INSTITUTO TECNOLÓGICO DE ORIZABA ANALISIS INSTRUMENTAL

“CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS”
(En papel y en capa fina)

METODOLOGÍA No. 9 FECHA DE REALIZACIÓN

OBJETIVO

Conocer las técnicas cromatográficas en papel y en capa fina.

INTRODUCCIÓN

La cromatografía es una técnica de separación basada en la diferente

velocidad con que se mueven los solutos a través de un medio estacionario
mediante el flujo de un disolvente llamado eluente.

GENERALIDADES

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUDOS

La cromatografía de líquidos se puede realizar empleando como fase

estacionaria papel filtro, o un sólido finamente dividido colocado en forma
de capa fina sobre un vidrio, o bien en una columna rellena de un sólido
poroso pulverizado, el cual puede actuar como fase estacionaria líquida.
Estos tres sistemas se conocen respectivamente como cromatografía en
papel, en capa fina y en columna.

Dos conceptos muy importantes para el análisis de una sustancia son el Rf

(referencia - frontal) y el R x (relación con un estándar x). El comportamiento
migratorio de una sustancia se describe en función de la relación de frente,
es decir, el cociente de la distancia recorrida por el soluto y la distancia
recorrida por el eluente.

Rf= _Distancia recorrida por la sustancia_

Distancia recorrida por el eluente

APOYO DEL PROFESOR DURANTE LA PARTE EXPERIMENTAL

1.- Explicación general del desarrollo de la práctica

2.- Indicar y corregir que se lleve a cabo el manejo adecuado de los instrumentos
cromatográficos
3.- Resolver dudas generales durante la práctica
4.- Proporcionar bibliografía para
consultar datos teóricos sobre: a)
Cuestionario
5.- Revisión final y calificación de la práctica
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CROMATOGRAFIA EN PAPEL

REACTIVOS MATERIAL

Mezcla de colorantes. Papel para cromatografía Whatman

del 1
Solvente alcohol etílico / agua 50% Cámara para desarrollo
cromatografico
Vidrio cuadrado para cubrir el
vaso
Vaso de precipitados de l000 ml
Plumones de diferentes
colores

PROCEDIMIENTO

La separación se lleva sobre rectángulos o tiras de papel filtro, dependiendo de las

medidas de las cámaras donde se va a realizar la cromatografía, el papel esta formado
por un conjunto de fibras de celulosa parcialmente orientadas, distinguiéndose zonas
amorfas y cristalinas. El agua y los compuestos hidrófilos se absorben en zonas amorfas.
Las muestras siempre se aplican en solución. La elección del disolvente depende de las
sustancias a separar.

Para aplicar las muestras se traza primero con un lápiz una línea a l.5 cm. del borde
inferior y superior del papel, y se consideraran como líneas de referencia, la primera
para aplicar la muestra, y la segunda hasta donde correrá el solvente. Existen dos
procedimientos de desarrollo del cromatograma: ascendente y descendente.

DESARROLLO ASCENDENTE
El eluente se coloca en el fondo de la cámara y el papel puede ser suspendido de la
parte superior con un alambre, varilla de vidrio o hilo, o bien se coloca sobre el eluente
formando un cilindro que se sujeta por medio de pinzas. La superficie del disolvente
deberá estar por debajo de la línea de aplicación de la muestra.

DESARROLLO DESCENDENTE
El papel se fija mediante varillas de vidrio o alambre dentro de la cámara, o cubeta la
cual contiene el eluente.

La cubeta estará colocada en la parte superior de la cámara y el papel se

suspende hacia abajo quedando la línea de aplicación de la muestra en la parte superior.
Para asegurarse que la atmósfera del interior de la cámara este saturada de vapor del
eluente, se cierra herméticamente.

Si las sustancias que se están separando son incoloras deberán utilizarse sustancias
reveladoras. Una vez desarrollado el cromatograma se marca el frente del eluente y se
deja secar. Si los compuestos son incoloros se procede a revelarlos por métodos físicos
o químicos.
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Los métodos físicos son:

a) Absorción Ultravioleta.
b) Radioactividad.

