Handbook Procesos Cromatograficos 2da Edicion Pag 257-End

10.
2 Basic 1
proceso de optimización (por ejemplo, la demanda de alta pureza aumenta más adelante
en el proceso). Además, la elución por pasos involucra pocos parámetros y generalmente
es más fácil de optimizar que una elución en gradiente.
10.2 BÁSICO RELACIONES
El propósito de la cromatografía de proceso es separar, es decir, resolver, un componente

objetivo de las impurezas. La resolución se logra retardando selectivamente el
componente objetivo o la impurezas a diferente extensiones tiempo acuerdo la dispersión
de sustancia disoluta bandas como pequeño como sea posible. Existen algunas relaciones
que son fundamentales para todos los tipos de cromatografía y a partir de las cuales se
pueden describir los parámetros básicos que regulan la retención y el ensanchamiento de
zona de los solutos y calcular la resolución. El proceso cromatográfico completo puede
describirse mediante el balance de materia del sistema.
10.2.1 Resolución
La resolución entre dos solutos se calcula a partir de la diferencia entre sus volúmenes de
retención, V R , en comparación con el promedio de los anchos de base, w b ,
2
( VR 2 VR 1 _ ) k2 k1
R (10.1)
N
s w b2 wb 1 2 (2 k 2 k 1 )
los mano derecha lado de la ecuación expresa la resolución en términos de la retencion

factor, k y el número de plato de la columna, N , y es válido para cromatografía isocrática
y por debajo la suposición que la fase móvil volúmenes y la lámina números por la dos
solutos son idéntico ( cf. _ ecuaciones (10.4) y (10.9)). Por ajuste k 2 k 1 2k _ la
ecuación se puede reorganizar a la expresión de uso frecuente
1 1 k 2
R (10.2)
N
s
4 1 k
que separa los efectos del factor de selectividad, , el factor de retención y la eficiencia de
la columna en elución isocrática.
Un factor de resolución de 1,5 produce, en la práctica, una separación completa de dos
solutos que tienen formas de pico gaussianas , cf. Figura 4.3 (el efecto de los diferentes
factores de resolución en el rendimiento y la pureza puede simularse mediante la rutina de
software adjunta; consulte Simulación de separaciones a continuación).
los grafico en Figura 10.1 ilustra que la la mayoría importante único parámetro
conmovedor la resolucion por lejos es la selectividad factor. Para instancia, la ganar en
resolución por aumentando el lámina número 20 veces (p.ej por creciente la columna
longitud 20 veces) mayo ser logrado aumentando el factor de selectividad de 1,01 a 1,05
(como se calcula fácilmente a partir de la ecuación (10.2)).
2 10. Optimization of Chromatographic Separations
5
k'=20
4
k'=10
3
Resolution
k'=5
2
k'=2
1
0 k'=1
1 1,1 1,2 1,3 1,4
1,5
Selectividad factor
Figura 10.1 Resolución factor como a función de la selectividad factor por diferente valores de la
factor de retención, k 2 . Calculado a partir de la ec. (10.2) para N 10.000.
10.2.2 Retencion
los retencion factor, k (la retencion factor es algunas veces denotado como k [1]), es dado
por la cantidad (o más bien, el número de moles) de soluto en la fase estacionaria, W S ,
en comparación con la de la fase móvil, W M ,
WS
k
WM (10.3)
La migración relativa de un soluto será igual a la cantidad relativa encontrada en la

fase móvil, y el volumen de retención del soluto, V R , estará relacionado con el factor de
retención por [2]
VR _ VM _ k  VM _ (10.4)
donde VM _ es el volumen de la fase móvil. El factor de retención está relacionado con el

coeficiente de distribución, K D , expresando la concentración de sustancia disoluta en la
estacionario fase, CS , _ sobre que en la fase móvil, C M , por
VS _
k k (10.5)
METRO
D
V
dónde VS _ es la volumen de la estacionario fase. Eso es importante a Nota que la

retencion factor es proporcional a la fase relación, V S / V M , de la cromatográfico resina
(p.ej fase las proporciones pueden variar con el área superficial específica de los
materiales). También se ve a partir de la ec. (10.5) que la retención factor (y la retencion
volumen) es constante solamente cuando la distribución coeficiente es constante. Este es
no la caso por cromatografía en no lineal modo, cual es común en preparativo
separaciones (ver abajo). De este modo, variar la muestra concentración mayo resultar en
variaciones, o incluso turnos, en retencion volúmenes de solutos adeudado a influencias de
la isoterma
10.2 Basic 3
en el coeficiente de distribución. En la elución en gradiente, el coeficiente de distribución

cambia gradualmente adeudado a la influencia de la fase móvil composición en
disociación constante ( cf. eq. (10.29)) y, por lo tanto, el factor de retención no es
constante.
La definición de volumen de fase móvil y volumen de fase estacionaria necesita alguna
consideración. El volumen de la fase móvil es igual al volumen de elución del soluto en
condiciones no retentivas. Por lo tanto, mientras que el volumen de líquido total (es decir,
el volumen extrapartículas e intrapartículas) de la columna puede ser igual al volumen de
la fase móvil de los solutos pequeños este es seguramente no verdadero por largo solutos,
cual son excluido de a fracción de el volumen intrapartícula. En la mayoría de los casos
no es posible asignar un volumen de fase estacionaria a la resina cromatográfica (excepto
en la exclusión por tamaño donde la fase estancada corresponde a la fase estacionaria).
En algunos casos puede ser más apropiado discutir en términos de superficie [3].
El factor de selectividad, , para dos solutos se ve afectado por el material de
cromatografía en el experimental condiciones elegido (es decir fase móvil composición,
la temperatura, etc.) y se expresa por la retención relativa de los solutos como
k 2
k 1 (10.6)
mientras k puede variar debido a las diferencias en la relación de fase de diferentes

materiales, la separación factor es no afectado como largo como la diferencia en fase
relación afecta la moléculas en una manera similar.
10.2.3 Zona ampliando
El ancho del pico se ve afectado principalmente por el ensanchamiento de la zona en la

columna y la varianza de la zona, 2 , es proporcional a la distancia recorrida por la zona,
z. El ensanchamiento de la zona por unidad de longitud se denomina altura de la placa [2]
y se denota como H (o HETP, altura equivalente a una placa teórica)
2
H z (10.7)
Conversión de longitud a volumen y ajuste z L , donde L es la longitud de la

columna, produce la relación familiar, válida para elución isocrática
L
H
( VR _ ) 2 (10.8)
los número de platos por columna, N , es dada por L / H y de este modo
V 2
norte R (10.9)
 
Una descripción de las variables que influyen en la altura del plato de la columna en la
elución isocrática viene dada por la ecuación de van Deemter [4].
BV
(( 2  0.6 D M D
V ) 1) (d V2 0 VR _ )(1 ( V 0 VR _ ))
H A cobre 2   SR _ 0  pags
tu tu
30 D
dp _ tu
S
(10.10)
dónde es un factor geométrico de orden unidad, d p el tamaño de partícula, D M y D S ,

respectivamente, la difusión coeficiente de la sustancia disoluta en la móvil fase y
intrapartícula fase, y tu la fase móvil intersticial velocidad. A es relacionado a remolino
dispersión, B a molecular difusión y C a la resistencia a la transferencia de masa. Para
resinas de tamaño de partícula pequeño o solutos de alta difusividad, el efecto de la
dispersión de remolinos se reduce por difusión molecular, lo que conduce a una extensión
de la Un término a incorporar este acoplamiento [5]. Sin embargo, este efecto mayo ser
descuidado en preparativo purificaciones de biomacromoléculas. ecuación (10.10) mayo
ser escrito utilizando los llamados parámetros reducidos, es decir, la altura reducida de la
placa, h , dada por
H
h
dp _ (10.11)
y la reducido velocidad, , dado por
tu p (10.12)
v DM
_
donación la siguiendo simplificado ecuación
20.6 S ((VR V0 ) 1) (V0 VR )(1 (V0 VR )) 1.5

h 2 v v 1 0.04v v
30 S
(10.13)
dónde S es a factor a cuenta por la restringido difusión en la intrapartícula espacio

( S D S / D M y es típicamente 0.05–0.2 para macromoléculas) [6]. El lado derecho de
la ecuación proviene de la suposición que la pariente movilidad de la muestra zona, V
0 / V R 0.5 y S 0.2. ecuación (10.13) puede usarse para una descripción cualitativa
general de la diferente contribuciones a columna zona ampliando como ilustrado en
Figura 10.2. Se muestra que el término B tiene influencia solo a velocidades de flujo muy
bajas y para solutos de difusión rápida, y que el término dominante a velocidades de flujo
altas y para solutos de difusión lenta es la C-término. los restringido difusión voluntad
tener a largo impacto en la Pendiente del Término C! Eso mayo ser observó que una
en alguno casos mayo ser dependiente al la tasa de flujo (es decir principal a
acoplamiento como mencionado arriba) y además que convectivo el transporte puede
reducir el término C a tasas de flujo muy altas. Sin embargo, la ec. (10.10) se ha utilizado
10.2 Basic 5
con éxito en cualitativo predicciones en escala preparativa isocrático Talla
exclusión
3
Reduced plate
CV
A
1
B/ v
0
0 10 20 30 40 50
Reducido velocidad
Figura 10.2 Ampliación de zona en cromatografía líquida expresada por el diagrama de van
Deemter reducido. Los términos A, B y C descritos por la ec. (10.13).
cromatografía (SEC), cromatografía de intercambio iónico (IEC) y cromatografía de fase

inversa (RPC) [3, 7, 8].
Otro ecuación que posee estado fundar útil por calculador la lámina altura es la
empírico knox ecuación dónde la acoplamiento Entre remolino dispersión y longitudinal
la difusión se cuida en el término A de acuerdo con
B _
h Av13 C
(10.14)
v _
v
Bristow [9] señalado que A 1, B 2 y C 0.05 por bien empacado líquido de alto
rendimiento cromatografía (HPLC) columnas Este es en bueno convenio con la
camioneta Ecuación de Deemter (es decir, el lado derecho de la ecuación (10.13)). Debe
enfatizarse que las ecs. (10.10), (10.13) y (10.14) solo son válidas para elución isocrática;
en la elución en gradiente, el ancho del pico será generalmente más pequeño debido al
efecto de autoafilado.
los total lámina altura de la sistema voluntad ser la suma de diferente contribuciones,
p.ej de grande muestra volúmenes, mezclando cámaras y otro muerto volúmenes y
columna zona ensanchamiento (incluido el fenómeno del transporte, véase más adelante).
El efecto variará dependiendo de la cromatografía. modo empleado. Zona ampliando en
isocrático elución es muy sensible a la calidad del empaque de la columna, algo que se
utiliza en el control de la columna empaquetada (ver Capítulo 12). De la figura 10.2 se ve
que la velocidad reducida debe mantenerse constante (por ejemplo, al cambiar el soluto o
variar la temperatura) si se obtienen resultados comparables. a ser recibió (es decir ningún
sustancia disoluta mayo ser usó por prueba de columna embalaje como largo como eso no
es obrar recíprocamente con la cromatografía matriz y previsto la reducido velocidad es
constante,
p.ej a a valor de 5).
10.2 Basic 7
10.2.4 Masa transferir
El transporte de soluto a través de la columna depende de la concentración local de soluto

en las fases móvil y estacionaria, C M y C S , respectivamente, la velocidad intersticial de
la fase móvil, u , la dispersión de la zona y la difusión molecular. Estos factores pueden
combinarse para dar la siguiente expresión para el balance de materia en la columna
CM _ 2
_ C M V S CS _
cm
DA _ tu (10.15)
t z2 z V t
M
De este modo, por un infinitesimal pequeña segmento dentro de la columna la cambio

de concentración de sustancia disoluta en la móvil fase por unidad tiempo es dado por la
cambios en concentración adeudado a la dispersión (primer término del lado derecho), y
al transporte de moléculas en la fase móvil (segundo término), y como resultado del
equilibrio adsorción/desorción (tercer término del lado derecho). La dispersión surge de
la difusión axial, la dispersión de remolinos como se describe por la camioneta Deemter
ecuación. En teoría además película difusión (es decir difusión de moléculas a través de
la capa de solvente estancada alrededor de las partículas) contribuirá a la dispersión
general, pero este efecto normalmente es pequeño y a menudo se ignora. El transporte de
flujo convectivo de moléculas a través de las partículas mejorará el transporte de masa y
reducirá la dispersión causada por la difusión intrapartícula de largo alcance. La revisión
de la transferencia de masa en la separación cromatográfica por Li et al. [10] se puede
recomendar para lecturas adicionales.
Desafortunadamente no existe una solución analítica para la ec. (10.15) para
cromatografía de elución en gradiente y resultados deber ser calculado numéricamente.
Este juntos con aproximaciones necesarias para la dispersión de zonas y para el equilibrio
de adsorción/desorción con carga alta de muestra, común en proceso cromatografía,
posee resultado en diferente enfoques por simulaciones teóricas de purificaciones
cromatográficas. El uso de la teoría de la cromatografía para modelar separaciones
cromatográficas se analiza a continuación.
10.2.5 Caudal resistencia de lleno camas
A veces es necesario abordar otros factores además de los cromatográficos. Por ejemplo,
incluso aunque la separación factor es largo suficiente a permitir por a disminuir en
separación tiempo, el presión soltar sobre la lleno cama a elevado caudal tarifas mayo
superar la presión calificación de la bomba o de la cromatográfico resina. En que caso a
disminuir en columna longitud puede ser una mejor solución (la resolución es
proporcional a la raíz cuadrada de la longitud de la columna, cf. eq. (10.2)).
los presión soltar sobre a lleno cama mayo ser calculado de la Hagen–Poiseuille
ecuación como adaptado a lleno camas por blake, Kozeny y Dirigente de coche, ver la
revisión por allen [11]
2
2 L 1 L 180(1 )
pa tu 36 k tu (10.16)
repag2 3
días
_
2 3
los primero término de ec. (10.16) es a conversión de intersticial líquido velocidad, tu ,

a nominal velocidad del líquido con la ayuda de la fracción vacía V 0 / V c donde Vc _
es la cama geométrica volumen y V 0 es la extra-partícula vacío volumen. los presión
soltar es dado en Pascual, papá N/m 2 , si la viscosidad de la solvente, , es expresado en
N·s/m 2 , la velocidad, tu , en cm/s y la longitud de la columna, L , y el tamaño de
partícula, d p , en cm (ver Apéndice A para factores de conversión). El factor de aspecto, k
, depende de la forma de las partículas y es cercano a 5 para perlas esféricas [12]. El
último término de la ec. (10.16) se denomina parámetro de resistencia al flujo y es usó a
comparar embalaje densidad y permeabilidad de lleno camas (ver Apéndice A para
definiciones) [1].
Eso es importante a aviso la largo influencia de la vacío fracción, , en la caudal
resistencia y la permeabilidad calculada. Por ejemplo, un lecho de esferas uniformes
compactas hexagonales tiene una fracción de vacíos de 0,26 [13] y produce una caída de
presión seis veces mayor que la de un lecho de esferas empaquetadas al azar, que tiene
una fracción de vacíos de 0,40. Cabe señalar que la fracción vacía de los materiales de
tipo sílice suele estar en el rango de 0,42 a 0,45, la de los polímeros sintéticos de tamaño
único es de alrededor de 0,36 a 0,40 y la de los polímeros no rígidos está en el rango de
0,30 a 0,33. Una fracción de vacío más alta produce caídas de presión más bajas pero una
mayor contribución al volumen del sistema que no se separa.
los influencia de viscosidad en caudal resistencia necesidades a ser consideró cuando
aplicando muestras viscosas o la adición de modificadores viscosos al eluyente, y al
transferir los métodos de separación a la cámara frigorífica.
Cambiando la partícula Talla de 100 a 10 metro aumenta la caudal resistencia 100
veces. Esto requiere la usar de alta presión sistemas por correr cromatografía resina de
pequeña tamaño de partícula (p.ej de 5 bar sistema usó por estándar cromatografía a 100
bar sistema por HPLC) incluso aunque la columna longitudes por HPLC normalmente
son corto que aquellos usó por cromatografía estándar. La gran influencia de la fracción
vacía en la caída de presión, como se ilustra en la Figura 10.3, espectáculos que un de
manera no homogénea lleno columna voluntad rendir más grande presión gota que
esperado de la Medido vacío fracción; de este modo, poco realista presión gotas mayo
ser
Figura 10.3 Caída de presión de lechos empacados de diferentes fracciones de vacíos en función del
tamaño de partícula. Calculado a partir de la ec. (10.16) con L 10 cm, y la velocidad nominal, u · 10
10.2 Basic 9
cm/min.
10.3 Purification 24
indicativo de columna deterioro. ecuación (10.16) es útil por determinando ya sea a el

lecho empacado está comprimido o no, es decir, si la resistencia al flujo es
sustancialmente mayor, por ejemplo, 50%, de lo esperado de partícula Talla, longitud,
viscosidad, vacío fracción y la contribución de factores del sistema (es decir conectores,
tubos, fritas, etc.). los caudal resistencia causado por la sistema mayo ser determinado por
reemplazando la lleno columna con un vacío columna de la mismo escribe.
La resistencia al flujo de un lecho empacado de resina de cromatografía semirrígida
dependerá no solo de las propiedades mecánicas del material, las fuerzas de fricción
aplicadas a la resina por la líquido, pero además en apoyo efectos, p.ej por la columna
pared. Por lo tanto, caudal propiedades son en general no linealmente escamoso cuando,
p.ej la columna diámetro es aumentó y el efecto se puede modelar como se analiza en el
Capítulo 12.
10.3 PURIFICACIÓN PRINCIPIOS
Como delineado en Capítulo 4 purificación mayo ser logrado por selectivo Interacción de
la soluto con la resina cromatográfica o por un modo no adsorbente, por ejemplo, como
en SEC.
El uso de la adsorción para la purificación ofrece opciones tanto para una alta
selectividad como para una alta capacidad. La interacción a nivel molecular difiere entre,
por ejemplo, exclusión por tamaño (afectada por interacciones estéricas), intercambio
iónico (siendo un fenómeno de interacción de largo alcance) y fase inversa (que implica
interacciones superficiales). Esto da como resultado diferentes relaciones entre el factor
de retención y las propiedades físicas del soluto y la resina de cromatografía.
La separación se puede realizar manteniendo el factor de retención, k , constante
durante la elución manteniendo constante la composición de la fase móvil, es decir,
condiciones isocráticas. Si la composición de la fase móvil cambia continuamente durante
la separación, por ejemplo, para disminuir gradualmente k , hablamos de separación de
gradiente. Si el cambio en la composición de la fase móvil es discontinuo para crear
cambios abruptos en k , hablamos de elución por pasos. Los diferentes modos de elución
se ilustran en la Figura 10.4.
10.3.1 Gel filtración/tamaño exclusión cromatografía, SEGUNDO
En la filtración en gel, o cromatografía de exclusión por tamaño, los solutos se separan en

función de las diferentes fracciones del volumen de poro que, por razones estéricas, están
disponibles para solutos de diferente tamaño. Por lo tanto, el volumen de la fase móvil de
un soluto no retenido es igual al volumen entre partículas, o vacío, V 0 . El volumen de la
fase estacionaria corresponde conceptualmente al volumen intrapartícula o poro, V i , del
medio cromatográfico. La relación de fase, V S / VM es por lo tanto igual a Vi / V 0 , que a veces
se denomina permeabilidad de la partícula cromatográfica (que no debe confundirse con
la permeabilidad del lecho empacado descrita anteriormente).
Retencion en la SEC
De las ecs. (10.4) y (10.5) y la expresión para la relación de fase dada anteriormente, se
obtiene la siguiente expresión para el volumen de retención, V R , en exclusión por tamaño
24 10. Optimization of Chromatographic
VR _ V0 K D V yo
(10.17)
a) elución isocrática
1.00
Mobile phase composition

Chromatogram
0.50
Relative
0.00
0 50 100 150
Retencion volumen
b) degradado elución
1.00
0.50 Mobile phase composition

Relative
Chromatogram
0.00
0 50 100 150
Volumen de retención
c) paso elución
1.00
Mobile phase composition

