Análisis y discusión de resultados

Preparación del gel de agarosa al 8%

Figura 1. Disolución de la agarosa luego de introducirla al microondas

Inicialmente se tenía una agarosa al 0,8%, sin embargo, para saber cuántos gramos hay en este
porcentaje se realizó el siguiente procedimiento:
0,8% --- 0,8 gramos
0,8 g --- 100 ml
X --- 150 ml
1,2 gramos de agarosa
Luego de saber que en 0,8% hay 1,2 gramos de agarosa, se procedió a pesar la agarosa para así
obtener la cantidad requerida e introducirla en un frasco reactivo. Posteriormente se añadió 150ml
de buffer TAE y se agitó para que se mezclara con la agarosa. Finalmente, la mezcla se introdujo a
un microondas durante un minuto, luego durante 30 segundos para así eliminar las partículas de
agarosa suspendidas y obtener una mezcla totalmente transparente, es importante tener en cuenta el
tiempo que se deja en el microondas, porque si este es muy largo se puede evaporar la mezcla.
Formación del gel de agarosa

Figura 2. Verter la agarosa en la bandeja

Se dejó que el gel anteriormente preparado se enfriara a una temperatura de (50°C-60°C), luego de
que este estuviera frío se le añadió 15 μl de SYBR safe y se agito hasta homogenizar y diluir el
color naranja que este contiene. Posteriormente se vertió la agarosa en la bandeja maso menos 0,5
cm evitando que se formaran burbujas e inmediatamente se colocó el peine. Finalmente se dejó
durante 30 minutos para solidificar el gel y poder retirar el peine el cual formó los pozos.

Preparación de la Cámara de electroforesis

Figura 3. Cámara de electroforesis con el gel de agarosa y el buffer TAE

Luego de obtener la solidificación del gel, se retiró el peine y se procedió llevar la bandeja a la
cámara de electroforesis, donde se le añadió una cantidad adecuada de Buffer TAE sin exceder la
cantidad ya que esta podría decrecer la movilidad del ADN y promover la distorsión de bandas.
Además de causar un excesivo calentamiento del sistema.
La cámara de electroforesis es un dispositivo que permite la generación de un campo eléctrico
alrededor de un gel donde se depositan las muestras. Este campo se genera dentro de una solución
amortiguadora en la que se encuentra sumergido el gel que contiene las muestras; el alto contenido
de electrolitos permite la transmisión de la corriente eléctrica, manteniendo el pH estable al paso de
la corriente. La cámara cuenta con dos polos (negativo y positivo) que se conectan a una fuente de
energía.

Preparación de las muestras a analizar

Figura 4. Preparación de las muestras a analizar con 3 μl de buffer de carga y 12 μl de muestra

En el papel parafilm se adicionaron 6 muestras distintas, las cuales fueron: ADN Bacteriano
anteriormente purificado (E. Coli y Salmonella), ADN Genómico anteriormente purificado (sangre
A y sangre B) y dos muestras de ADN proporcionadas por la docente. Cada gota contenía 3 μl de
buffer de carga de 6x y 12 μl de muestra, para completar 15 μl los cuales fueron mezclados con
ayuda de la micropipeta.
 Figura 5. Migración del ADN en una electroforesis
Después de haber introducido todas las muestras y los marcadores de peso molecular, se procedió a
prender el equipo y adecuar la fuente de poder en 100V durante 30 minutos. Cuando una mezcla de
moléculas ionizadas y con una carga eléctrica neta son colocadas en un campo eléctrico, éstas
experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que posea carga opuesta, como se puede
observar en la imagen, las moléculas cargadas negativamente se desplazaron hacia el ánodo (el polo
positivo).

El tamaño de los poros de la matriz del gel depende de la concentración de agarosa utilizada y dicha
concentración es inversamente proporcional al tamaño del poro obtenido; esto es, a mayor
concentración, menor tamaño de los poros, y viceversa, si los poros son pequeños la migración del
ácido nucleico es más lenta. Por tal motivo, la concentración de agarosa más utilizada para
electroforesis de ácidos nucleicos es de 0.5 a 2%.

Figura 6. Las cámaras en el transiluminador

Transcurrido los 30 minutos se llevaron las cámaras al transiluminador para ver las bandas
correspondientes a las muestras de DNA aplicado y los marcadores de peso molecular.
El transiluminador transmite luz del espectro ultravioleta a través de la muestra, excitando la
molécula cromogénica que emite energía fluorescente que permite visualizarla. El transiluminador
es el sistema empleado con más frecuencia por ser simple y efectivo. En general emiten energía a
una longitud de onda a 302 nm, aunque también existen para 254 y 365 nm; y suelen contar con un
botón para baja/alta intensidades por si se requiere una menor exposición de la muestra a la luz
ultravioleta. 
Registro del resultado de la electroforesis.

• Fecha: 14 de marzo del 2023

• Título: Electroforesis con muestras purificadas de ADN genómico y bacteriano.

