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Universidad Santiago de Chile

Facultad de Ingeniera Qumica


Ingeniera en Biotecnologa

EXTRACCIN DE ARN TOTAL Y


VISUALIZACIN EN ELECTROFORESIS
EN GELES DE AGAROSA.

NOMBRE
Lissette Riveros Zuiga
CURSO
Biologa molecular
FECHA
13/11/2014
PROFESOR
Sebastin Reyes Cerpa

INTRODUCCIN

Por
su
composicin,
puede
definirse
qumicamente
como
un polirribonucletido de adenina, guanina, citosina y uracilo. A esta diferencia
qumica con el ADN, hay que aadir que su estructura molecular
es monocatenaria, es decir, que se trata de una sola cadena de nucletidos unidos
por enlaces fosfodister en sentido 5 -> 3 y siempre de menor tamao que el
ADN.(1)
Existen 3 tipos de ARN; el ARN mensajero es el que se encuentra en menor
proporcin (menos del 5% del ARN celular), pero puede ser el de mayor longitud,
aunque esta es muy variable y depende de la cantidad de informacin que
reproduzca del ADN. (2)
El ARN ribosomal, el cual es el ms abundante (algo ms del 75% del total) y el de
mayor tamao y peso molecular. Se localiza en los ribosomas, a los que da
nombre, pues es su componente mayoritario (en torno al 60%). Est asociado a
protenas y proporciona la estructura a cada una de las dos subunidades de
aspecto de globo de las que constan estos orgnulos. (2)
El otro tipo de ARN corresponde al de transferencia, este se encuentra disperso
por el citoplasma, constituye en torno al 15% del total de ARN y es el de menor
peso molecular, ya que consta de tan solo 70 a 90 nucletidos. Su estructura es
muy caracterstica, pues la cadena se pliega sobre s misma por el emparejamiento de bases complementarias y crea as cuatro zonas o brazos helicoidales,
tres de los cuales terminan en un bucle con bases sin emparejar. El conjunto se
puede considerar como una estructura secundaria y se conoce como estructura
en hoja de trbol; esta sufre otro plegamiento superior y adquiere una estructura
terciaria en forma de L.(2)
La clave de la purificacin de RNA radica en evitar su degradacin poraccin de
las ribonucleasas. De manera que todos los protocolos existentes sebasan en la
rpida inactivacin de dichas enzimas. (3)
Para la extraccin de cidos nucleicos existen procedimientos descritos por
autores como Pfannenstiel et al. (1980),Chomczynski y Sacchi (1987), Palls et al.
(1987), Yang et al.(1992), y Lee (1995).(5)
El mtodo de Chomczynski y Sacchi, en el cual el principio en la base del mtodo
es que el ARN se separa del ADN despus de la extraccin con una solucin
cidaque contiene tiocianato de guanidina , acetato de sodio , fenol y cloroformo ,
seguido por centrifugacin. En condiciones cidas, el ARN total permanece en la
fase acuosa superior, mientras que la mayora del ADN y las protenas

permanecen ya sea en la interfase o en la parte inferiorfase orgnica. El ARN total


se recupera a continuacin por precipitacin con isopropanol y se puede utilizar
para varias aplicaciones. El original protocolo, lo que permite el aislamiento de
ARN a partir de clulas y tejidos en menos de 4 horas, avanzado enormemente el
anlisis de la expresin gnicaen modelos de animales y plantas, as como en las
muestras patolgicas. (3)
Una tcnica eficiente para observar el ARN extrado es la electroforesis. El trmino
electroforesis se usa para describir la migracin de una partcula cargada bajo la
influencia de un campo elctrico. Muchas molculas importantes biolgicamente
(aminocidos, pptidos, protenas, nucletidos, cidos nucleicos) poseen grupos
ionizables y existen en solucin como especies cargadas, bien como cationes, o
bien como aniones. Estas especies cargadas se van a separar en funcin de su
carga cuando se aplica un voltaje a travs de los electrodos. (7)
La electroforesis en gel es una tcnica muy utilizada para separar molculas o
fragmentos de molculas de cidos nucleicos. Los materiales ms comunes para
separar molculas de cidos nucleicos son polmeros como la poliacrilamida o la
agarosa. Estos geles se colocan en la cubeta de electroforesis, sumergidos en un
tampn de pH alrededor de 8. De esta forma, las molculas de DNA o RNA
sometidas a electroforesis se desplazarn al polo positivo ya que a pH superiores
a 5 poseen carga negativa. Los geles se comportan como un tamiz molecular y
permiten separar molculas cargadas en funcin de su tamao y forma. As,
molculas de ARN de diferente tamao, van a emigrar de forma distinta en un gel
de electroforesis. Es importante la utilizacin de marcadores de tamao conocido
porque nos permitirn calcular los pesos moleculares de las muestras de ARN
problema. En el caso de los geles de agarosa, se le aade bromuro de etidio,
sustancia que se intercala entre las bases del ARN enrollado y es fluorescente
cuando se ilumina con luz ultravioleta. Tras la electroforesis, se visualiza el gel con
una lmpara de luz UV, y se vern las bandas correspondientes a las muestras de
ARN aplicado y los marcadores de peso molecular. (7)