0.50
Relative
Chromatogram
0.00
0 50 100 150
Retencion
volumen
Figura 10.4 elución modos en líquido cromatografía cromatograma a bajo cargas de muestra .
dónde K D es la distribución coeficiente. los distribución coeficiente es relacionado a

las dimensiones del soluto y del poro a través de
 Ra
F(r) (10.18)
KD   1
R r   dr
donde R es el radio efectivo del soluto, r el radio de exclusión por tamaño de la

cromatografía resina, a a factor relacionado a la geométrico forma de la poro (es decir a
2 por poros de cilíndrico forma [14]) y f ( r ) la función de distribución del tamaño de
poro de la resina. La conclusión de este ecuación es que la retencion tiempo en Talla
exclusión es regulado solamente por factores geométricos y no poder ser equilibrado por
cambiando la composición de la móvil fase (a no ser que esto afecta a las dimensiones del
soluto o de los poros, por ejemplo, en el caso de los polímeros flexibles cargados).
La trama de KD versus el logaritmo del radio del soluto produce una curva sigmoidea
(siempre que se usen solutos de forma similar; la forma afectará a r , ver más abajo) con
una curva lineal aproximada región central que tiene una pendiente de dK D / día Iniciar
sesión r _ Esta curva se llama la curva de selectividad. los gráfico de Iniciar sesión R
versus K D , o más común, VR _ rendimientos a calibración curva. A angosto volumen de
poros distribución, F ( r ) voluntad rendir a empinado selectividad curva en gastos de
separación rango cubierto por la resina de cromatografía. Es importante notar que
también un soporte hipotético que tenga un solo tamaño de poro producirá una curva de
selectividad sigmoidea para moléculas más pequeñas que la poro Talla [15]. De este
modo, la selectividad curva es no idéntico con la acumulativo distribución del tamaño de
poro. Sin embargo, se puede derivar una distribución aparente del tamaño de poro a partir
de los datos de exclusión de tamaño [16].
los selectividad curva debería no ser confundido con la selectividad factor
definido en la ec. (10.6). Eso pueden ser mostrado que la Pendiente de la
selectividad curva es proporcional a ( 1)/ K D1 . El factor de selectividad, , tiene una
exclusión de tamaño muy alta (p. ej. es 4 para dos solutos que eluyen en los extremos
del intervalo de separación, K D 0,2 y 0,8, e incluso mayores para los solutos eluidos en
el volumen vacío y el volumen total, respectivamente). Sin embargo, el factor de
retención está limitado a 1 para resinas de baja porosidad y 2,3 para resinas de alta
fracción de poros que conjuntos un superior límite por la resolubilidad de Talla exclusión,
p.ej a resolución factor, R s , de 13 para k 2.3, 4 y N 10.000, cfr . ec. (10.2).
Ampliación de zona en SEGUNDO

El ensanchamiento de la zona en la exclusión por tamaño se debe principalmente a la
dispersión de la zona de la muestra de solutos grandes debido a la transferencia de masa
lenta, es decir, el término C en la ec. (10.10), además de la dispersión de remolinos, es
decir, la Término A [6, 17]. La zona de la muestra inyectada también añadirá a la total
zona ampliación, a no ser que este volumen es pequeña (p.ej menos que 0,5% de la
volumen de la columna) [18]. minimizando extra-columna contribuciones a la zona
ampliando es importante cuando se usa la exclusión por tamaño para calificar el
rendimiento de la columna (consulte el Capítulo 12). Despreciando las contribuciones del
sistema (p. ej., tuberías, volumen de la celda del detector, etc.), el ensanchamiento de la
zona puede aproximarse mediante

V 2L _ V V _  1
10.3 Purification muestra 24
H inyección de H 2 d
0
1 0
d 2 tu (10.19)
inyector k V VR _  V R  p 30 D
p
columna H 2
R
S
ecuación (10.19) dice a nosotros que la muestra volumen debería ser mantuvo bajo, la
inyector constante alto (ver eq. (10.22)) y la velocidad lineal debe ajustarse cuando el
tamaño de partícula o el soluto (es decir , D s ) se cambia en la exclusión de tamaño
analítico (por ejemplo, para la calificación de la columna). en preparatoria Talla
exclusión, cuando largo muestra volúmenes son aplicado, la inherente eficiencia de
tamaño de partícula pequeño cromatografía resinas es de menor importancia, p.ej
desalado de se pueden realizar grandes volúmenes de muestra utilizando partículas
grandes, lo que será ventajoso debido a la baja resistencia al flujo ( cf. eq. (10.16)).
Resolución en SEGUNDO
La resolución de los solutos en la exclusión por tamaño está determinada por las
diferencias de tamaño entre el soluto de interés y las impurezas, la selectividad de la
resina de cromatografía y parámetros como el caudal, el tamaño de partícula y las
dimensiones de la columna. La influencia de varios parámetros puede estimarse a partir
de la ecuación de resolución, es decir, eq. (10.1), adoptada para exclusión de tamaño
mediante el uso de eq. (10.17) y la relación k K D V yo / V 0
R 2 ( VR
2 VR1 _ ) 1 R
registro 2 dK D d Iniciar (10.20)
sesión R L
s
w w 4 R ( V V ) KH _
segundo 2 segundo _ 1 0 yD
dónde dK D / día Iniciar sesión R es la Pendiente de la selectividad curva, K D la promedio

distribución coeficiente, L la altura del lecho y H la altura promedio del plato de los
solutos.
Por lo tanto, la resolución aumenta con el aumento de la pendiente, el volumen de poro
y la altura del lecho y con decreciente vacío volumen, distribución coeficiente (aunque
allá es un óptimo valor de KD _ como se analiza a continuación) y la altura de la placa.
Influencia de experimental parámetros en SEGUNDO

De ecuaciones (10.17) a (10.20) nosotros pueden identificar que eficaz Talla y difusión
coeficiente del soluto, la velocidad de flujo de la fase móvil, el volumen de poro y la
distribución del tamaño de poro del medio de cromatografía, el volumen vacío y la
longitud de la columna, y el volumen y la viscosidad de la muestra son parámetros
importantes en la exclusión por tamaño. El efecto de varios parámetros se puede estudiar
utilizando el software de modelado suministrado.
PROPIEDADES DE LA SUSTANCIA DISOLUTA

La influencia de diferentes formas moleculares en la retención se ilustra en la Figura 10.5.
La razón del fenómeno observado es que la relación entre el tamaño y la masa molecular
difiere para solutos de varias formas (es decir, el radio cuadrático medio es proporcional a
M , M 1/2 y M 1/3 para varillas , bobinas flexibles y esferas, respectivamente). Así, es más
fácil a separado alargado solutos, p.ej ADN de intermedio Talla, que esferoidal solutos,
p.ej globular proteínas, tener igual diferencia en molecular masa. Sin embargo, este El
parámetro es generalmente de poco interés a menos que la forma del soluto o los
contaminantes puedan ser alterados (p. ej. por usando desnaturalizando resinas o
detergentes) sin que deteriorar la recuperación de un producto activo. Una alta
difusividad de soluto dará picos estrechos debido al efecto positivo en el no equilibrio
término (Término C) pero mayo, en la otro mano, dar amplio zonas adeudado a
longitudinal difusión (Término B), ver ec. (10.10). Este deber ser consideró cuando la la
temperatura
0.8
0.6 Sphere
Coil
Distribution
Rod
0.4
0.2
0
2 3 4 5 6 7 8 9 10
Tronco METRO
Figura 10.5 Influencia de soluto forma sobre la retención en Talla exclusión.
o la viscosidad del eluyente cambia o cuando se compara el ensanchamiento de zona de

diferentes solutos (p.ej por columna calificación). De este modo, zona ampliando
señalado por una sustancia disoluta mayo No ser importante a la separación situación a
mano. Un aumentar en zona ampliando adeudado a la temperatura (p. ej., transfiriendo la
columna de purificación a la cámara frigorífica) puede compensarse disminuyendo el
caudal de acuerdo con las ecs. (10.10) y (10.20), ver Ref. [6].
PROPIEDADES DE LA MÓVIL FASE

En teoría, Talla exclusión es independiente de la composición de la móvil fase (a no ser
que esto está afectando las dimensiones del soluto o de los poros). De hecho, las
variaciones en el tiempo de retención o la forma del pico con cambios en la composición
de la fase móvil o la temperatura son indicativas de efectos de entalpía e interacciones de
modo mixto. Para evitar interacciones iónicas con la pequeña cantidad de grupos iónicos
presentes en la mayoría de los materiales de exclusión por tamaño, adición de electrolitos,
por ejemplo, 25–150 cloruro de sodio mM, puede ser necesario. En el caso de
interacciones de modo mixto, puede ser necesario incorporar la teoría de, por ejemplo, la
cromatografía de intercambio iónico o de interacción hidrófoba (HIC) para explicar el
comportamiento de retención.
los caudal Velocidad voluntad influencia la difusional ampliando de la muestra zona
(equivalente (10.10)) y el efecto puede ser sustancial para solutos grandes de bajo
coeficiente de difusión (por ejemplo, proteínas séricas) como se indica en la Figura 10.2
(es decir, la velocidad reducida es inversamente proporcional al coeficiente de difusión).
Cabe señalar que la exclusión por tamaño de los solutos de bajo peso molecular debería
ser transportado afuera a relativamente alto caudal tarifas a reducir axial difusión. En
teoría, usando un creciente caudal degradado a mantener la reducido velocidad constante
cuando progresivamente más pequeño solutos son apartado voluntad ser óptimo A
disminuir en ciclo tiempo con a factor de dos era reportado [6]. Sin embargo, este mayo
ser difícil a aplicar en Gran escala Talla exclusión. El caudal óptimo, dado por una
velocidad reducida de 5, como se ve en la Figura 10.2, es proporcional a D M / d p y esto
será imprácticamente bajo para las macromoléculas. Permitiendo que una zona que se
ensancha desde el C-término sea igual a la del El término A resultó en la siguiente
recomendación para la tasa de flujo en la exclusión de tamaño [6]:
D
F A sesenta y cinco k
10.3 Purification M_ 25
60
(10.21)
cD _
d
pags
donde F es el caudal (ml/min) y A c el área de la sección transversal de la columna (cm 2

). incorporando K D en este ecuación voluntad cuenta por diferente valores de S en
ec. (10.3) (es decir, establecer K D 0.6 producirá una velocidad reducida recomendada
de 40 que está en buen acuerdo con Figura 10.2). Este recomendación lo hace no
mantener por desalado donde el soluto de interés se excluye de la fase porosa y se
pueden usar velocidades de flujo muy altas sin un ensanchamiento severo de la zona.
los zona ampliando de la sustancia disoluta es afectado por sustancia disoluta
difusividad como indicado por ec. (10.19). A tasas de flujo altas, se puede esperar que la
altura de la placa sea inversamente proporcional a sustancia disoluta difusividad, previsto
la muestra volumen es pequeña. los difusividad aumenta proporcionalmente a la
temperatura e inversamente proporcional a la viscosidad. La viscosidad disminuye con la
temperatura. De este modo, alto viscosidad de la eluyente es en general evitado El efecto
de la temperatura debe tenerse en cuenta al realizar separaciones en una cámara
frigorífica. Por lo tanto, la transferencia de una separación por exclusión de tamaño de 22
a 3 C resultó en una disminución de la resolución en un 20%. La resolución se restauró al
disminuir el caudal en un 47% [7].
PROPIEDADES DE LA CROMATOGRAFÍA RESINA

La elección de la resina de cromatografía que tenga una distribución de tamaño de poro
óptima se ve afectada por la composición de la muestra a purificar. Si la molécula
objetivo y los contaminantes difieren sustancialmente en tamaño (por ejemplo, más de
una década en masa molecular), puede ser posible usar una resina de cromatografía que
tenga un tamaño de poro que excluya la molécula objetivo. pero no la contaminantes o
vicio viceversa Este es la la mayoría favorable situación, es decir crea el factor de
selectividad más alto y permitirá una gran libertad para elegir los parámetros de
funcionamiento que voluntad afectar productividad, tal como muestra volumen, caudal
Velocidad, columna longitud, etc., lo que puede generar un gran ensanchamiento de la
zona. Además, eluyendo el soluto de interés en la vacío volumen la zona ampliando de la
sustancia disoluta voluntad ser mínimo y la factor de dilución bajo, p. ej. 1,25 veces.
Si la objetivo molécula solamente difiere levemente en Talla de la contaminando
solutos (p.ej como para los anticuerpos monoclonales oligoméricos), la elección de las
dimensiones de los poros es más crítica y una resina de cromatografía que tenga una
distribución estrecha del tamaño de los poros (es decir, una alta selectividad) y que tenga
un tamaño de poros a partir del cual la molécula diana se eluya a aproximadamente la
mitad del volumen de una columna ( K D 0.4) es óptimo [6]. los aumentar en
selectividad cuando yendo de a tamaño convencional exclusión medio (p.ej
Sepharose™) a a medio de máximo selectividad (p. ej., Superdex™) puede permitir
duplicar la resolución o, en teoría, reducir la separación tiempo por a factor de cuatro
por creciente la caudal Velocidad (previsto la C-término en la ec. (10.10) es
dominante) o disminuyendo la longitud de la columna por este factor [19].
De la ec. (10.20) se puede concluir que el volumen de poro debe ser lo más alto
posible. El aumento de la fracción de poros Vi / V 0 de 1,2 a 2,0 correspondió a una
duplicación de los recuentos en placa de 1400 a 2700 [20]. En este caso, la longitud de la
columna se podría haber reducido con un factor de dos manteniendo la resolución.
En el intercambio de tampón, el volumen de poros será el factor determinante para la
tasa de procesamiento, es decir, en teoría, se puede aplicar un volumen de muestra igual
al volumen de poros. Debido a la dispersión (es decir, el término A y las contribuciones
del sistema), el volumen de muestra aplicable será ligeramente menor (por ejemplo, el 80
% del volumen de poro).
Como se ve en la ec. (10.20) el volumen vacío debe mantenerse bajo. Esto se debe al
hecho de que el volumen vacío no contribuye a la separación, sino que solo "ocupa" un
volumen de columna valioso. El volumen vacío está relacionado con la estructura de las
partículas (distribución de tamaño, rigidez y forma) y la densidad de empaquetamiento (
cf. eq. (10.16)). Rendimiento de partículas irregulares más grande vacío fracciones que
esférico resinas Vacío fracción por diferente Talla exclusión Se encontró que las resinas
variaban de 0,30 para la agarosa a 0,40 para la sílice esférica [6]. El volumen vacío
influirá en la resistencia al flujo, como se muestra en la Figura 10.3.
los partícula Talla de la cromatografía resina influencias la zona ampliando adeudado a
la disminucion en difusión distancias con disminuido partícula radio. Ya que la C-término
es dependiente al la cuadrado de partícula Talla la efecto es bastante largo y a largo
velocidades (es decir cuando el C-término es dominante) la resolución voluntad ser
inversamente proporcional a la partícula Talla. Sin embargo, esto tiene poca relevancia en
la exclusión preparatoria por tamaño cuando se van a purificar grandes volúmenes de
alimentación y el volumen de la muestra dominará el ancho del pico. Por lo tanto, el
tamaño de partícula debe optimizarse teniendo en cuenta la carga de la muestra (ver más
abajo).
los resolución es proporcional a la cuadrado raíz de la columna longitud. los eficaz
columna longitud mayo ser aumentó por agregando columnas en serie (p.ej como con la
pila columnas). Sin embargo, se puede perder algo de resolución debido al
ensanchamiento de la zona en los conectores entre las columnas. Aumentar el diámetro
del lecho aumentará el volumen de poro del sistema y, como se describió anteriormente,
esto tiene un efecto muy positivo en la resolución si la velocidad del fluido se mantiene
constante (sin embargo, el ancho del pico también aumentará debido al aumento del
tiempo de retención y la zona estar más diluido).
MUESTRA CARGA
La carga de la muestra es un producto de la concentración de la muestra y el volumen de
la muestra. En la exclusión por tamaño preparativa, el alto volumen de muestra
contribuirá al ancho total del pico como se describe en la ec. (10.19). Se ha encontrado
que la constante dependiente del inyector, K inyector , es cercana a 5 para inyectores de
laboratorio ordinarios y cercana a 12 para inyectores óptimos y grandes muestra
volúmenes dónde la inyección perfil es a cuadrado ola [18]. A muy largo En los
volúmenes de muestra, la carga será el factor limitante para el ancho de pico y, por lo
tanto, para la resolución.
Un óptimo muestra volumen cuando Procesando largo alimenta mayo ser calculado
con la ayuda de ec. (10.19). Este óptimo voluntad balance la perjudicial efectos de a largo
muestra volumen (es decir, ejecutar pocos ciclos) y la ampliación de la zona funcionando
a caudales elevados (es decir, dividir la muestra en muchos ciclos). Una guía para el
volumen de muestra óptimo está dada por
V k VV d 2  1 3
inyector de alimentación c i
Inyección en V , optar pags (10.22)
 
15 D M
 
donde V alimenta ml de muestra se va a procesar por hora. Se encontró que la ecuación

apoya la regla general de procesar un volumen igual al 2–6% del volumen de la columna
para cada ciclo en tiempos de ciclo de 5–1 h [7].
los muestra concentración que es aplicable es restringido por la viscosidad de el
tapón de muestra inyectado en comparación con la viscosidad del eluyente. La regla
general es que el pariente viscosidad de la muestra enchufar debería ser menos que 1.5.
Este corresponde a a
concentración de muestra de aprox. 70 mg/ml de una proteína globular como la albúmina

sérica [6]. La alta viscosidad de la muestra provocará una zona posterior distorsionada de
la banda de elución [21]. Esto se puede evitar utilizando un eluyente de igual viscosidad
(aunque no es aplicable en general) o reduciendo los efectos de la viscosidad mediante
construcciones de columnas especiales [22].
10.3.2 Ion intercambio cromatografía, CEI
La interacción en IEC se ha descrito tradicionalmente mediante un modelo

estequiométrico en el que el soluto desplazará una cantidad de contraiones de la
superficie, igualando la cantidad de iones que interactúan. sitios de la sustancia disoluta
[23, 24]. Este modelo posee estado cuestionado y a modelo donde general electrostático
Interacción teoría por cargado superficies es usó a explique la se ha presentado la
retención [25]. Una evaluación de los dos conceptos utilizando resinas cromatográficas
débilmente cargadas arrojó resultados a favor de la teoría de la interacción electrostática
[26]. Sin embargo, se sugirió que los dos modelos describirían diferentes extremos de
IEC y más lejos investigaciones deber ser realizado antes de a concluyente declaración
pudo ser hecha. Dado que el modelo de desplazamiento estequiométrico (SDM)
proporciona actualmente la base para la teoría del intercambio iónico, se utilizará en esta
sección.
Los modelos estequiométricos se han refinado para incorporar el blindaje estérico del
intercambio iónico. grupos por largo solutos Este modelo es llamó la estérico masa
acción (SMA) y se usó para modelar IEC en modo de sobrecarga [27].
Retencion en CEI
los retencion factor en CEI es a función de la concentración de sal en la móvil fase, c , y
las propiedades del soluto y del adsorbente según [3]
k  k 0  c z Iniciar sesión k 
(10.23)
Iniciar sesión k 0  z Iniciar sesión C
dónde k 0 es relacionado a la ion intercambio capacidad de la medio, Q v , ( k 0 es

proporcional a Q z ) y z la carga interactuante o característica del soluto. Esta ecuación se
y
da para la estequiométrico modelo (en la electrostático modelo en k es proporcional a yo
1 2
, donde I es la fuerza iónica) [25]. La relación entre el volumen de retención y la
concentración de la fase móvil se muestra en la Figura 10.6. La retención varía
drásticamente con c y z . Se ve que la retención será sensible a la fuerza iónica sólo en
una región limitada, la ventana de elución, y que manteniendo constante la fuerza iónica
se separarán moléculas, que difieren sólo ligeramente en z , muy separadas. Por otro lado,
la separación de mezclas de solutos que varían sustancialmente en z requiere un cambio
continuo en c , es decir, una elución en gradiente. Sin embargo, tal separaciones (es decir
simultáneo separaciones de varios componentes) son sólo de interés principal en
aplicaciones analíticas. En las separaciones preparativas, las grandes diferencias en z son
favorables, ya que esto permite la elución en gradiente escalonado. Los valores típicos
para la carga característica de las proteínas en IEC están en el rango de 3,6 a 8,2 [24] y de
4,8 a 7,5 [28], aunque esto variará con el pH; consulte el Capítulo 9.
Puede notarse que la ec. (10.23) predice que todos los solutos se moverán a lo largo del
lecho de la columna y que este efecto no es despreciable a menos que k es largo. Por lo
tanto, se recomienda
20 z=4 z=2 z=1

z=0.5
15
10
k
0
1
0 0.5
Fuerza iónica de la fase móvil
Figura 10.6 Influencia de fase móvil sal concentración y característica cobrar en retencion en
cromatografía de intercambio iónico (IEC).
aplicar la muestra en a bajo fuerza iónica buffer, sin embargo a también bajo iónico
fuerza mayo conducir a una baja capacidad dinámica (ver más abajo). Para solutos
fuertemente adsorbidos, la concentración de la fase móvil puede necesitar incrementarse
considerablemente para desorber el soluto. Con el fin de reducir los tiempos de
separación (y la dilución excesiva de las zonas de la muestra), en la cromatografía de
elución de mezclas complejas, la concentración varía de forma continua (cromatografía
de gradiente) o paso a paso. Para casos especiales, la combinación de elución isocrática,
escalonada y en gradiente puede ser favorable.
El volumen de retención viene dado por la ec. (10.4), (es decir, V R VM _ k VM ) .
Esta ecuación es válida sólo para condiciones en las que el factor de retención es
constante, es decir, en condiciones isocráticas. En caso de que se cambie la concentración
de la fase móvil (es decir, como en la elución en gradiente), el factor de retención también
cambia continuamente. El factor de retención aparente calculado a partir del volumen de
retención en la elución en gradiente no tiene ningún significado fisicoquímico [3].
Si el sistema cromatográfico contiene grandes volúmenes muertos extracolumna, estos
se agregarán al volumen de retención (pero no deben incorporarse en el cálculo). de VM
, ver Sección 10.7) .
Zona ampliando en CEI