Los métodos químicos son aquellos que emplean sustancias químicas llamadas agentes
de revelado, que pueden ser: gases, líquidos o sólidos en solución.

CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA

El desarrollo es más rápido que en el papel debido a que el tamaño de la

partícula es superior; esto da lugar a una mayor resolución y manchas más compactas.
Para la fase estacionaria se emplea generalmente gel de sílice alumina y celulosa.

Para realizar una cromatografía en capa compacta se limpia la placa (que puede ser de
vidrio o aluminio) con una solución concentrada de carbonato de sodio y se lava con
agua antes de usarla. Para aplicar la fase estacionaria elegida existe un aplicador
mecánico que permite un espesor uniforme de la capa, o manualmente se puede hacer
utilizando una varilla para extender la fase estacionaria suspendida en algún disolvente
que después se elimina por evaporación.

Normalmente, las suspensiones se hacen con agua en ocasiones acidulada trata

con alguna base o solución amortiguadora. Se obtienen mejores resultados si está se
prepara en un homogenizador. El espesor de la placa por lo general es de 0.25 mm.
Para cromatografía de adsorción la placa ya preparada se activa por
calentamiento entre
100º y 150º C. Y para la de reparto se deja a la intemperie para que la humedad del
aire la desactive.

La selección de la fase móvil

depende de la fase estacionaria
y de los solutos. Si un eluente
puro no separa bien la muestra
se emplean mezclas.

En general
para separar
sustancias
polares se usa
celulosa o gel
de sílice. Las
sustancias no
polares suelen
separarse en
gel de sílice o
en alumina
activada.

La aplicación de la muestra en capa fina se lleva a cabo por la técnica descrita en la

cromatografía en papel.
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El desarrollo de la placa suele ser ascendente. Se realiza en cámaras recubiertas con

papel filtro impregnado en el eluente para saturar la atmósfera.
El revelado de la placa se efectúa por la técnica de atomización, soportando agentes
corrosivos. Para efectuar una determinación cuantitativa, las manchas se separan con
cuidado de la placa y se elige el método adecuado para su cuantificación.

OBSERVACIONES

A lo largo de ambas practicas notamos distintas situaciones así como errores analíticos
que cometimos, en el caso de la práctica de cromatografía por papel tuvimos el error de
primero hacer el problema y después los colores unitarios, esto ocasionó que al marcar
el color unitario ya fuera contaminado, por lo cual decidimos comenzar la practica con
otros colores, en el momento de colocar nuestro papel en el vaso de precipitados y
agregamos el eluente comenzamos a notar como rápidamente el papel fue absorbiendo
el eluente y comenzaron a subir los colores, ya que en esta práctica se observa de forma
ascendente, conforme pasaba el tiempo íbamos notando como poco a poco los colores
se iban separando, esto nos quería decir que ya estaban contaminados y que
anteriormente ya habían sido utilizados, un ejemplo fue en color azul, esperábamos ver
distintas tonalidades posiblemente pero de color azul, y nos percatamos de que también
salieron colores como el verde y amarillo incluso morado, así sucedió con todos los
colores y el problema.
En el caso de la práctica de capa fina notamos un detalle, la capa fina de sílice que tiene,
en verdad es muy delgada porque con un ligero rasguño se le caía un poco de ella,
aplicamos la misma metodología que en la de papel, solo que en esta forma fue más
rápido porque nos evitamos el cortar el papel, estar midiendo etc., y sentimos que de
esta manera es un poco mas precisa porque tiene un equipo más sofisticado.