OBJETIVOS

Obtener ARN total a partir de las clulas Raw 264


Obtener separados los tipos de ARN basndonos en su diferencia en peso
molecular.
Evaluar la integridad de cada tipo de ARN extrado mediante la realizacin
de la electroforesis.
Determinar la efectividad del mtodo de Chomczynski y Sacchi en la
extraccin de ARN a partir de clulas Raw 264.

MTODOLOGA

a) Separacin de molculas de una clula con fenol-cloroformo.


A 90 mm de clulas Raw 264 crecidas a confluencia estimuladas con Poli:C se les
agreg 1 ml de TriSsure.
A esta mezcla se le agreg 200 L de cloroformo, se agit la mezcla en un vortex
y se incub durante 3 minutos a temperatura ambiente. Luego se centrifug el
homogeneizado por 15 minutos a 14.000 rpm en una microcentrifuga Eppendorf a
4C.
b) Extraccin de ARN
Se recuper 500 L de fase acuosa (fase superior) luego del centrifugado con una
micropipeta y se deposit en otro tubo Eppendorf. A este segundo tubo se le
agreg 0,5 L de isopropanol fro. Se homogeneiz la mezcla por inversin 6
veces y se incub a temperatura ambiente por 30 minutos.
Se centrifug la mezcla preparada por 10 minutos a 14.000 rpm y luego se elimin
el sobrenadante a pulso.
Se agreg 1 ml de Etanol 75% fro al tubo Eppendorf que contiene el pellet y se
centrifug por 5 minutos a 75.000 rpm a 4C.
Una vez terminada la centrifugacin, se elimin completamente el sobrenadante
con una micropipeta.
Se dej secar el ARN al aire durante 30 segundos y se agreg 50 L de agua libre
de nucleasas. Se calent durante 20 minutos a 64,6C.

c) Separacin del ARNs por electroforesis


Se realiz electroforesis sobre gel de agarosa al 1% en buffer TAE 1X.
En los pocillos ubicados el extremo negativo del gel (donde tenemos el electrodo
negativo) se sembraron 10 L de las muestras de ARN con 2L de buffer de carga
6X; en los costados del gel tenemos las muestras estndar y en el centro tenemos
la muestra de ARN anteriormente mencionadas. El marcador de tamao conocido
de partcula que se us para comparar nuestra muestra fue el OGeneRuler 1 kb
DNA Ladder, ready-to-use #SM1163.
Se encendi la mquina de voltaje y se le aplic una corriente de 90 volts durante
45 minutos.
Se llev el gel bajo luz ultravioleta se sac una fotografa.
RESULTADOS

Al mirar bajo luz UV el gel de agarosa con el ARN y la muestra de peso conocido
se puede observar la siguiente imagen.

Figura 1
Muestras ARN luego de
aplicada la electroforesis

En la figura 1 se puede observar que a ambos extremos de la imagen tenemos


muestras de ARN de peso molecular conocido (M.E.), mientras que en el centro
encontramos la muestra de ARN a analizar (C2).
En las columnas peso molecular conocido se observan bandas de distintos
espesor e intensidad. Se aprecia que en el extremo superior tenemos una gran
cantidad de bandas acumuladas, mientras que cuando descendemos se observan
bandas ms separadas entre s. Estas bandas tienen pesos moleculares que van
desde los 10.000 y 250 pb(miradas desde arriba hacia abajo)

En la columnaC2 aprecian 2 bandas de color intenso, las cuales estn a la altura


entre los 750 pb y los 500 pb, mientras que la segunda banda intensa se

encuentra entre los 500 pb y 250 pb. Por otro lado se aprecia que en el extremo
inferior de la columna C2 hay una banda intensa pero difusa muy por debajo de
los 250 pb. Por otro lado, a lo largo de la columna seque hay un difuminado con
intensidad variable a lo largo de la columna.

