DILUCIONES

Si se sospecha que una muestra tiene una gran cantidad de microorganismos por mL o g,
la muestra se diluye. Al diluir la muestra antes de hacer la prueba, se evita que las placas
tengan exceso de colonias, permitiendo obtener diluciones con un número de colonias
entre 25 y 250 CFU/ml o g. El plan de dilución que más frecuentemente se utiliza
consiste en diluir la muestra por un factor de 10. La muestra se diluye con una solución
salina estéril, 0.85% NaCl of 0.1% peptona. Usualmente en este laboratorio se utilizan
botellas de dilución con un volumen de 90 ó 99 ml.
1. La muestra ya sea sólida o líquida se considera que tiene un factor de dilución de
100 ó 1 (no-diluida).
2. Si el diluyente tiene 90 ml de solución estéril, para hacer una dilución 1/10,
transfiera 10 ml ó 10 g al blanco. Esta es la dilución 10-1.
3. Continúe haciendo las diluciones necesarias.

Para diluciones utilizando un volumen de 99 ml de diluyente, puede añadir 11 ml

para hacer solución de 10-1 ó 1 ml para hacer dilución 10-2.

El mismo procedimiento aplica al poner la muestra en placa. Si se toma 1 ml de muestra

del la dilución 10-3 y se añade agar, tienes la misma dilución en la placa que tienes en el
tubo. Si transfieres 0.1 ml de la muestra de la botella de dilución y le viertes agar, has
procedido a hacer una próxima dilución (0.1 ml de la dilución 10 -3 en la placa se
convierte en la dilución 10-4).

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REPORTE DE RESULTADOS

Cuando se contabilizan las placas, es importante seguir las siguientes reglas. Debes
incluir:

 Dos cifras significativas

 Factor de dilución
 UFC / ml ó UFC / g
 Contaje estándar de placa (SPC) ó contaje estimado estándar de placa (ESPC)

SOLO SE REPORTA UN CONTAJE POR MUESTRA, NO POR DILUCION.

Cuando se calculan los resultados de placas en duplicado se reporta la media geométrica

(promedio). En la práctica, se utiliza el promedio para reducir estadísticamente las
muestras que se salen del centro así como para encontrar el contaje de placa promedio
cuando se trabaja con un gran número de placas.

PLACAS NORMALES: CONTAJE ESTANDAR DE PLACAS (SPC)

Primero, anote la dilución de la placa que está contando. Luego cuente las colonias que
aparecen en la placa. Anote los resultados de las placas que tengan entre 25 a 250
colonias. Incluya las colonias pequeñas cuanto reporte sus resultados. Para reportar los
resultados, promedie los contajes de placas en duplicado. Ajuste para 2 cifras
significativas. Incluya el factor de dilución y reporte como “UFC/g ó UFC/ml” SPC.

Muestra Placa 100 10-1 10-2 Contaje

reportado
Leche A TNTC 243 22 2.4 x 103
pasterizada UFC/ml SPC
B TNTC 236 18

En el ejemplo anterior, no puedes utilizar los resultados de la dilución 10-2 porque el

número de colonias en una de las placas está fuera del rango 25-250. Sin embargo sería
aceptable reportarlos como estimado (2.0 x 104 UFC/ml ESPC).

PLACAS CON MUCHAS COLONIAS: CONTAJE ESTIMADO DE PLACA

ESTANDAR

Puedes estimar el contaje de varias formas. Si utilizas un contador de colonias, el sistema

de rejillas divide la placa en 56 áreas iguales. Escoge un área representativa de la placa y
haz un estimado contando por lo menos 6 cuadrados. Saca el promedio de los cuadrados
y multiplica por el factor de dilución. De nuevo, promedia los resultados de las placas
duplicadas y ajusta a dos cifras significativas. Incluye el factor de dilución y reporta los
resultados como “UFC/g ó UFC/ml” ESPC.

Muestra Placa 100 10-1 10-2 Estimado Contaje reportado

2
 De 10-2
Ensalada A TNTC TNTC TNTC 412 4.4 x 104 UFC/ml
de papas ESPC
B TNTC TNTC TNTC 478

PLACAS CON POCA DENSIDAD: CONTAJE ESTIMADO DE PLACA

ESTANDAR

Para placas con contajes bajos, existen dos opciones al reportar los resultados. El
primero es contar las colonias y reportarlas como ESPC. La otra situación es cuando no
hay colonias en una placa. En este caso el contaje se reporta como “<”que la dilución
más baja.

CONTAJES BAJOS

Muestra Placa 100 10-1 10-2 Contaje reportado

Ensalada A 12 0 0 9.0 x 100 UFC/ml ESPC
de papas
B 6 0 0

NO-CRECIMIENTO

Muestra Placa 100 10-1 10-2 Contaje reportado

Ensalada A 0 0 0 <1.0 X 102 UFC/ml ESPC
de pasta
B 0 0 0

PROBLEMAS DE PRÁCTICA DE DILUCIONES

1. 1 ml de cultivo de bacterias se diluye con 9 ml de peptona. 1/10 de ml de está

dilución se diluye en 9.9 ml de peptona. De ésta dilución 1/10 de ml se pone en
una placa con 25 ml de medio. Luego de 24 horas de incubación se contaron 219
colonias. ¿Cuántas células había en el cultivo original? Muestra todo tu trabajo.
¿Tendrá efecto la cantidad de medio de la placa?

2. Cinco gramos de yogurt se mezclan con 45 ml de agua de peptona. Se hacen dos

diluciones sucesivas de 1/100. 1/10 de ml se pone en placa de la última dilución.
Esto se hace en duplicado. Luego de incubar se obtienen los siguientes
resultados: 75 UFC y 73 UFC. Calcula el número de UFC/g de yogurt.

3. a. La muestra consiste de 10 ml de una dilución de 10-1 de jugo de repollo. La

asignación es hacer contaje total de placa aeróbica, tal que cada placa es inoculada
con 0.1 ml. Se hacen en placa las siguientes diluciones: 10-2, 10-3, 10-4 y 10-5. Haz
un diagrama del procedimiento indicando las cantidades de diluyentes e inoculo a
utilizar.

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 b. Si se obtienen 120 colonias en la placa inoculada con 0.1 ml de la dilución 10-2,
¿cuál será el UFC/ml en el jugo de repollo sin diluir?

4. ¿Se esperaría el mismo # de UFC en 10 ml de la dilución 10-2 de una muestra?,

que ¿en 1 mL de la muestra sin diluir?

5. Un gramo de yogurt se añade a 99 ml de agua de dilución. Se hacen cuatro

diluciones de 1/10 y se pone en duplicado en placa 1/10 de ml en PCA. Luego de
incuban y se obtienen los siguientes resultados:

Dilución hecha de yogurt CFU/ml

Dilución inicial TNTC, TNTC
Primera dilución 1/10 TNTC, TNTC
Segunda dilución 1/10 442, 432
Tercera dilución 1/10 52, 48
Cuarta dilución 1/10 7, 3

Utilizando estos datos, calcula el número de UFC/g de yogurt.

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