CONCLUSIÓNES
Como conclusión podríamos poner que en ambas maneras y métodos llegamos al
resultado esperado y fue de fácil manejo, al igual que en ambas pudimos observar el
comportamiento de cada color, también notamos los diferentes tipos de tiempo que nos
llevó realizar cada práctica, así como los costos de cada una de ella, en resumen,
podemos decir que ambos métodos son buenos y que tienen sus principales diferencias
en cuestión de costos y tiempo.

CUESTIONARIO

1.- Definir el concepto de cromatografía por exclusión

La cromatografía de exclusión por tamaño o de gel es un tipo de cromatografía de
líquidos en la que la fase estacionaria es un material poroso que permite la elución
diferencial de los solutos en función de sus tamaños moleculares.
A diferencia de otros métodos cromatográficos, en la cromatografía de exclusión por
tamaño no hay interacción química o física entre los analitos y la fase estacionaria.

2.- Desarrolle el siguiente ejemplo: Escoger la fase móvil, la columna y la fase

estacionaria para una cromatografía de alta presión.

Un ejemplo puede ser el siguiente: en un envase de cristal de alta resistencia colocar

aceite como fase estacionaria y agua con jabón como fase móvil, por las distintas
densidades el aceite lograra separar el agua de el jabón.
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3.- ¿A que llamamos cromatografía preparativa?

La cromatografía preparativa se refiere a la separación de los componentes de una

mezcla para su posterior procesamiento, y se puede considerar un método de
purificación.

4.- ¿Que sustancias químicas se emplean como sustancias reveladoras en este

tipo de cromatografías?

Para crear la fase estacionaria son utilizados el gel de sílice (SiO2) y alúmina (Al2O3), y
las sustancias que atraviesan esta fase pasan por presión, por gravedad o por capilaridad

TRATAMIENTO DE RESIDUOS
Los residuos producto de las reacciones serán investigados por el alumno.

Los residuos de laboratorio deben recogerse para su eliminación en envases separados

en función del tipo de sustancia química implicada. Los recipientes pueden etiquetarse,
por ejemplo, de acuerdo con la lista descrita a continuación y con las letras A a K. Al
hacerlo, hay que asegurarse de que los compuestos químicos recogidos en cualquiera
de las categorías no puedan reaccionar entre sí. Debe hacerse por lo menos una
comprobación del contenido de ácido y de base. Muchas empresas de gestión de residuos
requieren que se proporcione una disolución neutra.

BIBLIOGRAFÍA
Esta tendrá los siguientes requisitos: Nombre del libro, nombre del autor por
orden alfabético, edición, páginas consultadas.

Ejercicios de análisis cuantitativo para Cromatografía

AUTORAS: A. Peña, E. Cervera y C. Labastida
ISBN 978-607-02-9774-8
PRIMERA EDICIÓN 2017
https://www.merckmillipore.com/MX/es/support/safety/chemical-waste/collection-of-
lab-
waste/rxub.qB.5hcAAAFCdtsXr75c,nav?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.co
m.mx%2F
Vo. Bo. del Maestro
Calificación

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EVIDENCIA FOTOGRAFICA
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CALCULOS CAPA FINA

Rf= _Distancia recorrida por la sustancia_

Distancia recorrida por el eluente

16.8
𝑅𝑓 = = 1.10
15.2

16.7
𝑅𝑓 = = 1.06
15.7

16.5
𝑅𝑓 = = 0.99
16.6

CALCULOS PAPEL

11.5
𝑅𝑓 = = 0.98
11.7

11.9
𝑅𝑓 = = 1.07
11.1

8.1
𝑅𝑓 = = 1.01
8
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“METODOS CROMATOGRAFICOS EN COLUMNA”

(Cromatografía en columna por elución)

METODOLOGÍA No. 10 FECHA DE REALIZACIÓN

OBJETIVO

Aplicar la cromatografía en columna para la separación: de componentes de los

pigmentos naturales (clorofilas, xantofilas y carotenos) por el método de elución.

FUNDAMENTO

En la muestra se presentan dos o más componentes que se separan en una

columna cromatográfica por elución. La elución implica el transporte de una
especie o más especies a través de una columna por la adición continua de una
nueva fase movil, propiciándose así una separación por elusión.