El ensanchamiento de la zona en la elución isocrática se verá afectado por los mismos
factores que se observaron para la exclusión por tamaño. Si la reacción de adsorción-
desorción no es rápida, este factor también contribuirá. a zona ampliando Sin embargo, en
degradado elución a afilado efecto de la se obtiene un gradiente (es decir, las moléculas
en la parte delantera de la zona perciben una fuerza iónica más baja y, por lo tanto, un
factor de retención más alto que las moléculas en la parte trasera de la zona). Esto
significa que se alcanzará un estado estacionario en cuanto a la ampliación de la zona y,
además, todas las muestras las zonas tendrán el mismo ancho (estrecho) en la columna,
siempre que las condiciones de elución (p. ej., longitud de la columna y condiciones de
gradiente) sean suficientes para promover este estado estacionario. El grado de nitidez de
la zona dependerá de la pendiente del gradiente (mayor grado
de nitidez para un gradiente más pronunciado) y también en la relación entre k y la fuerza

iónica del soluto. Para resinas tradicionales, anchos de pico del 50 al 80% de los
calculados a partir de la ec. (10.10) puede esperarse [8, 29]. Este efecto de nitidez es,
junto con la posibilidad de regular k , la principal ventaja de la elución en gradiente.
Resolución en CEI
los resolución en isocrático elución ion intercambio es dado por ec. (10.2). A gráfico de
resolución versus k espectáculos que la efecto de k es bajo por k arriba 10, ver Figura
10.2. También la El efecto más grande en la resolución proviene de las diferencias en k
entre los dos solutos,
es decir la selectividad.
Ya que k varía durante degradado elución, ec. (10.2) pueden no ser usó por cálculo de
resolución en este modo de elución. Yamamoto y colaboradores [29] encontraron que la
siguiente ecuación era útil para predecir la influencia de los parámetros experimentales en
la resolución en la elución de gradiente lineal de proteínas en intercambio iónico y HIC.
L
$( gV0 H 10,24 )
dónde L es la columna longitud, gramo la degradado Pendiente (Topo / L por litro

degradado volumen), V 0 el volumen del vacío intersticial y H la altura de la placa. La
altura de la placa será ligeramente inferior a la calculada a partir de la ec. (10.10) debido
al efecto de agudización de zonas del gradiente siempre que la carga de la muestra sea
baja y la cinética de desorción sea rápida. A tasas de flujo altas, la altura de la placa será
proporcional al término C. La influencia de la longitud de la columna puede ser sustituido
en ec. (10.24) por ajuste L V c / un c dónde una c es la transversal área de la columna y V
c es el volumen geométrico de la columna.
Influencia de experimental parámetros en CEI

los retencion en ion intercambio es determinado por la cobrar de la sustancia disoluta y la
intercambiador y la fuerza iónica del tampón. El tamaño de las partículas, las
dimensiones de los poros y la tasa de flujo afectarán la tasa de transferencia de masa y la
resolución estará limitada por la carga de la muestra. La pendiente del gradiente es
importante en la elución del gradiente.

Para solutos anfóteros (es decir, solutos cuya carga depende del pH) o intercambiadores
débiles, el pH del tampón es de gran importancia. Para asegurar la ionización completa, el
pH debe diferir en al menos una unidad del p K a de los grupos cargados. Para proteínas y
oligopéptidos se puede notar que el punto isoeléctrico es equivalente al pH donde la carga
neta de la biomolécula es cero. Sin embargo, pueden existir áreas de carga positiva por
encima del punto isoeléctrico y áreas de carga negativa por debajo del punto isoeléctrico
que promoverán interacciones. con catión y anión intercambiadores (efectos de pH tener
estado señalado como lejos como cuatro unidades de la isoelectrico punto). los pH
voluntad afectar la característica cobrar y de este modo tienen una gran influencia en el
factor de retención y la resolución ( cf. Figura 9.3). Para proteínas básicas separadas en
un anión intercambiador la retencion voluntad aumentar con creciente pH. Para ácido
proteinas apartado en a catión intercambiador la retencion voluntad disminuir con un

aumentar en pH. La magnitud del cambio será dictada por la pendiente de la curva de
titulación (un gráfico de carga versus pH) por cada proteína. Si la Pendiente es similar
(cual es con frecuencia la caso) después todas las proteinas voluntad ser afectado en a
similar camino por a cambio en pH y no ganar en selectividad se obtendrá a menos que el
pH supere el punto isoeléctrico de una proteína o si la distribución de carga de las
proteínas es muy diferente ( cf. Figuras 4.9, 4.10 y 9.4).
Debe tenerse en cuenta que las propiedades específicas del soluto pueden causar
cambios en las posiciones de elución cuando se cambia la composición de la fase móvil o
la carga de la muestra. Esto puede deberse a diferentes relaciones carga-pH, diferencias
en la distribución de carga (parches), influencia del tamaño del soluto en k o un efecto de
cruzar isotermas (ver más abajo).

los influencia de la escribe de contraiones en selectividad posee estado discutido
(p.ej ver ref. [28]). Sin embargo, se ha demostrado que no se esperan efectos específicos
de la sal utilizada. [30]. los gobernante parámetro es la elución fuerza de la sal y la efecto
de un tipo de sal puede obtenerse con otro tipo de sal ajustando la concentración. Las
fuerzas de elución relativas de los diferentes iones se enumeran en la Tabla 10.1.
El factor de retención depende de la capacidad iónica del medio cromatográfico.
aumentó a la energía de z (equivalente (10.23)). Sin embargo, por acuerdo Qv / c _
constante también k es mantuvo constante [3]. De este modo, si la iónico fuerza
necesario a desorber a sustancia es una alternativa inadecuada puede ser utilizar una
resina de cromatografía que tenga otra capacidad iónica.
Optimización de las condiciones de inicio (es decir, la fuerza iónica del tampón de
inicio) y la pendiente del gradiente es importante para la resolución en la elución del
gradiente (es decir, para afectar la distancia pico a pico y mantener baja la dispersión). En
preparaciones de laboratorio se han elaborado diferentes formas del gradiente pero esto es
complicado para propósitos a gran escala. Para la razón de robustez escala industrial
purificaciones por CEI son preferentemente basado en la elución por etapas del soluto
objetivo. Sin embargo, dado que la elución en gradiente generalmente ofrece una mayor
resolución de solutos que tienen afinidades similares por el adsorbente, este principio de
elución está ganando popularidad, especialmente a medida que se dispone de equipos
para la elución en gradiente confiable a gran escala (consulte el Capítulo 11). La elución
en gradiente también producirá zonas más concentradas de producto eluido debido al
efecto de nitidez. Además, la influencia de la carga característica en k (véase la figura
10.6) hace necesaria la elución en gradiente o por etapas para la elución de moléculas
grandes (p. ej., proteínas), mientras que los solutos pequeños (p. ej., péptidos) pueden
separarse en condiciones isocráticas [31].
El caudal no es crítico en IEC siempre que el tiempo de contacto (es decir, el tiempo
permitido para que la muestra se equilibre con el medio de cromatografía) sea suficiente.
En la mayoría de los casos,
Mesa 10.1
elución fuerza de diferente iones [30]
Cromatografía de intercambio de aniones

Acetato formiato cloruro bromuro sulfato citrato
Cromatografía de intercambio catiónico
Litio sodio amonio potasio magnesio calcio
la cinética es lo suficientemente rápida como para permitir el uso de velocidades de flujo

muy altas en gradiente o elución por pasos. La dispersión que tendrá lugar durante la
elución (es decir, debido a la exclusión por tamaño del soluto) diluirá un poco las zonas,
pero el efecto sobre la resolución se compensa regulando la selectividad (además, hay un
efecto de agudización de zonas en la elución en gradiente). ). Por lo tanto, la IEC se
realiza a caudales elevados en comparación con la exclusión por tamaño. Sin embargo,
como es evidente a partir de la ec. (10.24) la resolución disminuirá con valores crecientes
de H , y H se verá afectado predominantemente por el término C, es decir, proporcional al
caudal, a caudales altos. Por otra parte, mantener constante el tiempo de separación
significa que g será inversamente proporcional al caudal y, por lo tanto, el efecto neto
sobre la resolución será nulo.

El factor de selectividad depende del tipo de grupo cargado y el número de cargas, pero
generalmente no está influenciado por la matriz como tal, a menos que influyan los
mecanismos de interacción secundarios (p. ej., interacciones hidrofóbicas o exclusión por
tamaño). Así la separación patrón en a HPLC escribe de resinas, p.ej Mononucleosis
infecciosa Q™, estaba fundar a ser muy similar al de Q Sepharose Fast Flow (que tiene el
mismo grupo funcional), lo que facilitó el aumento de escala desde las condiciones de
laboratorio [32].
El tamaño de partícula influirá en la altura de la placa de la misma manera que para la
exclusión por tamaño, aunque el efecto puede no ser tan dramático debido al efecto de
agudización de zonas de la elución en gradiente. El efecto del tamaño de partícula sobre
la resolución de proteínas en gradiente de elución se calculó a partir de la ec. (10.24), y se
encontró una buena correlación con los resultados experimentales [33]. Menor partículas
en general mostrar más rápido masa transferir adeudado a corto difusión caminos, lo que
resulta en una mayor capacidad dinámica de las partículas más pequeñas.
El tamaño de poro y la estructura de poro de la resina de cromatografía afectarán la
accesibilidad de los sitios de adsorción para los solutos y la cinética del proceso de
adsorción/desorción. Por lo tanto, para resinas de cromatografía de poro ancho de
moléculas grandes que tienen Se preferirá una estructura de matriz de cromatografía
abierta para proporcionar un acceso rápido a los sitios de adsorción y que minimice el
riesgo de bloquear las vías. Los resultados de la comparación de resinas cromatográficas
de diferente estructura de poros indican que las matrices cromatográficas macroporosas
son favorables excepto para solutos muy pequeños. Por lo tanto, los poros demasiado
grandes pueden producir una relación desfavorable entre el área superficial y el volumen,
lo que resulta en una disminución de la capacidad. En la mayoría de los casos, el sitio de
adsorción se vuelve más accesible uniéndolos a la superficie de la matriz de
cromatografía a través de un brazo espaciador, lo que tendrá un efecto positivo en la
capacidad disponible y la cinética de adsorción.
los difusivo masa transporte de solutos es la primario limitando factor previsto que
la cinética de adsorción/desorción sea rápida (que suele ser el caso en IEC). Como se ha
señalado para los catalizadores y las resinas cromatográficas, el transporte de masa puede
mejorarse promoviendo el flujo convectivo a través de las partículas cromatográficas
[34–36]. Esto se logra aumentando la poro dimensiones de la partículas a ser en la
mismo ordenar como que de el vacío canales entre las partículas para disminuir la
resistencia al flujo de la perla porosa ( cf. _ ec. (10.16)). Aplicaciones de largo poro
Talla cromatografía resinas establecido en sintético como bien como natural polímeros
por CEI de proteinas tener estado descrito [37–39]. resinas superporosas son caracterizada
por más alto resolución a elevado caudal tarifas como comparado a tradicional
resinas de cromatografía como resultado del aumento en la transferencia de masa [39]. La

contrapartida de la velocidad es la capacidad reducida provocada por la reducción de la
matriz cromatográfica (es decir, los superporos). Se demostró que la productividad de las
resinas convencionales puede en algunas situaciones exceder la de las resinas
superporosas debido a esta pérdida de capacidad [40, 41]. En otra comparación, se
encontró que una resina de cromatografía compuesta, en la que se informa que el
transporte tiene lugar a través de la llamada difusión superficial, proporciona una alta
capacidad a altas velocidades de flujo y comparado además favorablemente a la
propiedades de superporoso resinas [42]. Este ilustra que allá es a continuo desarrollo de
proceso cromatografía resinas por CEI, y además, las herramientas para la evaluación
correcta de las propiedades de estas resinas en comparación con las alternativas
tradicionales son esenciales para el profesional en el campo.
MUESTRA CARGA
En la elución isocrática, el volumen de la muestra contribuirá a la ampliación de la zona
en cuanto a la exclusión por tamaño y se concluyó que la sobrecarga de concentración
proporciona un rendimiento máximo [43]. los muestra volumen es no a crítico factor en
degradado elución CEI a no ser que la la solución de muestra es de alta fuerza iónica (por
ejemplo, tiene un alto contenido de sal). En condiciones desfavorables la sustancia
disoluta mayo ser eluido durante la muestra solicitud, como a resultado de o isocrático
elución (p.ej adeudado a también alto sal contenido) o frontal cromatografía (es decir otro
componentes de la muestra son más fuertemente retenido). Este debería ser comprobado
por determinar la capacidad de penetración del soluto objetivo en la solución de
alimentación (ver más abajo).
La concentración de la muestra interactúa con el volumen de la muestra y está limitada
por la cantidad de muestra que se puede aplicar, que a su vez está determinada por la
capacidad de la resina de cromatografía para el soluto (y la influencia de los solutos
contaminantes). Al principio del proceso de purificación, la concentración de la muestra
como tal suele ser baja y la IEC es un paso de concentración muy eficiente, además de la
purificación de otros solutos.
los muestra carga voluntad influencia la resolución ya que la banda voluntad ocupar a
finito ancho. Restricción la carga a menos que 30% de la máximo carga voluntad
normalmente ser suficiente para evitar la sobrecarga y la influencia sobre el ancho del
pico o el tiempo de retención será pequeña [8]. En práctica este medio que 25% de la
columna es usó por muestra cargando tiempo 75% de la columna es usó por la separación
(obviamente allá es a más bajo límite a la columna longitud para que esta regla general
sea válida).
los efecto de sobrecarga modo, como a resultado de volumen o concentración
sobrecarga, es discutido a continuación (ver 'Cromatografía no lineal' a continuación).
La capacidad es, junto con la recuperación cuantitativa de soluto, la característica más
importante de la resina de cromatografía y las condiciones experimentales elegidas. Por
ejemplo, algunas resinas cromatográficas pueden mostrar una capacidad muy alta pero un
rendimiento bajo y, por lo tanto, es importante un examen cuidadoso de las propiedades
(p. ej., capacidad de penetración y cálculos del balance de materiales) de la resina
cromatográfica en las condiciones experimentales elegidas .
La capacidad de unión dinámica experimental depende de varios parámetros
experimentales, por ejemplo, la carga y el tamaño de la molécula objetivo, el tamaño y la
carga de los poros de la resina de cromatografía y la fuerza iónica del disolvente. Por lo
tanto, se demostró que, bajo ciertas condiciones, la capacidad de unión dinámica
disminuyó con la disminución de la fuerza iónica, lo que es contrario a las expectativas
generales [44].
10.3.3 fase inversa cromatografía, RPC
El mecanismo de retención en RPC aún no se comprende completamente [46]. La

retención se ha explicado a partir de un modelo solvofóbico en el que el soluto se ve
obligado a pasar a la fase estacionaria debido a la fuerte mutual Interacción de la
moléculas en la móvil fase (de este modo 'excluyendo' el soluto de la fase móvil). La
retención, en este modelo, está relacionada con los parámetros de solubilidad del soluto y
los componentes de la fase móvil aunque la relación es complicada y solo se da
información cualitativa aplicando la teoría [3, 46]. Otro modelo que estaba discutido más
temprano estaba establecido al líquido-líquido fraccionamiento de el soluto Entre la
móvil fase y la estacionario fase o la líquido estacionario interfaz pero tal efectos tenido
no estado mostrado experimentalmente. Sin embargo, experimental evidencia apoyando a
fraccionamiento proceso Entre pequeña no polar solutos y la estacionario fase ha sido
presentado [45, 47]. En la otro mano, eso estaba fundar que polar solutos se comportó
diferentemente de los solutos no polares [47]. También se puede esperar que los solutos
grandes se comporten de manera diferente de pequeña solutos Por lo tanto, en este
alcance, trascendencia de RPC teoría voluntad hacerse con referencia a la teoría existente
(por ejemplo, ver Ref. [3]).
Retencion en RPC
El factor de retención en RPC puede estar relacionado con la concentración de
modificador orgánico en la fase móvil, c , según
k  k 0  10 ( mc ) Iniciar sesión k 
(10.25)
Iniciar sesión k 0  mc
donde m es la relación de las áreas de la resina ocupadas por una molécula de soluto a la
ocupada por una molécula del solvente [3]. Cabe señalar que k 0 contiene constantes
específicas de disolvente y fase estacionaria y también la relación de fase , V S / VM (que
puede diferir entre materiales). El factor de retención disminuye rápidamente con el
aumento de la concentración. de orgánico modificador y la disminuir es atenuado por
solutos de largo Interacción área (es decir m ) como visto en Figura 10.7. Este efecto de la
sustancia disoluta Talla en k posee estado verificado experimentalmente y utilizado para
explicar el diferente comportamiento de retención de proteínas y solutos más pequeños en
RPC [31, 48]. El efecto es que los solutos grandes eluyen dentro de una ventana muy
estrecha de % de modificador orgánico, es decir, un pequeño porcentaje (y la retención,
por lo tanto, se ha interpretado erróneamente como un mecanismo de encendido y
apagado) [48]. Esto también da como resultado que el efecto de la longitud de la columna
sobre la resolución sea bastante pequeño para las proteínas en comparación con los
péptidos.
ecuación (10.25) es una simplificación donde se ha despreciado un término cuadrático
con respecto a la concentración. En algunos casos, se necesita la ecuación completa para
tener en cuenta las variaciones de k con concentración de fase móvil [3].
Zona ampliando en RPC

El ensanchamiento de zona en RPC isocrático será similar al de exclusión por tamaño,
siempre que la adsorción-desorción mecanismo es rápido. En degradado RPC la afilado
efecto, o El efecto de compresión de banda del gradiente dará como resultado un menor
ensanchamiento de la zona que una exclusión por tamaño. Además, los anchos de los
diferentes picos no variarán sustancialmente para los solutos de
similar Talla. Como a regla de pulgar, la cima ancho voluntad ser apenas igual a que de a
sustancia eluida isocráticamente con un factor de retención de 1–2 [3].
Resolución en RPC
La resolución en RPC se describe mediante la ec. (10.1). En cuanto a IEC, el mayor efecto
sobre la resolución es fundar por k 10 ( cf. _ Figura 10.1). los relación expresado en ec.
(10.24) es además
aplicable a RPC [49]. Snyder y estadalius fundar que $ t 0,5 días 1 , dónde t es la gra-
GRAMO pag G
tiempo diferente en RPC. Esto se puede reorganizar a la ec. (10.24) siempre que el
término C domine la altura de la placa.
Influencia de experimental parámetros en RPC

Los parámetros que pueden influir en la resolución en RPC son los que afectan la
selectividad, es decir, el tamaño y las propiedades de solubilidad del soluto, el tipo y la
concentración de los ligandos y el tipo y la concentración (gradiente) de los compuestos
orgánicos. modificador La zona ampliando voluntad ser afectado por caudal Velocidad,
partícula Talla, columna longitud, sustancia disoluta Talla y cinética de sorción. El
tamaño y la estructura de los poros de la fase sólida influirán tanto en la cinética como en
la capacidad disponible.

los Talla de la sustancia disoluta voluntad influencia la ocupado adsorbente área y eso
mayo ser esperado que el retencion voluntad aumentar con hidrofóbico superficie área de
sustancia disoluta. Para instancia, un Se ha observado una relación exponencial entre la
longitud de la cadena peptídica y el tiempo de retención [50]. De la influencia de
sustancia disoluta Talla en la retencion factor largo moléculas son eluido dentro de un
muy angosto rango de fase móvil composición en degradado elución RPC ( cf. _ Figura
10.7). También se puede señalar que las moléculas que tienen una estructura ordenada
pueden sufrir cambios conformes como resultado de las interacciones soluto-sorbente.
Dichos cambios conformacionales pueden ser reversibles o irreversibles, como se observa
en las proteínas de las resinas de fase reversa [51–53].
Importante solubilidad parámetros de solutos son difícil a extracto. Sin embargo, por
moléculas tales como péptidos intentos a relatar retencion a aminado ácido
hidrofobicidad coeficientes
20
(50/20,000)(50/2E12) (5/20,000)
18
dieciséis
14
12
10
k
8 (5/20)
6
4
2
0
0% 20% 40% 60% 80%
Concentración de orgánico modificador
Figura 10.7 Retencion en fase inversa cromatografía (RPC) por largo y pequeña solutos
Calculado a partir de la ec. (10.25) con ( m / k 0 ) como se indica en la figura.
tener reunió con alguno éxito [50]. Sin embargo, este Acercarse es difícil por más grande
moléculas,
por ejemplo, proteínas, que pueden exponer parches hidrofóbicos interiores como resultado de
cambios conformacionales secundarios inducidos por interacciones soluto-superficie.