DISCUSIN

La metodologa utilizada result ser efectiva, ya que en los geles de agarosa


efectivamente se pudo apreciar ARN.(8)
El mtodo en general se bas en la separacin de componentes moleculares de la
clula dada por su afinidad a distintas soluciones. El rol del TriSsure en este
prctico fue lisar las clulas dado que en l podemos encontrar isocianato de
guanidina, el cual permite durante la homogenizacin de la muestra mantener
ntegro el ARN, al mismo tiempo que altera la estabilidad de las clulas y disuelve
los componentes moleculares.(5)
La adicin de cloroformo, seguida de centrifugacin separa la muestra en dos
fases, una de ellas acuosa y la otra orgnica. El ARN permanece exclusivamente
en la fase acuosa. De esta manera se est asegurando la separacin de esta
molcula de los dems componentes existentes en las clulas Raw 264. Los
siguientes pasos realizados fue para lavar el ARN en caso de que tenga residuos y
llegar a un pellet de ARN puro. (5)

En la electroforesis se puede apreciar que el porcentaje con que se hizo la


agarosa era la indicada para hacer la separacin de la molcula ya que el ARN
puedo escurrir lo necesario por los poros del polisacrido. (7)
Se observa que ARN se movi al encender la corriente en los electrodos desde el
polo negativo hacia el extremo positivo que se encuentra en la parte inferior de la
figura 1, esto se debe a que el ARN es una molcula negativa dada por la carga
del fosfato encontrado en el nucletido.(2)
El marcador de peso molecular estndar usado en este prctico fue el O
GeneRuler 1 kb DNA Ladder, ready-to-use #SM1163. (12)

Figura 2: Marcador de peso


molecular conocido. O
GeneRuler 1 kb DNA Ladder,
ready-to-use #SM1163.

En la figura 1 se puede observar que en la columna C2 tenemos manchas de


colores amarillo intenso, estas son bandas de ARN, las podemos ver de esta
manera ya que en el gel tenemos un marcador sensible a la luz UV (bromuro de
etidio), el cual se ubica dentro de los pliegues de la simple cadena del ARN a
medida que esta molcula avanza, permitiendo observar la ubicacin del ARN en
el gel. (9)
Dado que los distintos tipos de ARN presentan diversas formas y tamaos, en el
gel de agarosa se producir una diferenciacin de acuerdo a estas caractersticas.
(9) Sin embargo, dado que el ARN ha sido calentado, se ha producido una
desnaturalizacin de las hebras y por ende solo estaremos comparando tamao,
no as su conformacin, teniendo como consecuencia que la velocidad de
migracin slo depende la longitud de cada cadena. (1)
Tericamente se sabe que el ARN ribosomal, es el ms abundante (algo ms del
75% del total de ARN) y el de mayor peso molecular. (2) En eucariotas los ARNr
5S, 5,8S y 28S forman parte de la subunidad mayor de los ribosomas, mientras
que el ARNr 18S forma parte de la subunidad menor. Estos ARN tienen los
siguientes pesos moleculares: el 28S tiene 5400 nucletidos, 18S cuenta con 2100
nucletidos, el 5.8S suma 158 nucletidos y el 5 S que es el ms pequeo tiene
120 nucletidos.