GENERALIDADES

Una porción de la muestra, contenida en la fase móvil, se introduce en la parte

superior de la columna y a continuación los componentes de la misma se distribuyen
entre las dos fases.

La introducción de fase móvil adicional (el eluyente ) hace que la fase

móvil que contiene parte de la muestra se mueva hacia abajo de la columna,
donde tiene lugar un posterior reparto entre la fase móvil y las porciones
nuevas de fase estacionaria, comprende el lavado de un soluto a través de una
columna por la adición de más disolvente fresco. Una sola porción de la muestra
disuelta en la fase móvil es introducida por la parte superior de la columna (en
el tiempo tº) en donde los componentes A y B se distribuyen por si mismos
entre las dos fases en base a su coeficiente de absorción. La introducción de
una fase móvil (eluyente) forza a la porción disuelta de la muestra hacia abajo
en la columna donde ocurre después una partición (reparto) entre la fase móvil
y la fase estacionaria.

Adiciones posteriores del disolvente acarrean las moléculas de soluto hacia

abajo en la columna en una serie continua de transferencia entre las dos fases.
Como el movimiento del soluto puede ocurrir solo en la fase móvil, la velocidad
promedio de migración depende de la fracción de tiempo en que ésta ocurre

APOYO DEL PROFESOR DURANTE LA PARTE EXPERIMENTAL

1.- Explicación general del desarrollo de la práctica

2.- Indicar y corregir que se lleve a cabo el manejo adecuado de los instrumentos
cromatográficos
3.- Resolver dudas generales durante la práctica
4.- Proporcionar bibliografía para consultar
datos teóricos sobre: a) Cuestionario
5.- Revisión final y calificación de la práctica
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REACTIVOS MATERIAL
Solventes : 1 Columna cromatográfica de 2.5 x 50 cm.
Sol saturada de Cloruro de Sodio 1 Agitador largo.
Metanol reactivo analítico 1 Vaso de precipitados de 500 ml
Hojas verdes ( espinaca, o lengua de vaca )
Mezcla de n - propanol al 5 % en 1 Vaso de precipitados de 250 ml.
éter de petróleo.
Azúcar. ( C12H22O11 ) 1 Matraz yodométrico de 250 ml
Alúmina. ( Al2O3 ). 1 Soporte metálico.
Carbonato de Calcio ( CaCO3 ) 1 Pinzas para bureta.
1 Probeta de 100 ml.
1 Pipeta Volumétrica de 20 ml.
1 Embudo de separación.
1 Matraz kitazato con manguera.
1 tapón.
Papel Filtro, algodón

PROCEDIMIENTO

1.- Preparar el extracto de vegetales como se indica más adelante. Esto se realiza 24
hr antes de la práctica.
2.- Preparar la columna rellenándola con la fase estacionaria adecuada.
3.- Trasvasar el extracto de vegetales a un embudo de separación, previamente
lubricada la llave, y adicionar por las paredes del embudo y con cuidado 50 ml de éter
de petróleo, mezclar el contenido del embudo invirtiéndolo y con un movimiento circular
(abrir la llave del embudo frecuentemente para evitar la presión).
4.- Agregar 50 ml de solución saturada de cloruro de sodio; se formaran dos capas, la
inferior que es agua-metanol y la superior que será el extracto etéreo que contiene los
pigmentos, repetir la operación por lo menos tres veces.
5.- Dejar reposar la mezcla de los pigmentos con el éter por espacio de 10 minutos y
separar los sedimentos si los hubiera. El extracto estará listo para ser utilizado.
6.- Agregar el extracto a la columna con cuidado.
7.- Agregar eluente suficiente para realizar la separación de los componentes de la
muestra. Como eluente se utilizará una mezcla de ( n-propanol 5% en éter de petróleo
). El frente del eluente no debe rebasar la fracción de la columna empacada con azúcar.
8.- Esperar a que se separen los componentes de la muestra. Se observarán unas
bandas de colores.