La fuerza del disolvente del modificador orgánico influirá en el efecto solvofóbico y
puede ser esperado que a más fuerte solvente voluntad más fácilmente aceptar la
lipofílico sustancia disoluta. Por lo tanto, la disolventes mayo ser organizado de acuerdo
a a creciente elución fuerza como en Mesa 10.2. A solvente de alto hidrofóbico fuerza
es seleccionado por solutos de alto hidrofobicidad. En algunos casos se han utilizado
mezclas de modificadores orgánicos de diferentes propiedades para aumentar la
resolución; sin embargo, este es más apropiado por analítico propósitos o purificaciones a
escala de laboratorio. La influencia de la viscosidad del solvente en la resistencia al flujo
( cf. eq. (10.16)) puede ser prohibitiva para el uso de algunos solventes o mezclas de
solventes (p. ej., la viscosidad de las mezclas de agua y etanol varía mucho con la
composición).
Al elegir el modificador orgánico, se deben abordar consideraciones como el manejo y
la eliminación de solventes orgánicos a gran escala. La mayoría de las autoridades
imponen restricciones al uso de grandes cantidades (es decir, 10 L de etanol) de
disolventes orgánicos, y se requieren equipos y entornos a prueba de explosiones.
Además, debe eliminarse la evaporación u otros cambios espontáneos de la composición
de la fase móvil. Por lo tanto, actualmente se están investigando alternativas a los
solventes orgánicos para RPC a gran escala.
La concentración del modificador orgánico tiene un profundo impacto en la retención,
como se ve en la Figura 10.7. Para mantener el tiempo de separación dentro de límites
razonables, también en RPC, es común usar un cambio gradual de la composición de la
fase móvil para la elución. Un gradiente más superficial dará como resultado una
resolución más alta, como se ve en la ec. (10.24); sin embargo, a expensas del tiempo de
separación. Si los solutos difieren sustancialmente en la retención, la elución también se
puede lograr mediante elución por etapas, sin embargo, esto requiere un control estricto
de la composición de la fase móvil.
Eso es común a agregar a almacenamiento en búfer sustancia a la móvil fase a asegurar
que la los solutos se descargan durante la separación (para evitar posibles interacciones
iónicas que de otro modo arruinarían la separación). En una aplicación de RPC, el soluto
se mantiene deliberadamente a un pH en el que eso es cargado y un orgánico contraión es
adicional a la móvil fase. los sustancia disoluta y el contraión forma un ion par que es
absorbido en la estacionario fase. Con frecuencia El ácido trifluoroacético (TFA) se
utiliza para regular el pH de los soportes basados en sílice (es decir, para suprimir la
ionización de los grupos silanol) y el anión también formará un par de iones con proteínas
catiónicas. Para fines preparativos, esta técnica tiene un interés limitado ya que agrega un
paso de separación adicional (para eliminar el contraión) y el costo del agente de par
iónico puede ser prohibitivo.
Mesa 10.2
Propiedades de algunos disolventes orgánicos utilizados en la cromatografía

de fase inversa (RPC) de péptidos [9, 50]
Solvente Hidrofóbico fuerza Viscosidad (10 3

Nseg/m 2 , 20
C)
2-propanol Alto 2.3
acetonitrilo Medio 0.4
metanol Bajo 0.6

los cromatografía resina debería preferiblemente ser inerte hacia la componentes de la
fase móvil, de lo contrario, la matriz se hinchará y encogerá con cambios en la
composición de la fase móvil. cual mayo causa problemas con cama estabilidad. Ya que
la importante conduciendo fuerza en RPC es el efecto solvofóbico, las propiedades
superficiales de la resina de cromatografía también afectarán la retención. De este modo,
eso posee estado observó que la sílice columna vertebral influencias la retencion en RPC
[54]. También el comportamiento de retención entre diferentes tipos de matrices, es decir,
poli(estireno)-divinilbenceno y sílice, muestra que la columna vertebral posee a
pronunciado efecto en la características de retención de los solutos.
los partícula Talla de la material voluntad influencia la difusión distancias de la solutos
y por lo tanto a pequeña partícula Talla es favorable por a bajo zona ampliando A la alto
velocidades de fase móvil comúnmente usó en RPC la zona ampliando es dictado por la
C-término en la La ecuación de van Deemter (ecuación (10.10)) y el ancho del pico en la
elución isocrática aumentarán proporcionalmente al tamaño de la partícula dando una
reducción igual del factor de resolución. para gradiente elución la influencia de partícula
Talla es levemente reducido (adeudado a la afilado efecto) como se ve en la ec. (10.24).
los poro Talla y estructura de la material voluntad influencia la masa transporte de
solutos en cuanto a otro tipos de adsorbente cromatografía (p.ej ver discusión arriba por
CEI). Eso posee sido concluido que RPC de largo solutos tal como proteinas es mejor
transportado afuera con materiales de gran tamaño de poro, es decir, que tienen un
tamaño de poro nominal superior a 50 nm [55]. Se demostró que las resinas de
cromatografía de 400 El tamaño de poro nm produce una alta resolución de proteínas a
altas velocidades de flujo, mientras que 30 Nuevo Méjico poro Talla estaba óptimo por
péptido separaciones [56]. Sin embargo, la material fue usado por rápido análisis y la
impacto de pérdida en superficie área en capacidad en preparativo no se estudiaron las
purificaciones.
El tipo de ligando adherido a la matriz generalmente solo tiene una pequeña influencia
en la retención. de proteinas y péptidos [56]. Sin embargo, corto alifático cadenas de
cuatro a ocho longitud de los átomos de carbono (C4, C8) se recomiendan para la
separación de grandes solutos, es decir, proteínas, mientras que más extenso alifático
cadenas (C8, C18) son elegido por separación de menor macromoléculas, es decir
péptidos los razón fundamental detrás este recomendación es la disminuido recuperación
de proteinas señalado con más hidrofóbico ligandos (es decir más extenso carbón
cadenas) requiriendo mayor concentración de modificador orgánico para la elución.
También se puede observar que la densidad de ligandos de las resinas de fase reversa es
mucho más alta que la utilizada para HIC (ver más abajo). Por ejemplo, se eligió C4 en
una purificación a escala industrial de IGF-1 humano recombinante para maximizar la
recuperación del producto [57].
MUESTRA CARGA
los muestra volumen o concentración debería no afectar la resolución como largo como la
cantidad aplicada de muestra (incluido todos adsorbiendo especies) es bien abajo la
máximo capacidad de la sorbente los general regla usó en CEI de cargando menos que
30% de la máximo capacidad para retener la resolución debería ser válido además en
degradado elución RPC. Este medio que máximo _ proteína carga debería ser proporcional
a columna longitud, cual además posee estado señalado [54]. Las muestras demasiado
concentradas (p. ej., que tienen una alta viscosidad) pueden diluirse antes de la
aplicación. si la comenzando condiciones son a ser elegido asi que que todos material
voluntad ser adsorbido a la
cromatografía resina.
los contacto tiempo voluntad afectar la máximo muestra carga que mayo ser aplicado
antes de muestra aparece a la columna toma de corriente. Creciente la masa transporte
voluntad disminuir la residencia
tiempo necesario por completo adsorción de material en la cargando paso (es decir a no
ser que la cinética de equilibrio se convierte en un factor limitante).
La pérdida de material activo debido a adsorción irreversible, desnaturalización o
alteraciones de la conformación debe evaluarse en RPC.
10.3.4 Hidrofóbico Interacción cromatografía, HIC
La interacción hidrofóbica está mediada por la energía desfavorable necesaria para

mantener el hidrofóbico. molécula solvatado en la polar solvente. De este modo, la
moléculas son creía a ser forzado' afuera del solvente a una interacción con el ligando
hidrofóbico a alta fuerza iónica, bastante que activamente 'tirado afuera' de la móvil fase
por la ligando (p.ej como por CEI) [3], por eso la descripción solvofobia efectos, es decir
evitando la solvente. Aunque la principio básico es bastante simple la solvofobia efectos
son corrientemente no comprendido en detalle y, además, otros efectos, como las
interacciones electrostáticas, también afectarán la separación [58]. El papel de la
estructura del agua en las interacciones biológicas, que tiene una influencia decisiva en
HIC, posee estado revisados y la conclusión es que una debería Mira a cómo diferente las
condiciones afectan a las superficies que interactúan más que al disolvente [59]. Por lo
tanto, en cuanto a RPC el exacto retencion mecanismo es por debajo debate (p.ej ver
Lenhoff [60]) pero corrientemente la La teoría solvofóbica se utiliza con frecuencia para
relacionar las observaciones experimentales con la teoría.
La retención se logra mediante la adsorción de los solutos hidrofóbicos a una fuerza
iónica alta de la fase móvil (es decir, "salificación") y la desorción de los solutos
mediante la reducción de la fuerza iónica.
Retencion en HIC
los retencion factor es, en ausencia de electrostático efectos, dado por
[58]
(10.26)
k  k 0  10 ( mc ) Iniciar sesión k  Iniciar
sesión k 0  mc
donde m en este caso es un parámetro de hidrofobicidad (relacionado con el área de

contacto hidrofóbico y la incremento de tensión superficial molal de la sal), c la
concentración de sal y k 0 una característica sistema constante. los semejanza con la
expresión de la retencion factor en RPC es obvio, aunque la dependencia de c es inversa
debido a la diferente influencia de c en los dos casos ( cf. eq. (10.25)). Por lo tanto, el
factor de retención aumenta rápidamente con un aumento en fase móvil iónico fuerza y la
retencion factor mayo además ser esperado a ser influenciado por el área de interacción
del soluto (ie m ).
Zona ampliando en HIC

La aplicación de la zona de muestra se lleva a cabo con una fuerza iónica alta y, por lo
tanto, con una viscosidad de la fase móvil más alta que en, por ejemplo, exclusión por
tamaño o intercambio iónico. Esto puede dar como resultado un transporte de masa
menos eficiente y zonas de muestra más amplias, a menos que se compense con una tasa
de flujo reducida. Durante la elución, pueden esperarse efectos similares a los observados
para IEC y RPC (es decir, un tipo de ensanchamiento de exclusión por tamaño en la
elución isocrática y una agudización de la zona en la elución en gradiente).
Resolución en HIC
El mayor efecto sobre la resolución es, como para otras técnicas de adsorción, encontrado
para k 10 ( cf. Figura 10.1). El aumento de la longitud de la columna, L , tendrá un
efecto positivo en la resolución, al igual que la disminución de la altura de la placa , H.
La influencia de los parámetros experimentales en la resolución expresada por la ec.
(10.24) resultó ser válido también para la elución en gradiente lineal HIC de proteínas
[29].
Influencia de experimental parámetros en HIC

Los parámetros que afectarán la resolución incluyen las propiedades del soluto y de la
fase móvil y la longitud de la columna y la capacidad de carga como para otros modos de
adsorción. Puede notarse una gran influencia del ligando sobre las propiedades de
retención, en contraste con RPC.

Dado que la separación se basa en la capacidad de la fase estacionaria para interactuar
con los sitios hidrofóbicos de la molécula, se puede esperar que las partes cargadas de la
molécula disminuyan la interacción y, por lo tanto, la interacción sea mayor cerca de la
isoeléctrica. puntos. Sin embargo, este es no siempre la caso y retencion como a función
de pH es diferente para diferentes proteínas (es decir, debido a la proximidad de grupos
titulables e hidrófobos, ver Capítulo 9). Ya que la efecto es arbitrario, pH es no la primer
ministro variable a estudio (por ejemplo, a diferencia de la situación en IEC), pero de
todos modos debe mantenerse constante.

los iónico fuerza de la alimento solución necesidades a ser suficientemente alto en
ordenar a promover la adsorción del soluto, es decir, evitar la elución durante la etapa de
adsorción. Por otro lado, la fuerza iónica no debe causar la precipitación de la muestra o
los componentes de la muestra en la columna, ya que esto puede causar problemas de
desnaturalización, altas contrapresiones, etc. [61]. Normalmente entre 1 y 4 M de cloruro
de sodio o 0,75–2 M de amonio sulfato es necesario por la adsorción paso [61]. los
solución es tamponado a un pH adecuado utilizando una sustancia tampón diluida, por
ejemplo, 0,01 M. Se cree que el proceso de adsorción real es una reacción de múltiples
pasos donde el paso solvofóbico inicial es seguido por una reorientación limitante de la
velocidad de la proteína en el ligando para una interacción máxima. Dado que el paso de
adsorción se realiza en un entorno que promueve la agregación de proteínas, un tiempo de
residencia prolongado puede disminuir la cantidad de material activo recuperado.
El efecto solvofóbico de la fase móvil está relacionado con el contenido de sal
cosmotrópica que posee la propiedad de secundario la estructura de agua, y de este modo
aumentar la efecto hidrofóbico, o sal caotrópica que tiene la propiedad de alterar la
estructura del agua, y así disminuir el efecto hidrofóbico. Estas diferentes propiedades de
los electrolitos se notaron bien sobre a siglo atrás y la capacidad de sal a sal fuera
proteinas formado la base para la Hofmeister serie [62]. Este serie es dado en Mesa 10.3.
los específico influencia de sal en la estructura del agua puede ser bastante grande y de
los estudios de difracción de neutrones se concluyó que 4 METRO de sodio cloruro posee
un efecto en agua estructura correspondiente a una presión de 1.4 barra [63]. Se encontró
que el efecto de diferentes sales sigue la serie de Hofmeister. La influencia de diversas
sales sobre la retención en HIC se ha atribuido a su
Mesa 10.3
Hofmeister serie de creciente salazón propiedades de iones
anione
s 2 3
SCN yo Cl O NO hermano cl ARRULLO ASI QUE correos
4 3 4 4
cationes
ba 2 CA 2 magnesio 2 li cs N/A k Rb NUEVA HAMPSHIRE
4
diferente molal superficie tensión [58]. adsorbente eficacia posee estado señalado a
aumentar linealmente con la tensión superficial de las sales [64].
La desorción de solutos hidrofóbicos se logra aumentando su solubilidad en el móvil
fase. Este es logrado por reduciendo la iónico fuerza de la buffer o disminuyendo la
tensión superficial añadiendo etilenglicol o isopropanol a la fase móvil. También es
posible desplazar la proteína con detergentes, aunque el efecto es pequeño y el problema
de deshacerse de ellos después de la cromatografía ha desaconsejado su uso [65].
Ya que la mecanismo es impulsado por entropía nosotros haría suponer un aumentó
retencion con el aumento de la temperatura (haciendo que las moléculas de agua
desordenadas sean menos propensas a formar una capa alrededor la hidrofóbico
molécula). Nosotros haría además suponer a disminuido interacción en extremos de pH
ya que las moléculas estarán altamente cargadas. Sin embargo, experimentalmente se ha
observado lo contrario [66].
El gradiente en HIC es, como en otros modos de adsorción, una herramienta
importante para ajustar la resolución. Sin embargo, el tiempo de gradiente puede ser más
importante que para IEC debido a que se puede esperar que la cinética en HIC sea un
poco más lenta que para IEC. Esto se debe a que la interacción en HIC implica un
contacto directo entre soluto y sorbente, mientras que se cree que la interacción en IEC
tiene lugar a una distancia de aproximadamente 7 Å [58].
El caudal afectará al ensanchamiento de la zona de la misma manera que para la
exclusión por tamaño, es decir, según la ecuación de van Deemter. Sin embargo, se
obtendrá un efecto de nitidez de zona en la elución en gradiente, como se indica para
otros tipos de cromatografía de adsorción. Para HIC, la viscosidad del alto contenido de
sal y la cinética lenta aumentarán aún más la ampliación de la zona y, por lo tanto, es
común una ampliación de la zona más grande que la observada para IEC [58]. El caudal
también afectará el tiempo de contacto (y, por lo tanto, la capacidad utilizada).
PROPIEDADES DE LA CROMATOGRÁFICO RESINA

La influencia del tipo de ligando sobre la retención en HIC es grande. En general, la
retención aumenta con la longitud de la alquilo cadena y además con aumentó sustitución
nivel. El uso de ligandos de arilo agrega la posibilidad de interacción aromática a la
interacción hidrofóbica. Esto hace que la selección del ligando óptimo sea una cuestión
de prueba empírica, aunque se han dado ciertas pautas para la optimización [67]. Del
resultado de una prueba de un gran número de ligandos y sales se puede concluir que se
puede obtener selectividad por diferente combinaciones de mediador de hidrofobicidad
resinas y sales [68]. En principio, las combinaciones, ligando fuerte-sal débil (por
ejemplo, cloruro de fenil-sodio), medio ligando-medio sal (octil-sodio acetato) y
débil ligando-fuerte sal (por ejemplo butil-amonio sulfato) haría ser esperado a rendir
similar resultados con respeto a la selectividad. Sin embargo, la capacidad sería diferente.
los óptimo elección de ligando voluntad ser la la mayoría hidrofóbico una que da alto
recuperación de producto activo y con integridad estructural conservada. El nivel de
sustitución de las resinas por hidrofóbico cromatografía es apenas 35% de que de fase
inversa resinas [69]. Eso Se cree que esta baja cobertura superficial ayudará a preservar la
estructura conformacional. de biológico macromoléculas Despliegue de proteinas en HIC
y RPC posee estado ampliamente estudiado por Fernandez et al. [70, 71], lo que confirma
que las resinas cromatográficas de mayor hidrofobicidad, mayor concentración de sal o
tiempos de retención prolongados aumentarán el despliegue. Jennissen [72] discutido
selección de HIC resinas en términos de 'crítico hidrofobicidad' para encontrar una resina
óptima para una aplicación específica.
MUESTRA CARGA
El contenido de contaminantes competitivos en la muestra limitará la cantidad aplicable
para obtener la resolución necesaria. Por lo tanto, el contenido de un más hidrofóbico
soluto reduciría drásticamente la capacidad del producto (y también cambiaría la posición
de elución debido a los efectos de desplazamiento de la muestra). La capacidad utilizada
del adsorbente es directamente proporcional a la fuerza iónica del amortiguador inicial,
hasta el punto de precipitación (ver Figura 4.20).
El volumen de la muestra no será motivo de preocupación siempre que se cumplan las
condiciones para la adsorción total de la muestra. La cantidad de muestra aplicada vendrá
determinada por la capacidad máxima de la sorbente y la contenido de entrometido
solutos Como por otro tipos de adsorbente cromatografía la zona ampliando voluntad ser
afectado por alto muestra cargas principal a una ampliación de la zona cuando se supera
más del 30% de la capacidad máxima [8]. Si la muestra precipita en la columna, se debe
minimizar el tiempo del paso de adsorción, lo que impone restricciones en el tiempo de
aplicación de la muestra. Para reducir el riesgo de precipitación, se puede aplicar la
técnica de dilución de muestras en línea [67].
10.3.5 Afinidad cromatografía, C.A.
los separación principio en CA es la bioespecífico o específico del grupo Interacción

entre un ligando y el soluto (ver el Capítulo 4 para una discusión sobre los diferentes
tipos de ligandos de afinidad). Al seleccionar un ligando que muestre una alta
especificidad por el soluto objetivo, se puede lograr un alto grado de purificación en un
solo paso. Debido a la alta selectividad de La desorción AC del soluto puro se lleva a
cabo en la mayoría de los casos mediante elución por etapas después de lavar las
impurezas. Se ha revisado el uso de CA para la purificación a gran escala de proteínas
[73].
Retencion en C.A.
los adsorción y desorción proceso mayo simplemente ser descrito
por
k (10.27)
S (ac) L (s)  1  S L (s)
2
dónde S simboliza la sustancia disoluta y L la ligando, k 1 es la delantero y k 2 la tasa

hacia atrás constante. los asociación constante, k un k 1 / k 2 debería superar 10 5
28 1
10. Optimization of Chromatographic
METRO a rendir un
adsorción eficiente del soluto. A constantes de asociación más bajas (es decir, k A 10 4
millones 1 ) el soluto solo se retarda y puede eliminarse por lavado antes del paso de
desorción. La constante de disociación, k D , idealmente no debería ser menor que 10 11 M
ya que esto requerirá condiciones de elución muy duras. Las dos constantes están
interrelacionadas por k D 1/ k A . Por lo tanto, la constante de asociación debe estar en el
rango 10 5 –10 11 M 1 . Cuando se calculan las constantes de asociación o disociación,
debe tenerse en cuenta que las constantes de asociación determinadas para el ligando libre
pueden ser varios órdenes de magnitud mayores que las del ligando inmovilizado. Un
medio de afinidad con una constante de asociación de 10 6 METRO 1 se llama un
aglutinante micromolar y generalmente se considera un medio de buena afinidad. Un
aglutinante nanomolar, es decir, con una constante de asociación de 10 9 METRO 1 , es
adecuado para aplicaciones de barrido.
Zona ampliando en C.A.

