PROTOCOLO DE TRANSFORMACIÓN DE BACTERIAS COMPETENTES

1. Preparar bacterias E. coli competentes (DH5 o BL21) y mantenerlas en alícuotas al

menos a -80°C.
2. Tomar una alícuota y descongelarla en hielo justo antes de su uso.
3. Descongelar en hielo el plásmido que será transformado.
4. En condiciones asépticas, tomar 1g de plásmido y adicionarlo en 30L de bacterias.
Mezclar suavemente con la ayuda de la punta de la pipeta. Mantener por 20 min en
hielo.
5. Transcurrido el tiempo, introducir la mezcla en un baño a 42°C por 2 minutos.
6. Inmediatamente después introducir la mezcla nuevamente en hielo por 3 minutos.
7. En condiciones asépticas, adicionar 1mL de medio LB o SOC y cultivar a 37°C por al
menos 25 minutos.
8. Posteriormente, centrifugar a 13,000rpm durante 2 min. Desechar sobrenadante,
dejando aproximadamente 100L.
9. Resuspender la biomasa en el medio residual y adicionar a una placa con medio LB y
ampicilina a 150g/mL. Realizar extensión por varilla.
10. Incubar durante al menos 16h a 37°C.
11. Transcurrido ese tiempo, cultivar clonas en medio líquido LB con 150g/mL de
ampicilina para hacer extracción de plásmidos o inducción proteínica. (Ver protocolo
de lisis alcalina)

PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE PLÁSMIDOS DE BACTERIAS E.COLI DH5 TRANSFORMADAS.

(LISIS ALCALINA)

1. Preparar soluciones P1, P3 y P3.

2. Tomar una colonia de la caja de bacterias transformadas por cada miniprep a realizar.
3. Inocular 3mL de medio LB que contiene 150g/mL de ampicilina.
4. Incubar durante al menos 16h a 37°C y agitación.
5. Recuperar en microtubos y centrifugar a 13,000 rpm por 2 min. Descartar medio.
6. Al botón de biomasa añadir 300L de Solución 1 (P1) y resuspender el botón con
ayuda de una punta o vórtex.
7. Añadir 300L de solución 2 (P2) y mezclar suavemente. Esperar 3 min.
8. Añadir 300L de solución 3 (P3) y mezclar suavemente. Esperar 3 min.
9. Centrifugar a 13000 rpm, 2 min.
10. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.
11. Añadir 750L de EtOH y 150L de Ac. Amonio 7.5M o NaCl 3M.
12. Dejar a -20°C al menos media hora, preferentemente toda la noche.
13. Centrifugar 35 minutos a 13,000 rpm.
14. Decantar sobrenadante.
15. Adicionar 300L de EtOH 70% y mezclar suavemente.
16. Centrifugar por 5 minutos a 13000 rpm. Decantar sobrenadante.
17. Repetir pasos 15 y 16.
 18. Dejar secando los tubos boca-abajo sobre un papel absorbente limpio hasta que se
haya evaporado el alcohol.
19. Resuspender en 50L de agua libre de nucleasas, agua destilada estéril, agua grado
milliQ o buffer TE.
20. Mantener a -20°C hasta su uso.
21. Cuantificar la muestra y correrla en un gel de electroforesis de agarosa al 0.7% para
determinar integridad y tamaño.

PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO DE UN CULTIVO DE BACTERIAS

