GUIA LABORATORIO N°2: RECUENTO DE HONGOS Y

LEVADURAS
Basado en Norma ISO 7954:1987

1. OBJETIVOS
• Adquirir destreza en la determinación de hongos y levaduras en alimentos.
• Conocer la cantidad de hongos y levaduras que contiene un alimento.
• Aprender a calcular y reportar la presencia de hongos y levaduras en un alimento.
• Realizar informe de resultados obtenidos por la muestra analizada.

2. INTRODUCCIÓN
Comúnmente se da el nombre de mohos a ciertos hongos multicelulares, dotados de un micelio
verdadero, microscópicos y cuyo crecimiento en alimento se conoce por su aspecto aterciopelado y
algodonoso. Las levaduras son hongos que crecen generalmente en forma de agregados sueltos de
células independientes. Debido a su amplia dispersión en todos los estratos bióticos e inertes, se
considera su fácil y frecuente aparición como contaminante en productos alimentarios, ya que estos,
constituidos por sustancias inorgánicas y orgánicas más o menos complejas, constituyen excelentes
medios de reproducción y crecimiento. La presencia de contaminantes fúngicos en alimentos no solo
se interpreta como una fuente potencial de deterioro sino la posibilidad de que muchos de ellos
puedan producir toxinas.

3. PREGUNTAS PRELIMINARES
a) De acuerdo con esta norma colombiana, ¿Cuál es el criterio microbiológico para recuento de
mesófilos, en el alimento que va a usar en este laboratorio?
b) ¿Cuál es la composición del Agar OGY?
c) ¿Que otros medios de cultivo se usan para el crecimiento de hongos y levaduras?
d) ¿A qué tipo de alimentos se les realiza recuento de hongos y levaduras? De 3 ejemplos

4. MATERIALES
• 3 Cajas de Petri estériles
• 3 Pipetas de 1 ml estériles
• 1 Frasco de dilución con 90 ml de agua peptonada al 0,1%
• 1 Pipeta de 10 ml (para muestras de alimento liquidas)
• 3 Tubos de 16x150mm tapa rosca con 9 ml de agua peptonada 0,1%
• Asa de Drigalsky
• Azul de Lactofenol
• Papel estéril
• Marcador de vidrio
• Vinipel
5. MEDIOS DE CULTIVO
• 60 ml Agar OGY o Extracto de levadura-glucosa-cloranfenicol (YPG)

6. EQUIPOS
• Pipeteador
• Incubadora a 25°+/- 2°C
• Contador de colonias
• Balanza con sensibilidad de 0,2 g
• Baño de agua –control termostático 45+/- 1°C para templar el agar
• Microscopio

7. PROCEDIMIENTO

a) Tomar 10 g de muestra de alimento y macerarla; en caso de que la muestra sea liquida tome 10
ml en pipeta estéril y agregue en el frasco que contiene 90 ml de agua peptonada al 0,1%
mezclando para homogeneizar la dilución.
b) Realizar diluciones en base 10 del alimento (10-2, 10-3, 10-4 ) transfiriendo 1ml de la muestra previa
en 9 ml de agua peptonada 0,1% (evite muestrear espuma). Agite todas las diluciones 20 veces
c) Sembrar en superficie 0,1 ml de cada una de las diluciones seleccionadas, en Cajas Petri con Agar
OGY separadas y debidamente marcadas.
d) Extender cuidadosamente el inoculo sobre la superficie de la placa con la ayuda de una varilla de
vidrio acodada y estéril (asa de Drigalski, esterilizar el asa con alcohol y flameado en la llama de
un mechero)– ver https://youtu.be/7g7IjQagYFs
e) Invierta las Cajas de Petri solidificadas
f) Incubar rápidamente a 25°C por 5 dias

8. RECUENTO (rango de conteo 15-150)

Después del periodo de incubación, se cuentan las colonias de las cajas que contengan un máximo
de 150 colonias (rango entre 15-150), con la ayuda de un contador de colonias (si no tiene un
contador puede utilizar una superficie oscura para mejorar la visibilidad de las colonias).
Realizar tinción con azul de lactofenol en colonias con características macroscópicas diferentes, para
confirmar características al microscopio.

9. EXPRESIÓN DE RESULTADOS

9.1 RECUENTO DE MICROORGANISMOS EN ALIMENTOS (Recomendaciones

Instituto nacional de Salud avaladas por Ministerio de Protección Social de Colombia
y el INVIMA)
Criterio de selección: cuando se va a realizar el recuento se debe seleccionar las diluciones para
microorganismos mesófilos, el rango que se utiliza es de 15 a 150 colonias.
Caso general : Se calcula el promedio de colonias para cada una de las diluciones a examinar
multiplicando el resultado por el factor inverso de la dilución respectiva, a partir del recuento de dos
diluciones sucesivas.
Dividir el resultado obtenido de la mayor dilución (Menos concentrada) por el resultado de la menor
dilución (más concentrada).
Si el cociente de esta división es mayor a 2, reportar el resultado obtenido en la dilución más
concentrada, pero, si el cociente es menor de 2 reportar la media aritmética de los recuentos de las
dos diluciones consecutivas.

Se redondea el resultado calculado a dos cifras significativas. Para esto si la última cifra es inferior a
5 la cifra anterior no se modifica; si la última cifra es 5 o mayor, la cifra anterior se incrementa en una
unidad. Se prosigue así hasta que se obtengan dos cifras significativas.

Los resultados se expresan en UFC por gramo o mililitro de producto según la naturaleza de este,
expresado como un número entre 10 y 99 (dos cifras significativas enteras) multiplicado por 10x
donde x es la potencia apropiada de 10.

