de
recubrimiento
 Almacenamos nuestra la placa durante la noche en una cámara humidificada a
4 °C o a 37 ° C durante 4 horas en una atmósfera humidificada.

 Luego lavamos la placa 3 veces con PBS, se golpea suavemente y se seca

sobre una toalla de papel en cada lavado.
 Luego Añadimos el tampón de bloqueo estéril, se sella la placa y se incuba a
temperatura ambiente durante ≥ 1 hora. ( Aquí tenemos nuestro anticuerpo de
captura listo, totalmente inmovilizado)
 Al final añadimos en los pocillos la solución de antígeno.
2. Incubación Celular
Las células que ocupemos sean recién aisladas, descongeladas o cultivadas se
agregan a los pocillos junto con los antígenos de interés y se incuban para permitir la
activación de las células productoras de citoquina para la inducción de su secreción.
Las células pueden derivar de diversas fuentes y de diversas especies cultivos
celulares, muestras de sangre humana o tejido del órgano del bazo.
Para ello:
 Se Añade en cada pocillo las células
 Se sella la placa e incubamos a 37 ° C con 5% de CO 2 en una atmósfera
humidificada . el período de estimulación óptimo dependerá de la citoquina
estudiada.
3. Captura de citoquinas
Las citoquinas secretadas se unirán a los anticuerpos de captura en la membrana
que rodea a las células activadas.
4. Anticuerpos de detección
Aquí las células se lavan dejando solamente las citoquinas unidas al anticuerpo en el
pocillo. 

Se agrega un anticuerpo de detección que es específico para un determinante tipo de

citoquina.  Los anticuerpos de detección utilizados en ELISPOT deben
conjugarse con biotina para hacer posible su reacción con los conjugados
estreptavidina-enzima

Para ello:
 Lavamos la placa 3 veces con PBS y 3 veces PBS-Tween
 Luego añadimos el anticuerpo de detección biotinilado diluido en PBS-Tween-
BSA.  
 Se sella la placa y se incuba a 4 ° C durante la noche o durante 2 horas a
temperatura ambiente. 

5. Conjugado de estreptavidina y enzima

El marcaje del anticuerpo de detección se realiza indirectamente, mediante una

reacción estreptavidina-biotina. Las enzimas más utilizadas para el conjugado son
HRP o AP como conjugados de estreptavidina como menciono mi compañero.
 Lavamos la placa 4 veces con PBS-Tween
 Añadimos el conjugado enzimático a una concentración optima.
 Sellamos la placa e incubamos a temperatura ambiente durante 1-2 horas.
 Finalmente volvemos a lavar la placa 3 veces con PBS-Tween y 3 veces con
PBS
6. Adición de sustrato

Este paso consiste en la adición de un sustrato cromogénico, el cual conduce a un

desarrollo de manchas catalizado por enzimas.

Independientemente del conjugado enzimático que se utilice, sus sustratos

correspondientes deben producir colores intensos y estables.
 Añadimos la solución de sustrato
 Monitoreamos el desarrollo de manchas a temperatura ambiente
 Para detener la reacción enjuagamos la placa con agua y secándola con papel
absorbente. 
 Finalmente secamos la placa al aire durante la noche o hasta que esté
completamente seca
7. análisis
os puntos se cuentan en un lector ELISpot automático o bajo un microscopio de
disección y se calcula la frecuencia de secreción de células.

 Cuente los puntos manualmente con un microscopio o utilizando una unidad

automatizada de adquisición / análisis de imágenes.
*Las placas se pueden almacenar y analizar hasta por 3 meses.