1. Precalentar la solución base de CTAB (EDTA, Tris, NaCl) a 60ºC; posteriormente

adicionar el CTAB y BME a la solución.
2. De un cultivo líquido de 3mL de bacterias en fase log recuperar la biomasa en un
microtubo. Transferir 1.5mL del cultivo al microtubo y centrifugar a 13000rpm por
2min. Descartar sobrenadante. Hacer lo mismo con los 1.5mL de cultivo restantes en
el mismo tubo.
3. A la biomasa, adicionar 1mL de CTAB preparado y resuspender la biomasa con la ayuda
de una punta de micropipeta.
4. Calentar a 65ºC 1h ó 75ºC 25min.
5. Enfriar a temperatura ambiente.
6. Dividir el volumen total de la biomasa lisada con CTAB en dos microtubos con el mismo
volumen en cada uno.
7. Adicionar un volumen de mezcla fenol-cloroformo 1:1 o fenol-cloroformo-alcohol
isoamílico 25:24:1 y mezclar suavmente 1 minuto, invirtiendo el tubo.
8. Dejar el tubo en posición vertical 2 minutos y centrifugar 2 minutos a 13000rpm.
9. Recuperar la fase acuosa de ambos tubos y repartirla cuantos microtubos sea
necesario, adicionando a cada tubo un máximo de 500L. EVITAR LLEVARSE LA
INTERFASE EN ESTA ETAPA POR LO QUE SE SUGIERE RECUPERAR HASTA UN 80% DE LA
FASE ACUOSA. (Repetir los pasos 7, 8 y 9 si se requiere obtener un mayor grado de
pureza del ADN).
10. A cada tubo que contiene 500L de fase acuosa adicionar 150L de NaCl 5M y 850L
de etanol absoluto (100%).
11. Mezclar por inversión suavemente y dejar a -20ºC al menos 24 h.
12. Centrifugar los tubos a 13000rpm por 15 minutos. COLOCAR LOS MICROTUBOS EN LA
CENTRÍFUGA DE MANERA QUE LA BISAGRA DE LA TAPA QUEDE HACIA AFUERA DEL
ROTOR.
13. Decantar sobrenadante con cuidado de no desprender la pastilla precipitada de ADN.
ES POSIBLE QUE NO SE OBSERVE EL PRECIPITADO DE ADN SI LA CANTIDAD
RECUPERADA ES POCA, SIN EMBARGO, ÉSTE SE ENCONTRARÁ ADHERIDO AL TUBO
POR LA PARTE QUE HAYA QUEDADO HACIA AFUERA DEL ROTOR.
14. Adicionar 500L de etanol 70% y mezclar por inversión suavemente.
15. Centrifugar a 13000 rpm por 5 minutos.
16. Decantar sobrenadante.
17. Repetir pasos 16 al 18, si se requiere dejar el ADN con mayor grado de pureza.
 18. Dejar secando los tubos boca-abajo sobre un papel absorbente limpio hasta que se
haya evaporado el alcohol.
19. Resuspender en 50L de agua libre de nucleasas, agua destilada estéril, agua grado
milliQ o buffer TE.
20. Cuantificar la muestra y correrla en un gel de electroforesis de agarosa al 0.7% para
determinar integridad y tamaño.

COMPOSICIÓN DE SOLUCIONES

ACTIVIDADES PREVIAS

1. ¿Qué son las bacterias competentes con CaCl?

2. ¿A qué se refiere el término transformación bacteriana?
3. ¿Cuál es el fundamento de la transformación bacteriana mediante choque térmico?
4. ¿Qué tipo de antibiótico es la ampicilina y como realiza su función bactericida?
5. ¿Qué diferencia hay entre el ADN genómico y el ADN plasmídico y en donde se
encuentra en una célula procarionte?
6. Investigar la función de cada uno de los compuestos de los dos protocolos de
extracción de ácidos nucleicos.
7. ¿A cuáles absorbancias se lee una muestra de ácidos nucleicos para determinar:
a. Contenido de ácidos nucleícos
b. Contenido de proteínas residuales
c. Contenido de fenol
8. Cómo se relacionan las absorbancias obtenidas de una muestra de
ácidos nucleicos para determinar el grado de contaminación de
proteínas y fenol? Cuál es el intervalo de valores aceptado?
260/280 Para proteinas
260/230 para fenoles
La relción ideal deberia ser de 1.8, si es mas mayo a este valor puede
ser que hay degradación, y si es menor que estan presentes los
compuestos contamientes.
9. ¿Para qué sirve la electroforesis en gel de agarosa en un protocolo de
obtención de ácidos nucleicos?
La electroforesis por otro lado es una técnica para separar las moléculas
según la movilidad de estas en un campo eléctrico a través de una
matriz porosa la cual finalmente las separa por tamaños moleculares y
nos ayuda a ver la integridad del material.

10. Investiga la función de los siguientes compuestos en la electroforesis:

a. Agarosa y la importancia de su concentración en la resolución de los tamaños
de banda.
b. Buffer TAE
c. Buffer de carga
d. Fluorocromos que interactúan con ácidos nucleicos
e. Marcador de peso molecular