Eso posee estado creía que la cinética de C.A. es Más lento que otro modos de adsorbente
técnicas de cromatografía debido a que la interacción requiere una orientación favorecida
de la molécula. Sin embargo, esto no ha sido probado experimentalmente y la conclusión
es que la molecular orientación cinética es no la limitador de velocidad factor por C.A.
resinas utilizados actualmente (la situación puede ser bastante diferente para otros
formatos, como las membranas de afinidad).
El tiempo de contacto debe ser lo suficientemente largo para hacer frente a la lenta
transferencia de masa de macromoléculas (es decir, como para otros modos de adsorción).
La desorción normalmente se realiza mediante un cambio gradual de la composición
del móvil. Se puede suponer que la fase y la ampliación de la zona son similares a las de
la exclusión por tamaño.
Resolución en C.A.
Ya que desorción es transportado afuera en a paso a paso manera la mayoría de la
componentes siendo absorbido se eluirá en un pico, a menos que las condiciones de
elución sean específicas. El término resolución como definido en ec. (10.1) posee no
sentido por paso a paso elución (es decir k es momentáneamente cambiaron desde a 0).
Influencia de experimental parámetros en C.A.

El parámetro más crítico en AC es la selección del ligando y las condiciones adecuadas
para la adsorción. y desorción Ya que C.A. es un encendido apagado técnica columna
dimensiones, caudal tasa, etc. están dictados por consideraciones de productividad en
lugar de desde el punto de vista de la pureza (es decir, la resolución).

Propiedades de la sustancia disoluta voluntad dictar la selección de ligando A propiedad
que es muy específico y además robusto (es decir no afectado por normal experimental
variaciones) es buscado. Ya que las resinas de afinidad son relativamente caras, el
contenido de solutos incrustantes (por ejemplo, lípidos) puede reducirse en un paso
previo.

La desorción en CA se logra aumentando la constante de disociación. Esto se puede
realizar variando el pH para cambiar la conformación o alterar la carga superficial del
10.4 26
soluto o la carga del ligando. Otra forma de desorber el soluto es mediante elución
competitiva en la que un agente competirá con el soluto o el ligando por los sitios de
afinidad. Esto introducirá un soluto contaminante que se eliminará mediante un paso
posterior, por ejemplo, exclusión por tamaño. Creciente la iónico fuerza, arriba a 1M
NaCl o la suma de A veces se puede necesitar sal caotrópica para desorber el soluto.
Desorción paso en inmovilizado metal C.A. implica reduciendo la pH, creciente la
fuerza iónica o pelar la metal ion por agregando EDTA o otro poderoso complejando
agente.
PROPIEDADES DE LA CROMATOGRÁFICO RESINA

Se facilita un rápido transporte de masa de solutos al ligando mediante el uso de resinas
de gran tamaño de poro. El transporte convectivo puede ser beneficioso para separaciones
rápidas en AC, sin embargo, se debe evaluar el equilibrio entre la capacidad disponible y
la velocidad. La orientación del ligando. influirá en la capacidad efectiva de la resina de
afinidad. Una concentración demasiado alta de ligando puede producir un impedimento
estérico (especialmente si el ligando es grande) y también un mayor grado de interacción
no específica.
MUESTRA CARGA
En cuanto a otros modos de adsorción, la capacidad aumenta con el aumento del tiempo
de residencia, como se muestra en la Figura 4.22. Esto ilustra que la transferencia de
masa es actualmente el paso limitante de la velocidad. por la adsorción de solutos a estas
tipos de cromatografía resinas los muestra la carga es solamente importante a débil
afinidad, dónde la columna voluntad Actuar como en un isocrático elución modo y la
normas dado por Talla exclusión mayo ser aplicado. los máximo aplicable muestra la
carga se determina mediante análisis frontal como se describe a continuación. Cabe
señalar que el grado de utilización de la resina de afinidad es bajo para los sistemas que
tienen una constante de asociación baja, como se muestra en la Figura 4.21 [74].
10.3.6 Otro modos de cromatografía
Este capítulo se ha dedicado a los modos de cromatografía para los cuales se ha

desarrollado una teoría sólida. estado establecido, y cual permitir predicciones de
separación comportamiento. Otro modos de cromatografía que se han propuesto para
purificaciones industriales y cuyo uso se basa en optimizaciones experimentales incluyen
hidroxiapatita y cromatografía multimodo resinas los último implica a a propósito
combinación de diferente superficie interacciones tales como enlaces iónicos,
hidrofóbicos y de hidrógeno que pueden resultar en propiedades de separación
interesantes. Sin embargo, la separación no es fácilmente predecible a partir de la teoría.
10.4 ADSORCIÓN
los más simple modelo por adsorción cromatografía asume que la sustancia disoluta, S ,
confinado en el acuoso fase (ac) es adsorbido a la ligando, L , de a sólido (s)
cromatografía superficie. El proceso es el expresado por la ec. (10.27), que por
conveniencia se da a continuación
26 10.k Optimization of Chromatographic
L(s)   S
1
S(aq) L(s)
2
10.4 26
los adsorción proceso es caracterizada por un asociación constante, k A , ( k A k 1 / k 2

dónde k 1 es la delantero y k 2 la hacia atrás Velocidad constante) y a disociación
constante, k re , ( k A 1/ k D ). La constante de asociación viene dada por
k un [ S *L ] *
*
[ S ][ L ] Cq* (10.28)
*
(q —q*
)
metro
dónde C * es la concentración de soluto en la fase móvil, es decir, C M y q * la

concentración de soluto adsorbido, es decir, C S , en el equilibrio y q m la capacidad
máxima (monocapa) del medio cromatográfico para el soluto. Cuando C S q m equiv.
(10.28) puede, con la ayuda de la relación K D C S / C M , para expresar la relación entre
el coeficiente de distribución y la constante de asociación y disociación a través de
1 KD
k
(10.29)
A k re q metro
De este modo, dos solutos tener idéntico retencion factores (y sintiendo la mismo fase
relación,
es decir tener similar KD ) _ mayo mostrar diferente máximo capacidad adeudado a
diferente constantes de asociación. Este voluntad Plomo a a situación dónde una sustancia
voluntad desplazar la otro si hay a competencia por la ligandos ecuación (10.29) aclara la
diferencia Entre afinidad y retención.
En CEI la sustancia disoluta es desplazando una o varios, n , contraiones, yo , y la
Interacción por un intercambiador de cationes puede, en el caso más simple, ser descrito
por
Sz z(I L) (S L) zI
(10.30)
(aq) (s) (s) (aq)
ecuación (10.30) se basa en el modelo estequiométrico simple para el equilibrio de

intercambio iónico [23, 24]. Una extensión de este modelo que explica los ligandos
protegidos estéricamente por la interacción solutos, la SMA modelo, estaba fundar a
adaptar experimental datos por no lineal CEI de proteinas [27]. los ecuación por la
asociación constante es levemente más Complicado para el caso de intercambio iónico
C yo z
S METRO
k un (10.31)
C METRO [ z ( q metro CS _ )]
z
Dado que el mecanismo de interacción en el intercambio iónico no implica la

interacción de la superficie (p. ej., como para la fase inversa), el modelo estequiométrico
ha sido cuestionado [25]. Sin embargo, para propósitos prácticos de optimizar el
intercambio de iones en purificaciones preparativas, el modelo estequiométrico se ha
encontrado útil. Por otro lado, es importante darse cuenta de que un ajuste aparente de los
datos experimentales a un modelo particular, en la mayoría de los casos, no proporciona
evidencia suficiente de que el modelo sea correcto, sino que simplemente sugiere su
aplicabilidad para el problema de separación en cuestión. La situación se complica aún
más por el hecho de que muchos modelos contener agrupado parámetros o
aproximaciones que impedir a estricto fisicoquimico
10.4 27
evaluación de la modelo. De este modo, eso es arriba a la usuario a validar la aplicabilidad

de la método para el propósito en cuestión.
10.4.1 Isotermas de adsorción
Reordenando la ec. (10.28) rendimientos el seguimiento relación Para el cantidad de

adsorbido sustancia disoluta
C M q metro C M q
C metro k un CM _kD (10.32)
S
C M k un 1
De ec. (10.32) eso mayo ser señalado que la concentración de adsorbido sustancia
disoluta es asintóticamente acercándose a la capacidad máxima del medio de
cromatografía y que esto se alcanzará a una concentración de soluto de fase móvil más
baja para solutos de constantes de asociación más altas, consulte la figura 10.8. La trama
de C S contra CM _ se llama isoterma de adsorción (la temperatura se mantiene constante).
La relación dada por la ec. (10.32) se conoce como isoterma de Langmuir. Esto es válido
para el caso simple de adsorción en monocapa de un solo soluto. en a cara a cara relación
con la ligandos (es decir z 1 en ec. (10.30)) cual es no afectado por la presencia de otro
solutos Este idealizado condición es no en general cumplido en preparativo purificaciones
dónde varios componentes competir por la adsorbente sitios y cuándo pueden esperarse
interacciones secundarias (p. ej., asociación de proteínas).
La adsorción en equilibrio de una mezcla de varios componentes puede representarse
en el caso simple mediante la isoterma de Langmuir de varios componentes
C M, yo k A, yo
C
q m, yo (10.33)
S, yo 1 k un, j
ME
C _ TR
O, j
60
50
40
30
CS
B kA (ml/g)
20 100
10
A
10
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
CM
_ (mg/ml)
Figura 10.8 Isotermas hipotéticas de adsorción de Langmuir para dos solutos de diferentes
constantes de asociación. A denota la superior rango por la 'lineal región' y B indica a no lineal parte
(es decir donde K D depende de C M ) de la isoterma.
10.4 27
Otro isotermas tener estado fundar útil por describiendo adsorción características tal
como interacciones Entre adsorbido moléculas (p.ej la Cazador de aves isoterma) y
adsorción a superficies heterogéneas (por ejemplo, la isoterma de Freundlich). Sin
embargo, aunque la isoterma de Langmuir es solamente válido por específico condiciones
(p.ej monocapa no competitivo adsorción) se ha aplicado con éxito como una primera
aproximación para describir la adsorción en la cromatografía preparativa de biomoléculas
[45, 74-77]. También se han observado y discutido las desviaciones de la isoterma de
Langmuir [78]. Una revisión de Bellot y Condoret [79] aborda los méritos relativos de los
diferentes tipos de isotermas y concluye que el modelo (competitivo) de adsorción de
Langmuir es uno de los más empleados en la literatura.
El modelo simple de Langmuir no es aplicable al intercambio iónico si queremos
considerar cada ligando como un sitio de unión separado (es decir, dado que un soluto
puede ocupar varios ligandos) y si nosotros desear a incluir la efecto de iónico fuerza
en la isoterma. A transformación de la isoterma de Langmuir propuesta por Antia y
Horvath [80] abordan esta situación. La concentración de la fase estacionaria no puede
derivarse explícitamente de la ec. (10.31) (igual que para la ecuación (10.32)) pero se
obtiene una expresión implícita que se puede resolver para valores dados de k A , z , q m y
CM . _ Chase y colaboradores [75] utilizaron un enfoque diferente, quienes consideraron
que el sitio de adsorción es el número de ligandos que ocupará una molécula y
descartaron el efecto de la fuerza iónica (es decir, que lleva a que q m variará con la
fuerza iónica). De esta manera, pudieron utilizar la isoterma de Langmuir simple para
modelar la adsorción de proteínas a los intercambiadores de iones.
Al compensar el número de ligandos, n , protegidos estéricamente por el soluto y
reemplazando z · q m con la capacidad iónica total Q v , se obtiene la relación para el
modelo SMA
C yo z yo
S, yo M
C z yo (10.34)
K A Qv_ 
M, yo
( z i,j  , yo
yo _ _ yo ) CS
 
 
El valor de CS para diferentes C M puede obtenerse, por ejemplo, mediante el ajuste de

curvas a experimentos datos [27]. A comparación de diferente isotermas por CEI mostró
que la SMA (ecuación (10.34)) dio una mejor concordancia con los datos experimentales
que la isoterma de Langmuir modificada o el modelo SDM básico (donde no se tiene en
cuenta el blindaje estérico) [27]. Sin embargo, la SMA modelo contiene a 'agrupado'
parámetro, es decir la estérico blindaje factor, n , que junto con la carga característica, z ,
se determina a partir del ajuste experimental (los otros modelos también contienen
parámetros ajustables similares).
La forma de la isoterma de Langmuir es convexa, como se muestra en la figura 10.8.
Este tipo de isoterma es común en líquido adsorbente cromatografía (aunque otro tipos de
las isotermas no son infrecuentes). La isoterma de Langmuir muestra tres regiones
distintas: una región lineal en concentraciones bajas de soluto, una región no lineal en
concentraciones altas de soluto y una región constante en concentraciones muy altas de
soluto. El coeficiente de distribución, K D , es igual a la Pendiente de la isoterma a ningún
fase móvil composición. De este modo, la el factor de retención variará con la
concentración de la muestra en la región no lineal de la isoterma ( cf. ecuación (10.3)).
Para maximizar el rendimiento, la mayor parte de la cromatografía preparativa se lleva a
cabo en la región no lineal; esto se llama cromatografía no lineal.
Lineal cromatografía
Trabajar a concentraciones en las que los solutos esencialmente no compiten conduce a
una condición en la que la cantidad de soluto adsorbido es proporcional a la
concentración de solutos en la fase móvil (región A en la figura 10.8). Esta condición se
denomina cromatografía lineal. Trabajar en esta región es favorable desde el punto de
vista de la resolución (debido a la menor cola) de picos) y además de a aumentar
proporcionalmente punto de vista (constante condiciones). Como pueden ser visto en la
figura 10.8, la región lineal se extiende a mayor C S para resinas de cromatografía de altas
capacidades máximas y resinas de afinidad con altas constantes de asociación. En
técnicas como la exclusión por tamaño no se produce adsorción y la concentración en la
fase estancada siempre es proporcional a la concentración en la fase móvil. Uno podría
esperar en SEC que la no linealidad resulte del hacinamiento en concentraciones muy
altas (es decir, debido a la interferencia estérica entre moléculas); sin embargo, el factor
limitante parece ser la inestabilidad hidrodinámica de las zonas de muestra altamente
concentradas que conduce a efectos de digitación viscosa.
no lineal cromatografía
En preparativo cromatografía máximo rendimiento es buscado. Este medio que la
mayoría separaciones son transportado afuera a alto fase móvil concentraciones en la no
lineal región de la isoterma de adsorción (parte B en la figura 10.8). De la figura se ve
que a medida que aumenta la concentración de la fase móvil (como en la parte ascendente
de un cromatograma) el cociente C S / C M disminuye Esto conduce a una disminución en
el factor de retención ( cf. eq. (10.3)) y dará como resultado un aumento en la velocidad
del soluto. Lo contrario es cierto cuando la concentración de la fase móvil disminuye los
efecto es que la ascendente parte voluntad ser más empinado que esperado y eso la
descendiendo parte voluntad mostrar pronunciado siguiendo, Hasta que la concentración
es asi que bajo que se alcanza la parte lineal de la isoterma. El efecto sobre la separación
diferirá dependiendo de si la elución se realiza isocráticamente o por gradiente. En la
elución isocrática, la ampliación de la zona y la distancia de elución entre los picos
variarán proporcionalmente a la longitud de la columna, lo que dará lugar a un "patrón de
separación proporcional". mientras que se obtiene un 'patrón de separación constante' en
la elución en gradiente, siempre que las condiciones sean suficientes para promover un
'estado casi estacionario' como se describe a continuación [8].
ISOCRÁTICO ELUCIÓN
La situación descrita anteriormente dará como resultado un pico que se deformará a
medida que la concentración de muestra es aumentó. Es más, la principal parte de la cima
voluntad obtener desplazado a tiempos de retención más cortos [2]. Por lo tanto, para la
separación isocrática de mezclas, existe un límite superior al volumen que se puede
aplicar antes de que las bandas comiencen a superponerse. Por otro lado, aumentar el
volumen de la muestra dará como resultado un aumento en la ampliación de la zona (p.
ej., en cuanto a la exclusión por tamaño, cf. eq. (10.19)). Knox y Pyper [43] revisaron la
situación en condiciones de elución isocrática sobrecargada y proporcionaron pautas para
maximizar el rendimiento. Se encontró que la influencia del volumen de la muestra es
más perjudicial para la resolución que la influencia de la concentración de la muestra. Se
concluyó que la sobrecarga de concentración proporciona un mayor rendimiento en la
cromatografía líquida preparativa isocrática. La elución isocrática suele aplicarse a la
separación de moléculas pequeñas, pero generalmente no a la purificación. de
10.4 27
macromoléculas (es decir adeudado a la dependencia de retencion factor en sustancia
disoluta Talla,
ver _ ecuaciones (10.23) y (10.25)). Este último tipo de sustancias se purifica

predominantemente mediante cromatografía de gradiente lineal o de elución por etapas.
ELUCIÓN EN GRADIENTE
En la elución en gradiente, las zonas se agudizan debido a la compresión causada por los
diferentes factores de retención en la parte anterior y posterior del pico (sensación
ligeramente diferente). concentraciones ent de la fase móvil del componente de elución).
Esto eventualmente conducirá a un 'estado cuasi-estacionario' donde los efectos de
dispersión y los efectos de compresión se equilibran entre sí para dar como resultado un
ancho de pico constante [8]. Los requisitos previos son una longitud de columna
suficiente y una pendiente de gradiente para promover el estado casi estacionario. Esto
dará como resultado un 'patrón de separación constante'. El efecto de agudización de zona
de la elución en gradiente permite cargas de muestra más altas que las aplicables para la
elución isocrática y hasta el 30 % de la capacidad máxima puede aplicarse antes de que
se noten condiciones de sobrecarga [8]. El factor determinante es la carga total y no se
observó preferencia por el volumen o la concentración de la muestra [29]. Sin embargo,
para las mezclas de proteínas, los efectos de sobrecarga (como se observa por las formas
de los picos no simétricos) se pueden observar para el componente de capacidad de
saturación más baja con cargas totales del 10 %, mientras que no se observaron efectos
significativos en las formas de los picos de los otros componentes, incluso con una carga
total superior al 30% [81].
10.5 ELUCIÓN MODOS
Ahí son básicamente Tres diferente maneras de desorbiendo vinculado soluto(s) de la

cromatografía resina, es decir usando la muestra como en frontal desarrollo, o a
compitiendo agente como en cromatografía de elución, o un agente de desplazamiento
como en la cromatografía de desplazamiento [2, 82].
10.5.1 Frontal cromatografía
En la cromatografía frontal, o revelado frontal, la muestra también se utiliza para la

elución. Por lo tanto, la alimentación de la muestra se aplica continuamente a la columna
y los componentes de la muestra se desplazarán entre sí en orden decreciente de afinidad
por el medio cromatográfico (esto se denomina autodesplazamiento de la muestra). El
soluto menos retenido se obtendrá en forma pura (es decir, sin los componentes más
fuertemente retenidos) hasta que los otros solutos se abran paso. Eventualmente, la
columna se saturará con el componente retenido más fuerte y el efluente tendrá la misma
composición que la alimentación. Así, incluso los más fuertes retenido componente mayo
ser obtenido después Lavado la columna y a etapa de desorción (consulte el
desplazamiento de la muestra a continuación).
10.5.2 elución cromatografía
En elución cromatografía la solutos son desorbido de la cromatografía medio debido a la

acción de a compitiendo agente en la eluyente los competencia es a reversible proceso
10.4 27
(como se indica en la ecuación (10.27)) y la concentración del agente competidor es un
parámetro clave
10.5 Elution 27
( cf . Figuras 10.6 y 10.7). La cromatografía de elución se puede realizar en tres

condiciones diferentes, es decir, k constante , un cambio continuo en k o un cambio
discontinuo en k . Manteniendo constante la composición (p. ej., fuerza iónica) del
tampón de elución, el factor de capacidad también se mantiene constante ( cf. ecuación
(10.23)). Esto se llama elución isocrática. La elución isocrática se usa principalmente
para la separación de moléculas pequeñas para las cuales la variación del factor de
retención con la composición de la fase móvil no es tan grande como para moléculas más
grandes. En la elución en gradiente, la composición de la fase móvil cambia
continuamente (p. ej., fuerza iónica aumentada como en IEC o fuerza iónica disminuida
como en HIC) con un cambio continuo en k como resultado. La elución en gradiente
puede ser necesaria para la separación de moléculas grandes para las cuales k difiere
demasiado para que la elución isocrática sea factible. Paso de elución donde la k es
cambió momentáneamente por discontinuamente traspuesta la fase móvil composición se
puede utilizar para desorber componentes de diferencias extremas en k y se usa
comúnmente en procesos de fabricación debido a su mayor robustez en comparación con
la elución en gradiente.
10.5.3 Desplazamiento cromatografía
Si la afinidad de la compitiendo agente por la cromatografía resina es mucho más alto que
la de la sustancia disoluta después la sustancia disoluta voluntad ser efectivamente
desplazado por la agente. Este voluntad tomar lugar incluso aunque la concentración de la
agente, o desplazador, es bajo, en contraste a elución cromatografía [83, 84]. Este es
básicamente un proceso no reversible en condiciones normales. La cromatografía de
desplazamiento tiene la ventaja de poder concentrar muestras. La concentración de una
zona de muestra desplazada es una función de la concentración inicial de la desplazador,
y la formas de la isotermas de la componente y la desplazador De este modo la
concentración de desplazador proporciona a conveniente camino de regulando la
concentración de el eluido componente. los técnica proporciona autoafilable de la
sustancia disoluta zonas (es decir la la cola observada en el modo de elución no lineal es
contrarrestada por el soluto desplazante adyacente). La cromatografía de desplazamiento
solo se puede realizar en condiciones en las que las isotermas de los diferentes solutos no
se cruzan [85]. La cromatografía de desplazamiento puede llevarse a cabo usando
relativamente barato equipo (p.ej como usó por elución escalonada cromatografía). Sin
embargo, ya que muestra zonas son no espaciado por buffer a medio de detector la se
necesita el componente de interés. Aunque los límites entre las zonas pueden ser nítidos,
aún pueden mostrar cierta superposición, lo que resultará en la necesidad de sacrificar el
rendimiento para obtener la pureza requerida. La necesidad potencial de eliminar el
desplazador contaminante también ha obstaculizado la utilización de la cromatografía de
desplazamiento para purificaciones a gran escala. Sin embargo, actualmente hay un gran
progreso en el desarrollo de desplazadores (p. ej., que tienen una masa molecular baja) y
cromatografía de desplazamiento para purificaciones preparativas utilizando diferentes
modos de cromatografía [86–88].
10.5.4 Muestra desplazamiento
En el modo de sobrecarga, se utiliza la capacidad máxima de la resina de cromatografía.