En el caso de que se quiera cuantificar cada componente, se debe agregar

suficiente eluente para que fluyan todas las bandas de colores y cada una se recoge en
un vaso de precipitados para posteriormente cuantificarlas utilizando la técnica
apropiada.

PREPARACION DE LA COLUMNA

Para empacar la columna es necesario revisarla que esté en condiciones, se le coloca

en la parte inferior un pedazo de algodón que sirva de soporte al soluto; se colocan de
5 a 7 cm. de alúmina en la columna golpeando en las paredes suavemente para lograr
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que el empaque sea uniforme y evitar canales o burbujas; posteriormente colocar otro
disco de papel filtro, para separar las fases, agregar una porción semejante de
carbonato de calcio, y colocar otro pequeño disco de papel filtro, y por último 10 cm de
azúcar, al final colocar un disco pequeño de papel filtro que ajuste perfectamente,
comprimiéndolo cuidadosamente.

Nota: Las sustancias que se utilizan para el empaque de la columna dependen del tipo
de cromatografía, y del tipo de muestra que se vaya a analizar.

Una vez preparada la columna se coloca en el soporte y se conecta al matraz kitazato

el extremo de la columna, se miden 20 ml de muestra y se colocan en la columna y se
espera que sean absorbidos por la columna, después de seguirá añadiendo el solvente
a utilizar hasta que la muestra sea repartida a lo largo de toda la columna (eluída).

Observar lo ocurrido y hacer los comentarios pertinentes en las observaciones.

PREPARACIÓN DEL EXTRACTO DE VEGETALES VERDES

Pesar aproximadamente 10 gramos de vegetales verdes frescos, cortarlos en

trozos pequeños y colocarlos en un matraz yodométrico y agregar 100 ml de metanol,
dejar reposar por espacio de 24 hrs.

OBSERVACIONES
Como primer punto pondría que es una practica bastante sencilla de realizar teniendo
todo en orden, es un poco tardada en el sentido de que la muestra que se va a utilizar
tiene que pasar por un proceso de la extracción de la clorofila y tal proceso es mínimo
de 24 horas, teniendo nuestra sustancia lista procedimos en empacar la columna la cual
fua bastante sencillo de realizar, como observación pondría que tenemos que compactar
bien las fases que lleve para que no exista aire dentro de la columna, posteriormente
conectamos nuestra columna a un matraz Kitasato el cual estaba conectado al vacío,
una vez teniendo eso listo podíamos comenzar a agregar la sustancia a valorar, en ese
procedimiento tuvimos una pequeña discrepancia, ya que a ningún equipo se separaba
en fases, consideramos que fue el orden al agregar los productos, ya que en la práctica
marcaba que inicialmente le pusiéramos el éter de petróleo y posteriormente realizar en
enjuague, y se realizo de manera inversa a excepción de nosotros, por eso se nos separo
la muestra y comenzamos a agregarla a la columna, antes de esto cuando agregamos
el éter de petróleo nos dimos cuenta de que expulsaba demasiado calor y que teníamos
que estar constantemente liberando presión para que no fuera a explotar nuestro
embudo de separación, inmediatamente se comenzó a notar la separación de las
sustancias, en el caso de la sustancia final nos daba un color muy parecido al jabón para
trastes axion, ya que la realizamos con espinaca y por ende nos iba a proporcionar un
color verde, cuando la agregamos se notaba mucho el color en la primera fase que era
de azúcar conforme iba llegando a la ultima iba desapareciendo el color y las tonalidades
se volvieron un poco amarillas, en este caso el efecto fue descendente, aplicamos un
poco de vacío y agregamos un poco de la mezcla de n-propanol con éter de petróleo
para lavar y así tener nuestro resultado.
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CONCLUSIÓNES
Como conclusión podemos poner que la pratica tiene demasiada eficiencia, solo
debemos tener cuidado al seguir los pasos para la realización de la misma, es un
proceso un poco lento pero al igual que la pratica de cromatografía en papel y capa
fina , son métodos muy buenos y que son visibles y fáciles de realizar. Cabe mencionar
que a pesar de inconveniente con el orden de las sustancias no tuvimos problema para
terminar su realización.