Ej. A partir de un análisis para una leche pasteurizada se obtuvieron los siguientes resultados:
-2
- en la primera dilución seleccionada (10 ): 168 UFC y 215 UFC.
-3
- en la segunda dilución seleccionada (10 ): 35 UFC y 45 UFC.

-2
10 = 168 + 215 X 10 2 = 19.150
2
-3
10 = 35 + 45 X 10 3 = 40.000
2

40.000 = 2,08
19.150

Como el cociente es mayor de dos se reporta el resultado de la menor dilución:

-2
10 = 19.150 UFC/ml.

Al redondear la cifra como se especificó anteriormente, se obtiene como resultado 19.000,

3
expresado con dos cifras significativas es 19x10 UFC/ml.

Es frecuente que al realizar las diluciones se den condiciones diferentes y no se caiga dentro del
rango, en ese caso existen diferentes reglas las cuales se presentan en la tabla 1.
Tabla 1. Variantes en el recuento de microorganismos

Variante Que hacer Ejemplo

Cuando el Se descarta el recuento Ej. Se hizo un recuento en una torta, los datos
número de UFC obtenido en la mayor obtenidos son los siguientes:
se encuentra por dilución y se calcula la 10-1: 5 y 7 UFC
debajo del rango media aritmética de las 10-2: 1 y 2 UFC
mínimo en ambas colonias presentes en las 10-3: 0 UFC en dos cajas
cajas de una o de dos cajas de la menor
las dos diluciones dilución multiplicándose En este caso tomo la menor dilución:
consecutivas por el inverso de la 5+7 / 2 = 6
dilución y se informa el 6 x 101 UFC/g C.E (conteo estimado)
resultado como Conteo
estimado de UFC por gramo
o mililitro

Cuando la última El recuento en toda la caja
dilución se sale es difícil por lo cual se
del rango puede dividir la caja y
contar solo una sección (el
máximo a dividir es en
octavos) y se informa
como conteo estimado
(C.E).
Ejm. Se hizo un recuento de un jugo de piña,
donde se obtuvieron los siguientes recuentos:
10-1 : Mayor de 1600 dos cajas
10-2 : Mayor de 1600 en dos cajas
10-3 : caja 1 en 1/8 : 135 y en la caja 2 en 1/8:
147
Se toma y se multiplica por ocho, ya que este
fue el resultado en cada octavo.

Se cuentan las colonias en 135 x 8 = 1080 y 147 x 8=1176.

la sección, se multiplica Se saca el promedio 1080+1176 = 2256/2 =
por el número de 1128 x 103.
divisiones de la caja, se Se informa de la siguiente manera: 11X105
promedia con la otra caja UFC/ml de alimento analizado C.E (Conteo
y finalmente se multiplica estimado)
por el inverso de la
dilución. Ejm: Se hizo un recuento en un tamal
tolimense y los datos obtenidos son los
siguientes:
Cuando el conteo de Primera dilución 10-2: > 1600 UFC en dos cajas
colonias exceda de 200 en Segunda dilución10-3: > 1600 UFC en dos cajas
1/8 de la caja se reportará Al dividir las cajas de 10-3 en 8 se contó en un
como >1600 UFC/gr o ml cuadrante 240 colonias y 230 colonias
multiplicadas por el respectivamente.
inverso de la última En este caso se toma la última dilución
dilución y Conteo >1600 x 103 : > 1600000
estimado. y se informa de la siguiente manera:
> 16 x 105 UFC/g de alimento C.E. (Conteo
estimado)
 Si en la dilución Se informa como menor Ej.: Se hizo el recuento de una pasta de
más concentrada de 1 y se multiplica por el tomate donde los resultados obtenidos
no aparecen inverso de la dilución. fueron:
microorganismos. <1x10X UFC/gramos o ml 10-1 Cero
según corresponda. 10-2 Cero
10-3 Cero
Si la dilución más
concentrada sembrada Se informa < 10 UFC/g de alimento analizado.
fue 10 , se informa como:
-1

< 10 UFC/g de alimento

analizado.
Si la dilución más
concentrada sembrada
fue 10 , se informe como
-2

: < 100 UFC/g de alimento

analizado.
(Carrascal, et al. 2003)

9.3. Reporte de Resultados

Para el caso del presente laboratorio realice el reporte siguiendo los criterios del Ministerio de
Protección Social e Invima (9.1), escoja la dilución indicada de acuerdo con los criterios
anteriormente descritos, haga los cálculos e informe el resultado. Importante reportar siempre el
resultado preferiblemente como el número de microorganismos (UFC) por mililitro (productos
líquidos) o por gramo (otros productos).
Importante revisar la normatividad para verificar si el recuento cumple con lo que pide la norma
para el alimento seleccionado.

10. REFERENCIAS
• ICONTEC. 2009. Norma Técnica Colombiana NTC 4092. Microbiología de los alimentos y
productos para alimentación animal. Requisitos generales y directrices para análisis
microbiologicos Bogotá, Colombia.
• Madigan, M. Martinko, J. Parker, J. 2015. Brock, Biología de los microorganismos. Décima edición.
Editorial Pearson education. S.A. Madrid. Pag 1026.
• Carrascal, A. K., Paez, A., & Burbano , M. (2003). Manual de Laboratorio. Microbiología de
alimentos. CEJA. Bogotá. Bogotá: CEJA.
• Cabeza, E.A., Ortiz, J.F. (s.f). Guía General para el recuento de microorganismos en alimentos.
Universidad de Pamplona, Facultad de ciencias Básicas, Departamento de Microbiología.
Bucaramanga.