Esto se puede lograr mediante una combinación de cromatografía frontal para la carga de
la muestra, seguida por a lavar a eluir no vinculado solutos y desorbiendo la muestra
por elución o
10.5 Elution 27
cromatografía de desplazamiento [89-91]. El paso de carga de la muestra se ha

denominado "desplazamiento de la muestra"; sin embargo, según la terminología de
Karger et al. [2], esto debería llamarse más bien desarrollo frontal. Las moléculas de la
muestra están compitiendo efectivamente para los pasos de adsorción que conducen a un
'tren de desplazamiento' siendo desarrollado dentro de la columna. Luego, los solutos se
pueden desorber usando un desplazador fuerte o una cromatografía de elución
convencional.
Freitag y Horváth [85] revisaron las ventajas de los diferentes modos de elución para la
cromatografía de proceso.
10.6 CAMA CONFIGURACIÓN
Configuraciones de lecho desarrolladas para cromatografía analítica (p. ej., en capa, como
en la cromatografía en capa fina o la cromatografía en papel, columnas empaquetadas o
capilares de gran longitud) mayo ser usó por en pequeña escala preparativo trabajar. Sin
embargo, demandas de alto el rendimiento, o la aplicación directa de alimentación que
contiene partículas, o la necesidad de una operación continua hace otro configuraciones
tal como lleno camas, fluidizado camas o Moviente camas más adecuado para
cromatografía de proceso.
10.6.1 Lleno camas
Una escala lineal de separaciones de columnas analíticas ordinarias ha proporcionado

soluciones adecuadas además por proceso cromatografía los pedir por alto rendimiento
posee estado lograda mediante el diseño de columnas de gran diámetro (por ejemplo,
columnas de acero que tienen 1,2 m de diámetro ahora son artículos estándar, consulte el
Capítulo 11). Mejoras en el manejo de estas columnas grandes (por ejemplo,
empaquetado automático, vaciado de columnas, adaptadores ajustables hidráulicamente,
etc.) facilitan su uso. La popularidad del uso de lechos empaquetados se puede atribuir a
la aplicabilidad de la teoría cromatográfica establecida y la escalabilidad de los resultados
obtenidos a escala de laboratorio. Además, un tubo empacado es un formato conveniente
para manejar la resina cromatográfica y las posibles sustancias tóxicas en la alimentación.
Sin embargo, existen ciertas limitaciones a esta configuración, que se abordan en los
formatos a continuación.
10.6.2 fluidizado camas
En un lecho fluidizado, la resina cromatográfica se mantiene suspendida mientras la

alimentación de crudo se bombea a través del lecho. Puede visualizarse como un lecho
empacado, al que se le permite expandirse adeudado a hacia arriba caudal de la móvil
fase. Este permisos solutos a ser adsorbido mientras que las partículas, como restos
celulares o células enteras, pasan sin retardo a través del lecho expandido. La técnica se
ha vuelto popular ya que combina varios pasos en la purificación temprana, como la
captura inicial del soluto objetivo, la eliminación de partículas e incluso la purificación
inicial, siempre que se pueda emplear una resina cromatográfica selectiva [92].
A requisito previo por la cama a ser fluidizado es que la densidad de la cromatográfico
la resina es lo suficientemente grande como para permitir que la sedimentación
gravitacional equilibre las fuerzas de arrastre de elevación del eluyente que fluye hacia
arriba. Esto significa que hay una ventana de flujo donde la resina puede ser
10.6 Bed 27
usó (es decir a también bajo caudal allá voluntad ser no expansión y a también alto caudal
todos las resinas de cromatografía se eluirán de la columna). Se pueden incorporar
aleaciones de cuarzo o de metal en perlas de polímero para aumentar la densidad de la
resina de cromatografía (para permitir el uso de velocidades de flujo más altas). Otros dos
parámetros importantes son el rango de densidad y la distribución del tamaño de las
partículas de las perlas, que, si se eligen correctamente, crearán un lecho estable de buena
cromatografía. actuación, en contraste a tradicional fluidizado camas dónde la el
rendimiento es bajo debido a un alto grado de retromezclado [92]. El grado de expansión,
expresado como el cama altura de un expandido cama sobre la cama altura de a
establecido cama, de 3–4 (correspondiente apenas a a vacío fracción de 0.8) posee
probado a rendir bueno adsorbente propiedades mientras proporciona suficiente espacio
para que las partículas pasen a través del lecho [93]. Ensuciamiento de la cama, es decir,
no deseado adsorción de célula escombros, etc., a la partículas mayo Plomo a colapsar de
la cama estable. El riesgo de ensuciamiento diferirá entre los sistemas de cultivo celular
y, aunque se encontró que el lecho expandido era adecuado para los sistemas de levadura,
se informaron dificultades para los sistemas CHO.
Después del paso de adsorción o captura, el lecho se lava y el soluto objetivo se
desorbe, ya sea directamente en un hacia arriba modo o en a hacia abajo modo después la
cama posee estado establecido. El último procedimiento reducirá los volúmenes de
tampón y fracciones.
10.6.3 Camas móviles
En la cromatografía de lecho empacado o de lecho expandido, el lecho se fija mientras el

eluyente se transporta. la muestra componentes En a Moviente cama la cromatografía
medio es además movido y usó por transportando muestra componentes los movimienot
mayo ser perpendicular a el eluyente como en la cromatografía anular continua o en la
dirección opuesta del eluyente (es decir, contracorriente) como en un lecho móvil
simulado (SMB).
En la cromatografía anular continua, el lecho se gira mientras la muestra se aplica
continuamente. La elución lleva los solutos por la columna pero la posición radial de la
entrada aumentará con la afinidad con el medio cromatográfico. El soluto de interés se
puede muestrear continuamente desde el fondo de la columna. Se ha presentado un
modelo para predecir la separación de proteínas con cromatografía anular continua [94].
En un lecho móvil verdadero (TMB), la muestra se agrega en el medio del lecho y los
solutos fuertemente retenidos se transportarán con el lecho, mientras que los solutos
menos retenidos se transportarán. transportado con la eluyente En este camino binario
mezclas mayo ser apartado en a continuo Moda (o complejo mezclas apartado en dos
fracciones). A TMB es difícil a darse cuenta en práctica pero por usando a número de
columnas (p.ej cuatro) de idéntico propiedades a PYME se puede crear donde se inserta
una nueva columna en la parte inferior del tren de columnas y la superior columna es
remoto, desorbido y regenerado a ser insertado a la abajo de el tren de columnas en el
siguiente ciclo. Las ventajas de usar un lecho móvil son la operación continua o
semicontinua (es decir, la aplicación de la muestra y la recolección del producto) y el alto
grado de utilización de la capacidad de la resina de cromatografía, que son características
para la adsorción en contracorriente [95]. Las desventajas son que los componentes
complejos de la muestra no poder ser resuelto (es decir solamente a binario separación
mayo ser logrado por cada 'tren columna'; sin embargo, se pueden unir varios trenes para
resolver mezclas) y costoso
10.6 Bed 27
equipo es necesario (p.ej válvula sistema). En a comparación Entre lleno cama y SMB
para la purificación de trans -fitol a partir de cis -fitol se encontró que la productividad de
ocho columnas empaquetadas con 25 m corrida con resina de cromatografía en modo
SMB fue aproximadamente igual a la de un sistema de cromatografía líquida común que
corrió una columna llena de 15 metro cromatografía resina [96]. los PYME sistema
estaba reportado a ser menos sensible a a disminuir en columna eficiencia comparado a
tradicional columna cromatografía A sistema de tres columnas menos complejo para la
producción continua de hIgG por proteína contracorriente periódica Lacki [97] presentó
recientemente una cromatografía. La tasa de producción (g/h) se incrementó en un 35 %
en comparación con un sistema tradicional de lecho fijo.
los sistema configuración por correr a continuo operación mayo ser hecha simple,
p.ej como la sistema descrito por Lacki, o más complejo, p.ej la sistema por PYME
descrito por Mazzotti et al. [97, 98]. El sistema de Mazzotti et al. tuvo la mejora
necesaria de incorporar un paso CIP como parte de la aplicación SMB de purificación de
plásmidos.
10.7 EXPERIMENTAL DETERMINACIÓN DE BÁSICO PARÁMETROS
Para evaluar el rendimiento del sistema cromatográfico o evaluar parámetros por

optimizaciones de separaciones usando ecuaciones (10.1)–(10.34) la cálculo de retención,
ampliación de zona, resolución, parámetros de transporte de masa y capacidad de soluto
de los experimentos es necesario. Muchos de estas son solamente válido por isocrático
elución, Yamamoto y Snyder et al. han abordado los parámetros de retención en la
elución en gradiente [8, 99].
10.7.1 Retencion
El factor de retención, k , se puede calcular a partir del volumen de retención, V R , y el

volumen de la fase móvil, V M , reorganizando la ec. (10.4) a
VR _ VM _
k VM _ (10.35)
Esta relación es válida solo para elución isocrática donde k es constante a lo largo de la
corrida. En la elución en gradiente, el factor de retención calculado a partir del volumen
de retención no tendrá ningún significado fisicoquímico [3]. Sin embargo, es útil como
parámetro de retención que se mantenga constante durante el escalado, siempre que el
volumen de gradiente y el volumen de permanencia se mantengan constantes.
Retencion volumen, VR _
El volumen de retención, o elución, viene dado por el volumen suministrado por la(s)
bomba(s) desde el tiempo cuando mitad la muestra masa es aplicado a la columna a
la tiempo cuando la mitad de la masa de la muestra se eluye de la columna. En la
práctica, se realizan varias simplificaciones en la cálculo de la retencion volumen. los
contribución de la muerto volúmenes en tubos o tubería de la inyector a la columna y de
la columna a la detector es con frecuencia
10.7 Experimental Determination of Basic 27
1.25
1
N = 5.54 (VR/wh)2 HETP = L/N
Respon
0.75
0.5 wh
0.25
0
VR Retention volume VR
Figura 10.9 Cálculo de retención y eficiencia de columna a partir de un cromatograma. La figura

de la izquierda ilustra una forma gaussiana perfecta, la figura de la derecha ilustra el cálculo del
volumen de retención y el pico ancho de a sesgado cima es no directo y requiere la usar de ec.
(10.37) y análisis de los momentos estadísticos de la distribución. Una estimación del ancho del
pico, w b , viene dada por w , calculada a partir de la intersección de las tangentes con la línea de
base.
ignorado La contribución del volumen de la muestra al volumen de retención en la

elución isocrática mayo ser ignorado si la muestra volumen es pequeña. los retencion
volumen es con frecuencia determinado a partir del vértice del pico, suponiendo una
forma simétrica del pico. En tales casos, el volumen de retención se calcula como se
muestra en la Figura 10.9.
Sin embargo, si no se puede ignorar el volumen de la muestra, el tiempo de aplicación
de la muestra se establece cuando se ha inyectado la mitad del volumen de la muestra. Si
los datos se van a utilizar para la ampliación entre sistemas, la influencia de la sistema
muerto volúmenes, V ext , en la aparente factor de retención, k aplicación deber ser estimado.
Eso es a simple ejercicio a mostrar que la sistema muerto Los volúmenes influirán en el
factor de retención medido de acuerdo con
k
k (10.36)
aplicación
1 ( V m)
Vext _
De este modo, acuerdo V exterior / VM _ o pequeña o constante voluntad dar un aparente

retencion factor que es escalable.
Si la carga de la muestra u otros efectos hacen que el pico eluido no sea simétrico, el
volumen de retención no se puede estimar a partir del vértice del pico. En este caso el
volumen de retención se iguala al centro de masa que se obtiene del primer momento
estadístico de la distribución de la concentración, C , frente al volumen, V ,

n
CV
 C iV i V
dV
VR _ V 0 i 1 (10.37)
n
 C  C yo V
V 0 dV i 1
los mano derecha lado de ec. (10.37) es útil por cálculo de retencion volúmenes de no
simétrico distribuciones por simple untado hojas o a mano (es decir de la cima altura
a diferente elución volúmenes). Eso mayo ser observó que la denominador en ec. (10.37)
es igual al área del pico y es la cantidad de soluto eluido.
Fase móvil volumen, VM _

El volumen de la fase móvil no es constante sino dependiente del soluto. Es el volumen
de elución del soluto en condiciones de no retención (en este caso parece inexacto hablar
de retención volumen por qué elución volumen es privilegiado). En la separación de
pequeña moléculas por RPC este volumen es con frecuencia establecer igual a la total
líquido volumen de la columna y acuñado V 0 . Sin embargo, se desaconseja esta
designación ya que V 0 está reservado para el volumen intersticial de un lecho empacado
[1]. Los símbolos y definiciones para la cromatografía líquida se revisan en el Apéndice
A. La determinación del volumen de elución en condiciones no retenidas se realiza como
descrito por la retencion volumen. Eso es algunas veces necesario a variar la condiciones
para asegurar que se cumplan las condiciones de no retención (p. ej., funcionamiento a
varias fuerzas iónicas). Sin embargo, se debe considerar el riesgo de mecanismos de
retención secundarios (p. ej., interacción hidrofóbica a alta fuerza iónica). La dificultad de
obtener valores correctos de VM ha sido abordado [100, 101]. Es común establecer
arbitrariamente la fase móvil volumen igual a la descubrimiento de la solvente frente. Sin
embargo, este voluntad no corresponden al valor termodinámicamente correcto del
volumen de la fase móvil para el soluto de interés.
Fase móvil composición a elución

La composición de la fase móvil a la que se eluye un soluto en IEC, por ejemplo, la
fuerza iónica de elución I R , se puede calcular a partir del volumen de retención de
acuerdo con
yo yo (V V termino _ (10.38)
)
empiezo _
Inicio R Inicio R
gradiente en v
dónde empiezo _ y termino _ son, respectivamente, la iónico fuerza a la comienzo y la

final de la degradado, gradiente en v la degradado volumen y V comienzo la volumen bombeado
mediante la sistema de la inyección punto a la tiempo cuando la comienzo de la
degradado golpes la columna. Eso deber ser Note que este tiempo voluntad variar
adeudado a la muerto volúmenes de la columna a la mezclador formando el gradiente y
desde el mezclador hasta las bombas que entregan los tampones de alta y baja fuerza
iónica. Este mayo ser importante en aumentar proporcionalmente dónde diferente sistema
configuraciones son probable que se utilice. El término último en eq. (10.38) se llama
pendiente del gradiente y se denota como g .
El cálculo de la composición de la fase móvil para otras técnicas, por ejemplo, %B
para elución en RPC, es análogo al ejemplo con intercambio iónico dado en la ec.
(10.38).
10.7.2 Zona ampliando
Cima ancho y lámina número

El ensanchamiento de la zona de la muestra, ya sea en función de la dispersión provocada
por las cámaras de mezcla fuera de la columna o el transporte de fluidos en la columna, o
por la dispersión molecular.
difusión, puede determinarse a partir del ancho de un pulso inyectado (ver Figura 10.9).
Previsto la resultante cima posee a gaussiano forma la base ancho de la cima, wb , _
expresado como cuatro veces la desviación estándar, , se puede calcular a partir de
w 4w _ 2 (10.39)
bh ln 2 _
dónde ¿Qué ? es la cima ancho a mitad cima altura. Ya que ¿Qué ? es justamente fácil a
determinar gráficamente ec. (10.39) es frecuentemente usó por cálculo de la
cima ancho. Insertando la ec. (10.39) en la ec. (10.9) produce la siguiente relación para
el número de placas por columna, N , en elución isocrática
V 2 V 2
norte 8 en 2 R 5.545 R
(10.40)
 ¿Qué ?  
¿Qué
?
ecuación (10.39) no poder ser usó si la cima es no gaussiano y la estándar desviación de

entonces el pico debe determinarse a partir del segundo momento de la distribución
 n
C ( V  VR _ )
 CV 2 Ci _ ∙V
2
dV dV V 2 R
2 V 0 V 0
V 2 i 1
V (10.41)
2
R R
n
 C  C dV  C yo V
V 0 dV V 0 i 1
Residencia tiempo distribución, RDT

Para sistemas de largo zona ampliando (p.ej fluído camas) la dispersión se convierte asi
que grande que medición de la ampliando de un inyectado legumbres mayo rendir largo
errores y por lo tanto, se necesita otro método. Un enfoque general para los cálculos de
retención y ampliación de zona en simple caudal sistemas es previsto por la residencia
tiempo teoría [102]. los La función de distribución del tiempo de residencia, F ( t ), está
dada por la probabilidad de que un soluto tenga un tiempo de residencia menor que el
tiempo t . La forma de esta función es igual a una función de paso positivo, consulte la
figura 10.10. La función de lavado se define como W ( t ) 1 F ( t ) y la densidad función
es dado por dF / dt . los significar residencia tiempo y la segundo momento de la
distribución viene dada por ecuaciones análogas a las ecs. (10.37) y (10.41) con volumen
transformado en tiempo a través de t V / F donde F es el caudal volumétrico. Los
momentos estadísticos también se pueden determinar a partir de la función de lavado
mediante
norte n  tn _ 1W _ ( t ) dt
0 (10.42)
Residencia tiempo distribución función, Lavado función, W(t)