El ARN de transferencia se encuentra disperso por el citoplasma, constituye en


torno al 15% del total de ARN y es el de menor peso molecular, ya que consta de
tan solo 70 a 90 nucletidos.(2) El ARN mensajero, el cual es una subcategoria de
los ARN pequeos nucleolares, se encuentran en menor proporcin, ya que
representa menos del 5% del ARN celular. Este tipo de ARN puede llegar a ser el
de mayor longitud de todos, sin embargo esta longitud vara de acuerdo a la
cantidad de informacin que reproduzca del ADN. (2) Se ha estudiado que estos
ARN tienen entre 1000 y 1500 nucletidos. (9)
De acuerdo a las caractersticas sealadas, se puede inferir a partir de la
electroforesis estimada que en las dos primeras bandas encontramos ARN
ribosomal, en donde, la primera banda que se encuentra entre los 750pb y 500pb
corresponde a ARNr 28S, la segunda banda ubicada entre los 500pb y los 250 pb
corresponde a ARNr 18S. (11) Bajo estos ARN encontramos los ARN mensajeros,
los cuales se presentan como un SMIR dada su baja concentracin y por su
diversidad de tamaos. (9) Finalmente, en la ltima banda poco definida, la cual se
encuentra por muy debajo de los 250 pb encontraremos ARN de transferencia
junto con los ARNr 5S y 5,8S por su peso molecular. Dado que la banda no se
encuentra lo bastante definida, por lo que se puede deducir que este ARN no est
ntegro. (9)
De los resultados observados en el gel de agarosa, se puede observar que la
muestra de peso molecular conocido no refleja de manera correcta los pesos
moleculares de cada ARN presentes en el gel. Sin embargo, podemos rescatar
que el orden en el que se encuentran los ARN estn de manera correcta. De esta
manera, solo se puede rescatar la integridad que presenta cada ARN, la
concentracin y el orden bajo el cual se rigen de manera lineal dado su peso
molecular. (13)
Cada SMIR presentado en la columna representa ARN, los cuales presentan una
amplia diversidad de pesos moleculares debido a que en la clula stos difieren en
su actividad y propiedad. (1)

CONCLUSIN

El mtodo de extraccin de ARN a partir de clulas Raw 264 por el mtodo de


Chomczynski y Sacchi result ser un mtodo eficiente y selectivo, lo cual se pudo
apreciar en la electroforesis realizada, pues se apreciaron bandas fluorescentes
bajo la luz ultravioleta como era esperado.
La separacin de molculas con carga en electroforesis resulta tener muchas
ventajas a la hora de analizar muestras, sin embargo se hace necesario conocer el
tamao de poro con el que se va a trabajar para una alta eficiencia.
Dado que existen 3 tipos de ARN, cada uno con distinto peso molecular, en el gel
de agarosa se puede apreciar su diferenciacin luego de desnaturalizo ya que se
encuentran todos en su conformacin lineal
Encontramos 2 bandas con ARN ntegro, lo cuales pertenecen a ARN ribosomal
28S y 18S, siendo el 28S de mayor peso molecular, luego se apreci un SMIR de
ARN mensajero no ntegro dado a que el tamao de este ARN depende de la
informacin que transcriba del ADN. Finalmente encontramos el ARN de
transferencia en conjunto con los ARN 5S y 5.8S que son los de menor peso
molecular.

REFERENCIAS

1. Introduccin a la biologa celular. Bruce Alberts, 2 da edicin 2006.

2. cido ribonucleico o ARN | La gua de


Biologa http://biologia.laguia2000.com/bioquimica/acido-ribonucleico-oarn#ixzz3InEUoqRt
3. http://www.maph49.galeon.com/evol/riborna.html
4. http://physiology.med.cornell.edu/faculty/mason/lab/zumbo/files/PHENOLCHLOROFORM.pdf
5. The single-step method of RNA isolation by acid guanidiniumthiocyanate
phenolchloroform
extraction:
twenty-something
years
onPiotr
Chomczynski&NicolettaSacchi. Published online 27 June 2006
6. http://www.redalyc.org/pdf/612/61218106.pdf
7. http://www.scielo.org.co/pdf/biote/v15n1/v15n1a8.pdf
8. http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biolmol/pdfs/17%20ELECTROFORESIS%20ACS%20NUCLEICOS%20GELES
%20AGAROSA.pdf
9. http://www.ivic.gob.ve/ecologia/ueg/formatos/Electroforesis%20de%20ADN
%20en%20geles%20de%20agarosa.pdf
10. http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/37%20PURIFICACI
%C3%93N%20ACS%20NUCLEICOS.pdf.
11. http://dieumsnh.qfb.umich.mx/bioqui2/cap2b.htm
12. http://www.thermoscientificbio.com/nucleic-acid-electrophoresis/generuler-1kb-dna-ladder-250-to-10000-bp/
13. Genomas. Brown 3ra edicin 2007.Editorial Mdica Panamericana.