• Descripción de las muestras: Las muestras contenían lo siguiente:

 Buffer de carga: Los tampones de carga de ADN se utilizan para cargar las muestras de
ADN en geles de ADN de agarosa o SDS para la electroforesis en gel. Los tampones de
carga de ADN contienen un colorante y un agente de densidad. El agente de densidad sirve
para aumentar la densidad de la muestra de ADN permitiendo que el ADN se hunda en el
fondo del pozo. El colorante añade visibilidad a la muestra de ADN y también sirve como
colorante de seguimiento que permite al usuario controlar la migración del ADN durante la
electroforesis. Los tipos de colorantes del buffer son: Tris, azul de bromofenol, azul de
xileno y glicerol. 
 ADN muestra A: Contiene el ADN de una muestra proporciona por el laboratorio la cual
fue purificada de cualquier proteína, carbohidratos, lípidos o de otros ácidos nucleicos.
 ADN muestra B: Contiene el ADN de una muestra proporciona por el laboratorio la cual
fue purificada de cualquier proteína, carbohidratos, lípidos o de otros ácidos nucleicos.
 ADN de la bacteria E.coli: Contiene el ADN de la bacteria E.coli la cual fue purificada
utilizando un kit comercial llamado Monarch Genomic DNA purification kit.
 ADN de la bacteria Salmondella: Contiene el ADN de la bacteria Salmonella la cual fue
purificada utilizando un kit comercial llamado Monarch Genomic DNA purification kit.
 Muestras proporcionadas por la profesora: Contiene ADN.

Luego de preparar las muestras con el buffer de carga, se procedió a introducirlas en los pozos que
estaban ubicados de manera que las muestras quedaran en el polo negativo ya que el ADN tiene
carga negativa y migraran hacia el polo positivo (rojo). En el primer pozo se añadió 5 μl de Ladder
de 100 bp DNA, en el segundo pozo se añadió E.coli, en el tercer pozo se añadió Salmonella, en el
cuarto pozo se añadió Sangre A, en el quinto pozo se añadió Sangre B, en el sexto pozo se añadió la
muestra 40-2, en el octavo pozo se añadió la muestra 43 y en el último pozo se añadió 5 μl de
Ladder de 1Kb plus DNA.

• Condiciones de electroforesis:

 Agarosa al 0,8%: Para su uso en electroforesis tiene la propiedad de disolverse en caliente

(50-60°C) y solidificar cuando se enfría, formando un gel de alta porosidad. 

 Sybr safe: Sirve para reducir la mutagenicidad y ser más segura que el bromuro de etidio
para teñir ADN en geles de agarosa o acrilamida.

 Buffer TAE: Es el medio usado para preparar el gel y desarrollar la electroforesis. Recibe
este nombre de las iniciales de sus componentes (Tris 40 mM, ác. acético 19 mM, EDTA 1
mM). Su Ph es alcalino (7,5), para que todos los grupos fosfato del DNA estén ionizados
 por completo y éste se mantenga cargado negativamente. En la electroforesis, permite
mantener las moléculas de DNA con una carga negativa uniforme y constante.
 Marcador de peso molecular de 100bp: Diseñado para determinación sencilla de tamaño
de fragmentos de ADN, con un formato rápido que ahorra tiempo debido a que
simplemente se toma una porción del mismo y se deposita en los pozos del gel de agarosa.

 Marcador de peso molecular de 1kb: Marcador de peso molecular listo para usar con
bandas de mayor intensidad para una fácil orientación, utilizado para la determinación del
tamaño de ácidos nucleico.
 Voltaje de 100: El voltaje determina la velocidad y calidad del corrido y separación de
ácidos nucleicos. Voltajes muy altos producen un arrastre de las bandas, y cuando son muy
bajos se reduce el corrido y puede presentarse bandas anchas y difusas. Por eso es
recomendable hacerlo entre 25-100 v para una mayor velocidad de corrimiento.
 Tiempo de corrido: El tiempo fue 30 minutos para que en la figura 5 la cámara de la
derecha se lograra observar el Xileno-cianol y el azul de bromofenol.
• Resultados: Al finalizar la migración del ADN en la matriz de gel de agarosa como se
muestra en la figura 5, se obtuvo el Xileno- cianol el cual es un compuesto coloreado y con carga,
utilizados para comprobar el progreso de la electroforesis. En la electroforesis el xileno-cianol se
mueve aproximadamente como las moléculas de DNA de 3500 a 5000 pb (depende del tampón y el
% de agarosa en el gel).
Ambos tienen un color azul turquesa que permite detener la electroforesis con la confianza de
que las moléculas grandes de DNA no se hayan salido del gel.

Además, se obtuvo el azul de bromofenol que, en la electroforesis, por su menor tamaño, se mueve
más rápido que las proteínas o que la mayoría de moléculas de DNA (aquéllas superiores a 300 pb),
es decir, marca el "frente de avance". Puesto que su color azul-violeta es bien visible, permite
detener la electroforesis con la confianza de que las moléculas de proteína o DNA no se hayan
salido del gel.

El ladder de 100bp va de 100 hasta 1,517 pares de bases y el ladder de 1 kb va de 0.1 hasta 10
kilobases, según la marca BioLabinc

A través del transiluminador se pudo comparar las muestras con los marcadores de peso molecular.
Se obtuvo que en la cámara de la izquierda de la figura 6, la muestra de sangre A tiene 1.200 pares
de bases y un tamaño de 4.0 kilobases. La muestra de sangre B no se pudo observar. La muestra de
Salmonella tiene 1.000 pares de bases y un tamaño de 3.0 Kilobases. La muestra de E.coli tiene 900
pares de bases y un tamaño de 3.0 kilobases. Las dos muestras restantes no se logran observar.

En la figura 6 la cámara que está a la derecha no se logra observar detalladamente los pares de bases
ni los kilobases que esta contiene, debido a que las muestras no fueron totalmente purificadas, este
es uno de los factores que no nos permitieron analizar lo que contenía la cámara.

REFERENCIAS

Biomodel.(2018). Reactivos empleados en la electroforesis de DNA y de proteínas. biomodel.uah.es

Alejandro López.(2013). Electroforesis. accessmedicina.mhmedical.com