CUESTIONARIO

1.- ¿Qué método se emplea para identificar los componentes de una muestra
que se han separado en una columna?
Uno de los mejores métodos para conseguir esa separación, y posiblemente, el más utilizado
es la cromatografía. Este conjunto de técnicas permite la separación de componentes
estrechamente relacionados en mezclas complejas.

2.- ¿En que consiste el desarrollo por desplazamiento?

Se desea una separación amplia de los picos, preferiblemente hasta la línea de base,
para obtener la máxima purificación. La velocidad a la que cualquier componente de una
mezcla desciende por la columna en el modo de elución depende de muchos factores.

3.- ¿Cuales son las formas en las que se puede realizar la cromatografía
liquida?
Consiste en una fase estacionaria no polar (columna) y una fase móvil. La fase
estacionaria es silica. La fase móvil actúa de portador de la muestra. La muestra en
solución es inyectada en la fase móvil. Los componentes de la solución emigran de
acuerdo a las interacciones no-covalentes de los compuestos con la columna. Estas
interacciones químicas, determinan la separación de los contenidos en la muestra. La
utilización de los diferentes detectores dependerá de la naturaleza de los compuestos a
determinar.

4.- ¿Qué componentes contienen los pigmentos utilizados como muestra?

Las hojas están llenas de unos pigmentos de color verde llamados clorofilas. Estas
clorofilas son las que permiten a las hojas coger la energía del sol y crecer.
Funcionan como pequeñas placas fotovoltaicas que toman la energía del sol y la
transforman en alimento.

5.- ¿Cuántos métodos cromatográficos en columna se conocen?

la cromatografía en columna se puede clasificar como: Cromatografía sólido-líquido. La
fase estacionaria es sólida y la móvil es líquida. Cromatografía líquido-líquido.
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TRATAMIENTO DE RESIDUOS
Los residuos producto de las reacciones serán investigados por el alumno.
En el caso del eter de petróleo realizar lo siguiente: Lávese completamente con agua y
jabón después de manipular el producto. Aleje de la humedad, el aire y de fuentes de
calor e ignición. Los contenedores vacíos pueden contener residuos peligrosos,
manéjelos adecuadamente. Manipule el producto con ventilación localizada en el punto
de emisión de los vapores.
En el n-propanol: EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Enjuagar con agua
cuidadosamente durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto cuando estén
presentes y pueda hacerse con facilidad. Proseguir con el lavado P310 Llamar
inmediatamente a un CENTRO DE TOXICOLOGĺA/médico. En ambos casos depositar en
el contenedor de residuos inorgánicos.

BIBLIOGRAFÍA
Esta tendrá los siguientes requisitos: Nombre del libro, nombre del autor por orden
alfabético, edición, páginas consultadas.

Ejercicios de análisis cuantitativo para Cromatografía

AUTORAS: A. Peña, E. Cervera y C. Labastida
ISBN 978-607-02-9774-8
PRIMERA EDICIÓN 2017
https://www.carlroth.com/medias/SDB-9169-ES-
ES.pdf?context=Ejercicios%20de%20an%C3%A1lisis%20cuantitativo%20para%20Cro
matograf%C3%ADa%20AUTORAS:%20A.%20Pe%C3%B1a,%20E.%20Cervera%20y%
20C.%20Labastida%20ISBN%20978-607-02-9774-
8%20PRIMERA%20EDICI%C3%93N%202017
https://www.google.com.mx/search?q=tratamiento+de+residuos+del+eter+de+petr
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Vo. Bo. del Maestro

Calificación

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