F(t)
1.0
1.0
Concentrati
Concentrati
0.5 0.5
0.0 0.0
Figura 10.10 Distribución del tiempo de residencia función (izquierda curva) y lavado función
(Correcto curva).
dónde 1 es el primer momento (es decir, el tiempo de retención) y 2 es el segundo

momento (es decir 2 en unidades de tiempo). El tiempo 0 es, por supuesto, el momento
en que se inicia el lavado. Siempre que la distribución siga la distribución de frecuencia
normal, la función de lavado normalizado puede usarse para estimar el tiempo medio de
residencia de t correspondiente a W ( t ) 0.5 y la estándar desviación de ( t 1 t 2 )/2 dónde
W ( t 1 ) 0.8413 y W ( t 2 ) (1 0,8413). Esto se da a partir de la función de distribución
acumulativa, y se pueden elegir otros valores de W ( t ) y relacionado a la estándar
desviación de t de a contabilizado datos por la acumulativo estandarizado normal
distribución. Estimación la estándar distribución de varios puntos en la función de lavado
brinda la posibilidad de confirmar que la suposición de una distribución de frecuencia
normal es correcta.
Se revisó el uso del análisis de distribución del tiempo de residencia para caracterizar
la mezcla de líquidos en biorreactores de lecho empacado [103]. Los autores señalaron
los problemas para obtener estimaciones correctas de los parámetros de los picos de
colas. Recomendaron que los datos experimentales se ajustaran a la función utilizada (es
decir, función de lavado, función de distribución o función de densidad) mediante una
técnica de ajuste de curva de mínimos cuadrados para evitar un alto impacto erróneo de la
parte de relaves. Además, la calidad del ajuste a los datos experimentales proporciona
información sobre la aplicabilidad del análisis de distribución del tiempo de residencia al
sistema por debajo estudiar. Eso estaba mostrado que diferente métodos por medición y
calculando el zona ampliando de proceso columnas mayo rendir muy diferente resultados
[104]. los No se encontró la razón de esto, y se sugirió que diferentes procedimientos de
prueba serían óptimos para caracterizar la ampliación de la zona para diferentes tipos de
procesos.
Buque dispersión número

los zona ampliando mayo ser relacionado a diferente fuentes, p.ej la términos en la
camioneta Ecuación de Deemter, como se describió anteriormente para columnas
empacadas. Para recipientes y lechos no empacados, por ejemplo, lechos expandidos de
perlas no porosas, el ensanchamiento de la zona a menudo se caracteriza por un
parámetro llamado número de dispersión del recipiente dado por el número de Peclet
inverso, Pe , como
2
1 D 1 
A (10.43)
PE UL 2  VR _ 
En analogía con dispersión en cromatografía eso es visto que la axial dispersión

coeficiente, DA , _ corresponde a la Término B en la camioneta Deemter ecuación ( cf. _
ec. (10.10)), es decir En estos sistemas se desprecian la dispersión por remolinos y la
resistencia a la transferencia de masa. Obviamente, esto no es correcto para la dispersión
cromatográfica en recipientes que contienen resinas cromatográficas porosas.
10.7.3 Resolución
los resolución factor es calculado de la retencion volúmenes y cima anchos determinado

como descrito arriba y con la ayuda de ec. (10.1). los efecto en resolución factor en la
recuperación con una pureza predefinida se ilustra en la figura 4.4.
10.7.4 Masa transferir
Masa transferir coeficientes mayo ser estimado de adecuado experimental datos a diferente
modelos _ (p.ej la restringido difusión en poroso cromatografía resinas mayo ser
calculado de un ajuste de la ecuación de van Deemter a los datos experimentales). Sin
embargo, a menos que el modelo utilizado esté calificado a a priori la resultado pueden
solamente ser considerado como tentativo. Modelado de purificaciones cromatográficas es
discutido en la Siguiente sección. los cinética de masa transferir voluntad tener a efecto
directo en la Procesando Velocidad, es decir caudal Velocidad que es aplicable. los masa
transferir mayo ser estudiado por análisis de avance a diferentes caudales. Esto se hace
aplicando un paso que contiene la sustancia disoluta (o correcto alimento mezcla, previsto
la sustancia disoluta de interés mayo ser detectado selectivamente) y observando la
respuesta después la columna (es decir muy similar a a residencia distribución del tiempo
análisis). Descubrimiento análisis es además usó por la determinación de la A
continuación se proporciona la capacidad máxima de un medio cromatográfico y un
procedimiento detallado.
10.7.5 Capacidad
La capacidad máxima del medio cromatográfico para el soluto es un factor muy

importante en la cromatografía de proceso ya que influirá directamente en la
productividad. El maximo capacidad, q m , es necesario por la cálculo de la adsorción
isotermas ( cf. ecuación (10.32)). En algunos modelos (p. ej., el modelo SMA) se utiliza
la capacidad iónica total de un intercambiador de iones y, por lo tanto, es necesario
determinarla.
capacidad iónica
La capacidad iónica se determina saturando los grupos iónicos con un contraión adecuado
(p. ej., uno que sea fácil de analizar), lavando el exceso de contraión, desorbiendo el
contraión y determinando la cantidad. A veces, los dos pasos se pueden realizar
simultáneamente, como se muestra en la tabla 10.4.
Sustancia disoluta capacidad

La capacidad de una biomolécula siempre será menor que la capacidad iónica. Esto se
debe al hecho de que la biomolécula ocupará una superficie mayor que los pequeños
contraiones.
Mesa 10.4
Sistemas de ensayo para la determinación de la

capacidad iónica Tipo de desorbedor de contraiones del
intercambiador ensayo de iones
Catión intercambiador H (1M HCl) K (1M KNO 3 ) Potenciométrico valoración de H

Intercambiador de aniones Cl (1 METRO NaCl) NO (1 METRO KNO ) Ag
valoración de cl
3 3
La capacidad de soluto se puede obtener en experimentos por lotes o con una columna de
relleno [74]. La capacidad obtenida en los experimentos por lotes (capacidad estática)
suele ser mayor que la que se obtiene al dejar pasar la solución a través de un lecho
empacado (capacidad dinámica) debido a que la capacidad es más corta. contacto tiempo
en la último caso. Eso pueden ser señalado que este 'saturación capacidad' mayo ser de 6
a 16 veces mayor que la carga donde los efectos sobre la resolución entre los picos de
proteínas pueden ser observado [105]. Es más, la actual capacidad por a componente en a
mezcla a menudo será más pequeño que el de un componente puro debido a la
competencia con otras especies adsorbidas de la mezcla.
DETERMINACIÓN DE DESCUBRIMIENTO CAPACIDAD

La capacidad de penetración se define como la cantidad de soluto absorbida por la
columna en el punto cuando solutos son primero detectado en la efluente [1]. Este es
esquemáticamente ilustrado en la Figura 10.11. Dado que la determinación es tan
importante, se dará aquí un procedimiento sugerido.
1. Bombee una solución que contenga una cantidad apropiada de soluto adecuado a
través de la celda del detector para determinar el nivel de meseta de la concentración
inicial, C 0 . Calcule el 5% de este nivel (o cualquier nivel deseado; aquí se
recomienda el 5% y se utilizará a lo largo de esta descripción).
Nota : Hacer Por supuesto la detector respuesta es lineal sobre la entero rango. los
sustancia disoluta debería ser disuelto en a solución que promueve adsorción a la
cromatografía medio.
2. Inserte la columna en el sistema y bombee la solución de muestra a través de la
columna mientras rastrea continuamente la concentración, C , del soluto en el
efluente. Comience a recolectar el efluente en un recipiente en la aplicación de la
muestra (consulte la nota del paso 5).
3. Cuando la concentración de la efluente posee alcanzó 5% de la inicial concentración,
es decir C / C 0 0.05, luego deje de aplicar la muestra. El volumen recolectado
hasta ahora se denota como VA _ y la concentración de sustancia disoluta es denotado
como CA. _ _ comienzo bombeo a lavar solución a través la columna tiempo
coleccionar la efluente en a nuevo envase. Lavar la columna
por a menos dos volúmenes de columna. El volumen recogido durante este paso se
denota como
VB _ y la concentración de soluto se denota como C B .
Nota : los lavar solución debería ser de la mismo composición como la solución por
dis-
disolver la muestra para evitar la desorbición del soluto unido en un lavado excesivo.
La concentración de proteína puede determinarse por absorbancia a 280 nm
utilizando una curva de calibración. Una asignación adecuada del nivel del 5 %
requiere una señal de referencia estable; por lo tanto, se debe ignorar un cambio en la
línea de base y establecer un nuevo nivel de línea de base.
4. Cambie de recipiente y comience a desorber el soluto con un tampón desorbedor
adecuado. Seguir la paso por continuamente rastreo la concentración de la sustancia
disoluta en la efluente.
Co
C/Co = 0,95
C/Co = 0,50
Relative
C/Co = 0,05
C/Co = 0,01
0.00
Volumen
(ml)
Figura 10.11 Determinación de la capacidad de penetración. Curva izquierda; avance en ausencia

de columna (a determinar la sistema muerto volumen). Derecha curva; descubrimiento de sustancia
disoluta (Nota la menor pendiente de la curva en este caso causada por efectos de transferencia de
masa).
Después de que la concentración haya alcanzado el nivel de referencia, continúe

eluyendo la columna durante una más columna volumen. los volumen recogido
durante la desorción paso es denotado como V D . y la concentración se denota como
C D.
5. los descubrimiento capacidad (mg/ml cromatografía medio) es calculado a partir de:
[ V AC 0 V AC A V BC B] [ V AC 0 V BC B]
q segundo, 5%
Vcc V_
dónde V c es el geométrico volumen de la columna de la cromatografía cama mediana .

Nota : En la mayoría casos CA _ es despreciable como comparado a C 0 . En este
caso allá es no necesita recoger el volumen V A ya que puede determinarse a partir
del caudal, siempre que se utilice una bomba de alta precisión. Es importante que
todo el volumen del aplicador de muestras a la columna es barrido, o muerto
volúmenes contabilizado por, especialmente por lechos pequeños y/o resinas
cromatográficas de baja capacidad.
los recuperación de sustancia disoluta

es dado por:
100 V DC
Recuperación( D
%) [ VA _ ( C 0 CA _ )
V BC B]
Si la recuperación es inferior al 100 %, es interesante comprobar que el soluto restante

se puede eliminar del medio de cromatografía. Esto se realiza de la misma manera que el
paso 4 excepto que se utiliza una solución de regeneración en lugar del tampón de
desorbición. El volumen (al menos dos volúmenes de columna) se denota como V F y la
concentración de soluto C F . El balance de masa debe ser satisfecho, es decir:
VAC 0 _ _ V AC A V BC B V DC D V FC F
Es importante darse cuenta de que la naturaleza y la concentración del soluto, así como
los aditivos (p. ej., contaminantes) y otros factores, p. ej., el caudal, influirán en los
resultados obtenidos, y de este modo estas parámetros deber ser estandarizado cuando
comparando resinas y la las condiciones elegidas deben ser relevantes para la aplicación
en cuestión.
La capacidad de la monocapa se puede derivar de los experimentos de columna
siempre que la isoterma sea langmuriana [106].
q q 2N k kl (10.44)
m ujo
1 k  k l ′ ow k 
dónde q , norte y k es Medido a alto carga y k bajo a bajo carga.

Como fijado arriba la frontal análisis procedimiento usó por calculador la descubrimiento
capacidad mayo ser usó a estudiar la adsorción dinámica. En este caso la solicitud de
muestra en el paso 2 se continúa hasta que C está cerca de C 0 en el efluente. Una medida
de la dinámica viene dada por el cociente Q B,5% / Q B,95% y cuanto más cerca esté este
valor de la unidad, mejor será la dinámica para el paso de adsorción. Dado que la
recuperación y regeneración del medio de cromatografía no son de interés principal en la
determinación de la dinámica, el procedimiento puede ser simplificado por
continuamente siguiendo la paso de C 0 a C C 0 en dos experimentos, siendo el primero
con el soluto disuelto en tampón de adsorción y el segundo con el sustancia disoluta
disuelto en la desorción buffer. Previsto que la concentraciones de la soluto en la dos
soluciones son idéntico y que la caudal Velocidad es constante la cociente es dado por:
Q B, 5% tA ,5% t D, 5% t
Q B, 95%
A, 95% t D, 95%
dónde t X , Y % es la tiempo por la sustancia disoluta en la adsorción ( X A) o desorción (

X D) tampón para alcanzar el 5% ( Y 5) o 95% ( S 95) de C 0 en el efluente.
ADSORCIÓN ISOTERMAS
A obtener la adsorción isotermas la concentración de solutos en la estacionario fase, CS ,
necesito _ a ser determinado por diferente valores de la concentración de solutos en la móvil
fase, C M . los privilegiado camino es a usar la frontal análisis como descrito arriba por
diferente C 0 [107].
Otro Acercarse es a simular la cromatograma asumiendo a forma de la isoterma
y comparar este con experimental resultados (ver abajo) [108].
10.8 MODELADO DE CROMATOGRÁFICO PURIFICACIONES
La posibilidad de diseñar y optimizar purificaciones sobre la base de la teoría de la

cromatografía ha despertado mucho interés debido a los ahorros esperados en tiempo y
dinero de tal enfoque. Sin embargo, como se describió anteriormente, algunos de los
fundamentos de la teoría cromatográfica aún no se comprenden bien. También se
concluyó que los modelos propuestos son lo suficientemente complicados como para
evitar soluciones matemáticas analíticas sencillas. Por lo tanto, se han hecho
aproximaciones para permitir sus aplicaciones prácticas, y
10.8 Modelling of Chromatographic 28
estas aproximaciones influencia la resultados obtenido de tal modelos A afrontar con

Debido a estas deficiencias, el modelado suele estar respaldado por datos experimentales
(p. ej., para determinar los valores de los parámetros agrupados), restringiendo
formalmente el uso del modelo a las condiciones cubiertas por los experimentos.
Además, hay que tener en cuenta que los modelos no son nada. pero nuestro intentos a
describir procesos. Estas aproximaciones de a real proceso deber verificarse mediante
experimentos antes de que se puedan sacar conclusiones válidas.
A pesar de estas limitaciones, modelado de cromatográfico purificaciones proporciona
información valiosa sobre las relaciones esperadas y ayudará a elegir direcciones
estratégicas para el diseño, desarrollo y mejoramiento trabajar (p.ej por priorizando la la
mayoría favorable alternativas). El modelado también se puede utilizar para seleccionar
parámetros críticos y sus rangos, para ser estudiados. en un experimental diseño por
mejoramiento (ver Capítulo 3). Si a modelo se ajusta al resultado de purificación
obtenido a pequeña escala, esto sugiere que el sistema se comporta bien. Por otro lado,
las desviaciones de los resultados esperados teóricamente son indicativas de otros tipos
de interacción que los anticipados entre el soluto y la matriz de cromatografía y/o entre
solutos. Esta es una información importante que debe abordarse. en la mejoramiento de a
purificación proceso. En tal un evaluación, contribuciones introducidas por la empleado
modelo deber ser revelado, y por lo tanto a básico es importante comprender los
parámetros que gobiernan la transferencia de masa y la cinética.
El objetivo final de modelar un proceso es incorporar todas las partes individuales del
proceso y optimizar estas partes no de forma individual sino en conjunto, para dar un
óptimo global del proceso. Esto requiere que, por ejemplo, se pueda calcular la economía
del proceso de los diversos pasos y variar los parámetros de entrada de acuerdo con los
requisitos de los pasos vecinos.
Algunas aplicaciones simples de modelado de purificaciones y cálculos de economía
de proceso se dan como tutorial.
10.8.1 Masa transferir en cromatografía
El balance de masa unidimensional en la columna puede abordarse a partir de la siguiente

expresión general
_
CMETRO 2C C V C
DAM_ _
METRO S (10.45)
tu
S
t z2 z VM t
describiendo la cambio en concentración de la sustancia disoluta en la móvil fase, CM , _

como a función del tiempo, t , causada por la dispersión a lo largo del eje de la columna, z
, para un soluto que tiene un coeficiente de dispersión total D A , el transporte convectivo
afectado por la velocidad intersticial de la fase móvil, u , y la acumulación de solutos en
el fase estacionaria, dando la concen- tración C S . VS _ y VM _ representan los volúmenes
de fase estacionaria y móvil respectivamente.
De este modo, en ordenar a modelo un ideal separación usando la masa balance
ecuación, nosotros necesitar
expresiones por la convectivo transporte de moléculas en la móvil fase (segundo término
en el lado derecho), el equilibrio de adsorción/desorción y la cinética (tercer término en el
lado derecho lado) y la dispersión (primero término en la mano derecha lado) de la
solutos En En el caso no ideal, la transferencia de masa de un solo soluto puede verse
afectada por la autoagregación,
conforme cambios, la concentración y propiedades de otro solutos, etc., cual voluntad

conducir a resultados inesperados.
Masa transferir en la móvil fase

CONVECTIVO TRANSPORTE MASIVO
En la caso dónde allá son no retencion efectos y la dispersión es despreciable, la el
cambio en la concentración de soluto en la fase móvil está determinado únicamente por el
transporte convectivo. los negativo señal de este término indica un inverso relación Entre
velocidad y tiempo de retención.
DISPERSIVO TRANSPORTE MASIVO

El coeficiente de dispersión concentrado, D A , a menudo se aproxima mediante H u /2
[10]. Por comparación con la ec. (10.43) se comprende que esta aproximación se deriva
del número de dispersión del recipiente, que puede no ser aplicable a los lechos de
cromatografía. A veces, el transporte de masa dispersiva en la fase móvil se agrupa junto
con la masa entre partículas. transporte [109]. En general, ambas cosas la Un término y la
Término B en la camioneta Deemter La ecuación (ecuación (10.10)) debe incluirse en el
cálculo del coeficiente de dispersión en el fase móvil.
Masa transferir en la fase estacionaria

los Velocidad de cambio de la sustancia disoluta concentración en la estacionario
fase depende tras la transferencia de masa desde la fase móvil a través de la capa de
película estancada alrededor de la partícula (transferencia de masa de película),
transporte dentro de la perla (difusión y convección) y cinética de adsorción/desorción.
PELÍCULA MASA TRANSFERIR

los película masa transferir parámetro, Kf , _ es dado por [10]
ShD M
k fd (10.46)
_pags
donde Sh es el número de Sherwood (ver Apéndice B para una definición), D M el

coeficiente de difusión molecular libre y d p el tamaño de partícula. Dado que el número
de Sherwood normalmente está en el rango de 2 a 20, se puede ver que la influencia de la
transferencia de masa de la película podría, en estos casos, ser ignorado comparado con
intrapartícula poro difusión, especialmente ya que este la difusión será a menudo pequeña
en comparación con la difusión molecular libre (ver más abajo).
PORO DIFUSIÓN
El transporte de difusión dentro de los poros llenos de líquido influye en el término C en
la ecuación de van Deemter (ecuación (10.10)). Se podría esperar que la difusividad del
soluto dentro de la partícula sea del 5 al 20% del coeficiente de difusión molecular libre
para solutos del mismo orden de tamaño que los poros [6]. La difusión de solutos en los
poros se reduce en estos casos por
la resistencia mejorada y una expresión para la difusión impedida de solutos esféricos en el

espacio confinado de los poros de forma cilíndrica está dada por [6, 110–114],
 R
3 R  R5
(10.47)
D S, 1 DM _  1 2.104  2.089  — 0.948  
 r r 
 
r  
donde D S,1 es el coeficiente de difusión de poro intrapartícula local, D M la difusividad

molecular libre, R el radio del soluto yr el radio del poro.
Cuando ec. (10.47) es usó a determinar zona ampliando (es decir con la ayuda de ec.
(10.10)), se deben tener en cuenta las distancias de difusión efectivas dentro de la
partícula cromatográfica. Esto se hace incorporando el factor de tortuosidad, , que es la
longitud real del poro (longitud tortuosa) dividida por la longitud recta (no tortuosa) del
poro, en una expresión empírica del coeficiente de difusión del poro, D S , dado por D S
D S, 1 / [110]. Desafortunadamente, la expresión del coeficiente de difusión de poros no
da resultados de acuerdo con los datos experimentales [6, 110]. La razón de esto puede
ser desviaciones de las formas geométricas ideales asumidas (aunque los tipos de poros
de hendidura dan resultados similares a los poros cilíndricos) o, quizás más plausible, la
influencia de la carga superficial de las proteínas. estudió [112]. De este modo, eso mayo
ser concluido que no simple universal ecuación por el cálculo del coeficiente de difusión
de poros aún existe y cálculos empíricos por lo tanto, se utilizan regularmente. Una
relación empírica de D s D M K D /4 fue fundar para dar un buen acuerdo con los datos
experimentales para 0.2 K D 0,8 [6].
Otro expresión por la eficaz difusividad es dado por Karger et Alabama. [2].
K segundos
D efecto pags DM _ (10.48)
(K
1)
donde K seg es la fracción de poros disponible para el soluto (es decir, K D en el modo de
exclusión por tamaño , cf. ec. (10.18)), pags la poro fracción de la partícula y k el
distribución constante en cromatografía de adsorción lineal. Debe notarse que la ec.
(10.48) no puede usarse para calcular la local poro difusión coeficiente. Eso es empleado
a calcular la global flujo de solutos en un adsorbente cromatográfico partícula en lineal
cromatografía (es decir K segundos p cuenta para la influencia de disponible volumen dentro
de la partícula en la flujo y cuentas por La influencia de difusión distancias). Eso pueden
además ser visto que la fricción término es perdido que limita la usar de la ecuación a
pequeña solutos (es decir por largo solutos la expresión en la ec. (10.47) debe
reemplazar D M en la ec. (10.48)).
CONVECTIVO TRANSPORTE MASIVO

El transporte de solutos dentro de la partícula debido a la convección puede tener lugar si
los poros son grandes. cuando comparado con la partícula Talla (es decir a apoyo
importante caudal mediante la partícula). El tamaño de los canales vacíos entre partículas
en lechos de partículas uniformes es del mismo orden que el radio de la partícula [113].
La influencia relativa de la convección en comparación con difusión por intrapartícula
masa transporte es dado por la intrapartícula Peclet número, Pe yo ,
expresado por la relación de la tiempo eso toma por a molécula a difuso de la superficie de la
partícula al centro al tiempo de transporte por flujo de fluido intrapartícula,
( r ) 2 /6 d pu
yo _ yo _
(10.49)
DS
r / tu yo 12 D
S
dónde es el factor de tortuosidad, u i la velocidad efectiva del eluyente intrapartícula, y D

