GUÍA Nº 1

Análisis de polimorfismos humanos

Aun cuando el genoma de una especie se encuentra altamente conservado, existen

regiones con alto grado de variabilidad, que pueden ser o no codificantes. Para la
detección de los polimorfismos existen distintas técnicas. La forma más directa es la
secuenciación del ADN, pero debido a su complejidad se utilizan otras técnicas mucho
más simples y rápidas, como el análisis de los RFLP (polimorfismos en la longitud de los
fragmentos de restricción) y los VNTR (polimorfismos en el número de repeticiones en
tándem). Los RFLP se basan en la detección de aquellas variaciones de secuencia del
ADN, que tienen como consecuencia un cambio en una Enzima de restricción. Los
fragmentos que se obtienen, mediante estas enzimas de restricción, serán de diferente
tamaño en función de los alelos que presente. Estos fragmentos de ADN representan la
diversidad del genoma dentro de una población. Se han detectado un gran número de
RFLP en el genoma humano, adquiriendo el carácter de marcadores genéticos, que
tienen múltiples aplicaciones que veremos más adelante. Un ejemplo de estos
marcadores es el polimorfismo en un solo nucleótido del gen de la betaglobina, lo que
permite el diagnóstico prenatal de la anemia falciforme.

Se han descrito varios tipos de ADN no codificante, repetitivo y de alta variabilidad, como
las de repeticiones cortas (STR) o microsatélites, que son repeticiones de hasta 5 pb, y
las repeticiones en tándem con número variable (VNTR) o minisatélite, con secuencias
repetidas de entre 7 a 100 pb. Estas regiones de alta variabilidad son útiles para
genotipificación e identificación de individuos. Una característica de los VNTR es que se
encuentran flanqueados por regiones altamente conservadas, lo cual permite mediante el
uso de partidores específicos, dirigidos contra las regiones conservadas, su amplificación.
De esta forma el tamaño del amplicón dependerá del número de repeticiones que
presenta el individuo, y este puede ser de diferente tamaño entre varios individuos. Son
polimorfismos en los que el número de repeticiones en tándem es variable. Estos
marcadores proporcionan mucha información para el análisis de ligamiento genético,
como los mapas genéticos, y para la identificación de individuos en pruebas forenses y de
paternidad.

El locus D1S80 corresponde a un VNTR cuya secuencia a repetir es de 16 pb

(AGGACCACCAGGAAGG). El alelo más pequeño contiene 14 repeticiones, mientras que
el más grande contiene más de 72 repeticiones. En este práctico usted analizará el locus
D1S80 en una población de estudiantes de Ingeniería en Biotecnología.

Usted debe averiguar, es incluir en su informe, la ubicación genómica del locus D1S80, la
secuencia de los partidores, la frecuencia de este polimorfismo en la población y
compararla con la frecuencia obtenida en el laboratorio, la cual usted debe calcular.
Objetivo del Práctico

Analizar el locus D1S80 en una población de estudiantes de Ingeniería en Biotecnología.

Metodología

1. Lave sus manos y póngase guantes.

2. A un tubo eppendorf de 1.5ml agregue 1ml de PBS 1X

3. Utilizando una tórula estéril, extraiga una muestra de células descamativas desde su
mucosa bucal. Libere las células extraídas en el PBS 1X, sumergiendo la tórula y
moviéndola suavemente.

4. Centrifugue a 12000rpm por 1 minuto.

5. Resuspender el pellet en 100µL de agua destilada autoclavada, y de esa suspensión

pasar 50µL a un tubo eppendorf de 1.5mL nuevo.

6. Agregue 200ml de resina chelex-100 a la nueva suspensión e incube a 56ºC por 20

minutos.

7. Vorteree a alta velocidad por 10 segundos. Incube a 100ºC por 8 minutos.

8. Vorteree a alta velocidad por 10 segundos. Centrifugue a 12000rpm por 2 minutos.

9. Transfiera el sobrenadante a un tubo limpio. NO TRANSFIERA RESINA.

10. Cuantifique el ADN por espectrofotometría.

11. Use 50ng de ADN por cada 50ml de reacción de PCR. Guarde el resto de muestra a -
20ºC.

12. Prepare 50 ul de la siguiente mezcla para la reacción de PCR:

Concentración Inicial Concentración Final
Buffer de polimerasa 10X 1x
MgCl2 (50mM) 2 mM
dNTPs (10mM) 0.5mM
Primers Forw (10mM) 0.25mM
Primer Rev (10mM) 0.25mM
Taq polimerasa 5U/ul 1.25 Unidades
Templado 50ng
13. Realice la amplificación en termociclador utilizando los siguientes parámetros:
Denaturación inicial 95ºC 5 minutos
40 ciclos: Denaturación 95ºC 30 segundos
Alineamiento 67ºC 30 segundos
Extensión 72ºC 60 segundos
Extensión final 72ºC 10 minutos

14. Cargue 25ul de la reacción de PCR en un gel de agarosa 1,5% en TAE 1X.

15. Determine la presencia de homocigotos y heterocigotos, el número de alelos y la

frecuencia de cada uno en la población estudiada.

16. Determine el número de repeticiones para cada alelo, calculando el tamaño del
amplicon en base a la migración del marcador de tamaño. Grafique.

Referencia

Walsh H et al. (1991). Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-
based typing from forensic material. BioTechniques 10 (4), 50-513.