S es la velocidad intrapartícula poro difusión coeficiente [114]. los denominador de la
superior término en la ec. (10.49) se origina de la hecho que poro difusión es a
tridimensional proceso. El flujo intrapartícula efectivo viene dictado por la velocidad
intersticial del fluido, la forma de los poros, las porosidades intrapartículas e
interpartículas y el tamaño de los poros en relación con el tamaño de los canales vacíos
intersticiales. El número de Peclet intrapartícula puede calcularse para materiales con una
estructura de poros definida, como las microesferas de sílice porosa (PSM) [113]. la
intrapartícula caudal voluntad, por este escribe de material, ser proporcional a la cuadrado
de poro diámetro sobre el radio de la partícula ( cf. ecuación (10.16)). A partir de esto se
puede calcular que la masa convectiva transporte voluntad tener un influencia (es decir
yo _ 1) cuando correr a proteína tener D S 2 10 7 cm 2 /seg en un 30 m Material
PSM que tiene poros uniformes de 4000 Å de diámetro, a una velocidad intersticial en la
columna de más de 135 cm/min. Por lo tanto, la convección intrapartícula es no probable
a contribuir significativamente a masa transporte en común procesos cromatográficos.
Esto también se observó experimentalmente cuando no se encontró transporte convectivo
para una resina cromatográfica de gran tamaño de poro a velocidades de 5000 cm/h [42].
ADSORCIÓN Y DESORCIÓN CINÉTICA

Se producirá una dispersión máxima si la cinética de adsorción y desorción es lenta. La
cinética de adsorción lenta también influirá en el "grado de utilización" como se muestra
en la Figura 4.21. La cinética se describe mediante las constantes de velocidad directa, k 1
, y inversa, k 2 , del proceso de adsorción según [74].
dq kC (q —q) k q (10.50)
1 METRO metro 2
dt
donde q es la cantidad de soluto, C M la concentración en la fase móvil y q m la máxima

capacidad de adsorción del soluto. Al configurar dq / dt 0, es decir, el proceso ha
alcanzado el equilibrio, (ecuación (10.28)) y se obtiene la expresión correspondiente para
la isoterma de Langmuir. Debe señalarse que las contribuciones a la transferencia de
masa distintas de la cinética de adsorción y desorción (p. ej., difusión de película y
difusión de poros) a veces se incluyen en las constantes de velocidad, lo que hace que
estos parámetros se 'agrupan' [74].
Otros tipos de isotermas además de la simple isoterma de Langmuir pueden ser
apropiados, según lo revisado por Bellot y Condoret e ilustrado por Cramer et al. [27,
79].
Generalmente se supone que la cinética del proceso de adsorción no es un factor
limitante de la velocidad en los procesos cromatográficos. Sin embargo, según lo
revisado por Whitley et al. [115] esto puede no siempre ser anticipado, y no equilibrio
adsorción/desorción cinética (NAD) puede rendir inesperado fenómenos. Eso mayo
además ser señalado que por otro formatos,
p.ej adsorbente membranas, la adsorción proceso posee estado fundar a ser Velocidad
limitando en comparación con el transporte masivo [116].
Cuando se cambia la composición de la fase móvil (es decir, como en la elución en
gradiente o en etapas), también cambia el factor de retención y, por lo tanto, el coeficiente
de distribución. El eluyente promoverá la descomposición del complejo adsorbato-
adsorbato y, por lo tanto, aumentará la constante de velocidad de desorción [117]. De la
ec. (10.50) se espera que la cinética de adsorción dependa de la concentración de la
muestra.
10.8.2 Modelos por masa transferir
Los modelos utilizados para predecir las separaciones cromatográficas preparativas deben
abordar todas las contribuciones a la transferencia de masa que son relevantes para la
situación de separación particular. Resolviendo ec. (10.45) analíticamente por no lineal
adsorción sistemas es no posible, y varios simplificaciones son introducido en ordenar a
llegar a a solución. Eso es por lo tanto Es importante darse cuenta de las limitaciones de
los diferentes enfoques utilizados para seleccionar un modelo que sea útil para el
problema de purificación en cuestión.
Otra limitación a la aplicación de modelos publicados puede surgir del uso de
parámetros agrupados. El uso de parámetros concentrados (p. ej., coeficientes de
dispersión concentrados) requiere menos experimentos a ser realizado, y es por lo tanto a
popular estrategia. Sin embargo, el inconveniente es que el modelo generalmente está
restringido a las condiciones para las cuales se determinaron los parámetros.
Cálculo de la transferencia de masa a partir de la ecuación diferencial. (10.45)
describirá la separación como un proceso continuo. Esto se conoce como tasa (es decir, el
cambio de concentración de soluto se estudia por unidad de tiempo) o modelo de balance
de masa. En otro enfoque, el proceso se ve conceptualmente como un gran número de
etapas discretas donde las fases móvil y estacionaria alcanzar condiciones de equilibrio
antes de que los solutos en la fase móvil pasen a la siguiente etapa. Esto se llama modelo
de placa (es decir, el cambio de concentración de soluto se estudia en función del número
de etapa o placa).
Mientras que el modelo de tasa es, desde un punto de vista fisicoquímico, el modelo
preferido, los cálculos numéricos complejos realizados pueden ser prohibitivos para el
uso general de este modelo. Afortunadamente, el rápido aumento en el poder
computacional de las computadoras de laboratorio estándar ahora está cambiando esta
situación. El modelo de velocidad se ha utilizado ampliamente para modelar una amplia
gama de purificaciones cromatográficas de adsorción (p. ej., consulte la revisión de
Velayudhan et al. [117]).
El modelo de placas ha ganado gran popularidad, principalmente debido a su parecido
con otros procesos de separación como los 'tanques agitados en serie' modelo. Se ha
demostrado que el modelo de placa es útil para estudiar y optimizar separaciones lineales
de intercambio iónico [8]. Una revisión mostró que el modelo de placa podría producir
resultados de acuerdo con el modelo de velocidad para sistemas cromatográficos lineales
[118].
Velocidad modelo (masa balance modelo)

El modelo de tasa se ha utilizado para modelar preparativos CA para componentes
individuales [110]. Los factores importantes para la etapa de adsorción en CA preparativa
se derivaron utilizando la suposición que la efectos de axial dispersión son despreciable
[74]. los mismo Acercarse estaba
utilizado con éxito para modelar la adsorción de proteínas a los intercambiadores de iones
[75]. En otro estudio, se encontró que el efecto de la dispersión axial era insignificante,
mientras que la resistencia a la transferencia de masa interna debida a la difusión lenta
entre partículas era un factor dominante en la adsorción por afinidad de las proteínas
[119].
Crámer y compañeros de trabajo [27] sustituido la Langmuir isoterma por la SMA
modelo, donde estérico blindaje de iónico grupos por largo solutos es incorporado. Ellos
usó la Velocidad modelo, despreció la dispersión axial y encontró un buen acuerdo con
los datos experimentales para solutos individuales en elución no lineal. El modelo
también fue útil para modelar el equilibrio multicomponente en AC de metal
inmovilizado [120].
los matemático modelado de masa transferir requiere la analítico solución de la
ecuación de balance de masa, después de simplificaciones apropiadas, o un enfoque
numérico. Gu [121] descrito la matemático modelado de la general Velocidad modelo y
aumentar proporcionalmente de purificaciones preparatorias. Sin embargo, este
procedimiento es complejo y mayo no ser factible adeudado a la gran número de
parámetros que deben determinarse (a diferencia del enfoque de parámetros agrupados)
[122]. Guiochon et al. [123] comparó el modelo de distribución de Craig (donde el
proceso es dividido dentro a número de discreto etapas) y la cálculo de la masa ecuación
de equilibrio utilizando el método de diferencias finitas. Descubrieron que los dos
enfoques eran equivalentes. Lightfoot et al. [109] comparó el modelo de dispersión,
donde una dispersión concentrada coeficiente es usó, con la extra-partícula masa
transferir modelo, dónde a agrupado se utiliza el coeficiente de dispersión intrapartícula,
y se encontró que dieron resultados casi idénticos. Sin embargo, ellos señalado que este
mayo no ser la caso cuando intrapartícula caudal es contribuyendo al transporte masivo.
Frey y Grushka [124] presentaron soluciones numéricas para la ecuación completa del
balance de masa utilizando un enfoque de distribución de Craig modificado. Este método
parece ser muy prometedor, sobre todo porque se puede realizar sin necesidad de
parámetros agrupados.
modelo de placa
El modelo de plato se basa en la suposición de que la columna se compone de varias
etapas, o platos, en los que la distribución de equilibrio de los solutos entre las fases
móvil y estacionaria es instantánea y el flujo de la fase móvil es continuo sin mezclarse
entre sí. los platos. El enfoque de tanques en serie se utilizó con éxito por Yamamoto et
al. [8] para modelar la elución en gradiente en IEC.
los más simple solicitud de la lámina modelo es la usar de la retencion factor a calcular
el volumen de retención y determinar la altura total de la placa, por ejemplo, a partir de la
ecuación de van Deemter (equivalente (10.10)), a dar la zona ampliando A bajo
concentraciones (es decir lineal cromatografía) eso es razonable a asumir a gaussiano
elución curva (previsto la lámina el recuento es superior a 100), y el cromatograma se
puede simular a partir de la curva normal [2]. Teniendo en cuenta el efecto del volumen
de la muestra, la curva de elución en elución isocrática lineal puede obtenerse de [2, 125]
C 0   V VR
C eh L   V V muestra VR _
_
— erf L  (10.51)

  
2  ⎝ V 2 horas    VR
R
10.8 Modelling
 of Chromatographic 29
2 horas  ⎥
10.9 Simulation of 29
dónde C es la toma de corriente concentración, C 0 la entrada concentración, V la

efluente volumen, V R el volumen de retención, L la longitud de la columna, H la altura
de la placa, V muestra el volumen de muestra y erf la función de error. Este enfoque se
aplicó con éxito al estudio de la influencia del volumen de la muestra en la resolución de
una mezcla de proteínas en exclusión por tamaño preparativa a pequeña escala [126].
Velayudhan y Ladisch [118] revisados lámina modelos y descrito la usar de la Modelo
de distribución de Craig para cromatografía lineal.
Demostraron que las deficiencias anteriores del modelo de placa discontinua se deben
a una incorrecto definición de lámina número por este modelo. Ellos además demostrado
que resultados obtenidos con este modelo mostrar excelente convenio con flujo continuo
lámina teoría y también con modelos de velocidad en cromatografía lineal y no lineal sin
necesidad de recurrir a parámetros agrupados [118].
10.8.3 Computadora modelado de cromatográfico purificaciones
Las aplicaciones citadas anteriormente ilustran que el modelado por computadora es

necesario para producir un modelo realista. aproximación de la resultante cromatograma
mientras pautas por optimización de purificaciones mayo ser establecido de general
teórico relaciones, p.ej como ejemplificado en el Capítulo 4, o del modelado del efecto
para parámetros discretos como se trata en este capítulo. La predicción de los parámetros
de retención con la ayuda de computadoras ha sido revisada por Baba [127].
10.9 SIMULACIÓN DE SEPARACIONES
Se ha descrito un programa informático para la simulación de separaciones de péptidos

con la ayuda de exclusión por tamaño, intercambio catiónico y RPC [128]. un programa
comercial para gradiente analítico HPLC simulaciones, nombrada laboratorio seco, es
disponible de LCResources (Walnut Creek, CA, EE. UU.) [129].
Comercial software por la modelado de cromatográfico purificaciones es ahora estar
disponible, incluso para propósitos a gran escala. Se puede realizar una simulación de
todo el proceso, incluida una evaluación económica, con la ayuda de Aspen Batch Plus
(Aspen Technology, Cambridge, MA, EE. UU.) [130]. En la Ref. [131].
10.9.1 Cálculo de proceso economía
los proceso economía es cercanamente relacionado a la rendimiento (es decir la Monto de

purificado producto por unidad de tiempo) y la productividad (es decir, el rendimiento
por volumen de medio de cromatografía). Las pautas para optimizar la productividad se
pueden obtener de la cromatografía general. teoría (ver Capítulo 4) [132]. Para más
complejo situaciones dónde muchos Si se estudian parámetros interrelacionados, es
posible que se necesiten simulaciones asistidas por computadora para proporcionar
información precisa sobre los efectos en la productividad [133].
Productividad es pero una factor en la cálculo de proceso economía. Solvente costos, la

pérdida de materia prima (es decir, la recuperación del producto) y el costo de la mano de
obra son algunos ejemplos de otros factores. que necesitar a ser contabilizado por en la
global mejoramiento de la proceso (ver Capítulo 8). Se ha presentado software para
calcular la economía del proceso para cromatografía de adsorción [134] y para HPLC
preparativa [135]. Se puede usar un software comercial, SuperPro Designer (Intelligen
Inc., Scotch Plains, NJ, EE. UU.) para evaluar procesos a gran escala para producir un
proceso óptimo desde el punto de vista del costo del producto [130].
10.9.2 Simulaciones usando la suministrado software
Las implicaciones prácticas de la teoría de la cromatografía se han ejemplificado en este

capítulo mediante algunas ilustraciones seleccionadas. Sin embargo, es virtualmente
imposible cubrir todas las combinaciones. de la diferente parámetros que voluntad ser de
interés a estudiar por a especial caso. Por lo tanto, hemos decidido incluir un CD que
contiene las ecuaciones más útiles con este libro. los CD es destinado a ser usó como a
tutorial ayuda a facilitar la proceso de revelando el relaciones gobernante cromatográfico
separaciones. Innecesario a decir, la resultados provistas por las ecuaciones en el CD no
son más precisas o confiables de lo que permiten las ecuaciones básicas y, por lo tanto,
no deben considerarse como datos verdaderos. Al igual que con otros tipos de software,
los resultados deben confirmarse mediante experimentos.
Aplicaciones suministrado en CD, consulte Apéndice D para más detalles.
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– 11 –
Equipo
Este capítulo describe pautas por seleccionando piloto y producción sistemas y

componentes, y discute la ventajas y desventajas de varios tipos de automatización
enfoques. La calificación del equipo y la validación de los sistemas automatizados se
analizan en el Capítulo 7. Los desechables se emplean, cada vez más, en el
bioprocesamiento para operaciones unitarias que van desde el cultivo celular hasta los
pasos finales de purificación [1]. Los desechables pueden minimizar la contaminación
cruzada y la validación de la limpieza. El borrador de la guía de la FDA de EE. UU. sobre
la producción de materiales de ensayos clínicos de Fase 1 ha recomendado equipos
desechables o dedicados en multiproducto comodidades a acelerar clínico juicios y
todavía mantener cumplimiento con CGMP que son importante por este temprano
escenario de desarrollo [2]. los beneficio de rápidamente siendo poder producir _ clínico
calificación material debería ser pesado contra costos de reingeniería la proceso en caso de
que los desechables no estén disponibles o no estén garantizados para la próxima fase de
ampliación. Se ha desarrollado una herramienta de ayuda a la toma de decisiones para
evaluar el uso de equipos desechables frente a los de acero inoxidable [3]. En general,
compañías voluntad siempre probar a acelerar clínico estudios como a primero
prioridad.
11.1 DIRECTRICES PARA LA SELECCIÓN DE PLANTAS PILOTO Y

EQUIPOS DE CROMATOGRAFÍA DE PRODUCCIÓN
A exhaustivo determinación de especificaciones por piloto planta y producción sistemas

pueden Plomo a la compra del equipo más adecuado. Especificaciones funcionales, químicas
y de presión según bien como ningún impacto adeudado a instalaciones área clasificación,
debería ser claramente examinado. También se debe considerar la higiene adecuada y
evitar la propagación por zonas.
11.1.1 Datos de dimensionamiento
Sin importar de la escala y cromatografía sistema, previo a haciendo a adquisitivo

decisión, la usuario debería evaluar la requerido dimensiones. Para la líquido entrega
sistema, los datos de dimensionamiento incluyen el área de la sección transversal de la
columna, el caudal lineal, la presión máxima, la temperatura de funcionamiento, el
volumen de muestra y el consumo de tampón. El sistema debe ser capaz de adaptarse a la
variabilidad de la corriente de alimentación, tanto de volumen como de concentración. Las
bombas pueden tener a funcionar sobre a amplio tasa de flujo rango apropiado por
muestra cargando y elución como bien
299
30 11.
como rápido limpieza en el lugar (CIP) y columna embalaje. (Alternativamente, diferente

zapatillas se puede utilizar para diferentes operaciones.)
11.1.2 Funcional especificaciones
Cuando eligiendo equipo por a piloto planta o por producción, estructura la sistema por
funcional unidades, p.ej por líquido entrega, separación, vigilancia, fracción recopilación
y control. Para cada unidad, definir en detalle qué Tareas necesitar a ser realizado como a
'funcional especificación'. Esto debería conducir a una lista detallada de equipos y
especificaciones. Por ejemplo, la entrega de líquido unidad pueden contener: buffer tanque
toma de corriente válvulas y nivel bajo alarmas, muestra tanque alarma de drenaje , bomba
con tasa de flujo control, en línea filtros por tampones y muestra, aire burbuja alarma,
trampa de aire, alarma de sobrepresión, by-pass de filtro, interruptor automático de filtro
de alta presión, anulación manual de válvulas, válvulas de drenaje manuales, etc.
La complejidad funcional determina la mejor estructura de automatización para el
sistema. Los requisitos de automatización son muy diferentes en las diferentes etapas (ver
la sección sobre 'Automatización' abajo). Para ejemplo, eso es no normalmente necesario
a automatizar alarmas en reservorios tampón para sistemas de laboratorio. Por otro lado,
se puede incurrir en una pérdida de producción de varios o más días si un 1000 La
columna L se seca porque el depósito de inercia está vacío. como general regla, funcional
complejidad aumenta cuando yendo de la laboratorio escala a producción, donde la
confiabilidad del sistema es crítica.
Definición a bueno funcional especificación requiere comprensión ambas cosas la
general proceso y la bioquímica involucrada. Por ejemplo, la elección óptima de filtros en
línea depende de los procedimientos de recuperación temprana (por ejemplo,
centrifugación y filtración) y las características hidrofóbicas. de la muestra. Correcto filtros
por continuo en línea filtración son determinado por mucho tiempo término laboratorio
escala juicios usando diferente filtrar tipos los elección de la correcto filtro en línea
pueden ser un importante parte de proceso desarrollo, y voluntad tener un impacto en
rendimiento del proceso, tiempo consumo y filtrar consumo en producción. En línea
filtros afectan la vida de los medios de separación y, como resultado, la economía de todo
el proceso.
El establecimiento de las especificaciones funcionales conduce a un dibujo de tuberías
e instrumentos (P&I) que incluye todos los instrumentos y funciones del proceso
(consulte la Figura 11.1) . Pero antes de que sea posible elegir el equipo adecuado para
las funciones definidas, se deben definir las especificaciones químicas y físicas del
sistema, y se deben considerar los requisitos de diseño higiénico, distribución por zonas y
documentación.
11.1.3 Químico especificaciones
los tampones definido por la purificación protocolo influencia qué construcción

materiales están permitidos. Por ejemplo, incluso los tampones comunes de NaCl causan
problemas con el acero inoxidable en condiciones levemente ácidas. La muestra también
puede limitar la elección de materiales de construcción adecuados si la proteína de interés
es sensible al contacto con ciertas superficies. La elección de los materiales de
construcción puede verse restringida aún más por la necesidad de una limpieza regular
del sistema con soluciones fuertes (consulte también el Capítulo 6).
11.1 Guidelines for Selecting Pilot Plant and Production Chromatography 30
los químico composición de cada manipulación de líquidos componente debería ser
definido por el proveedor. Cada componente en contacto con el líquido debe ser
compatible con la muestra, tampones
30 11.
Figura 11.1 A tuberías e instrumentos (P&I) dibujo de un complejo sistema de cromatografía .

Mesa 11.1
Materiales comúnmente utilizados en contacto con corrientes de alimentación en procesos
cromatográficos Columnas
Borosilicato de tubo vidrio, inoxidable acero, PTFE, E-CTFE, polisulfona, TPX, epoxi,
polietileno de alta densidad, polipropileno, plexiglás
Piezas finales Inoxidable acero, PTFE, E-CTFE, polisulfona, oxirano
vidrio/policarbonato, poliamida, polipropileno, cloruro de polivinilo
juntas tóricas EPDM, FPM (Viton ® ), NBR, PTFE, caucho de silicona, polietileno de alta
densidad Redes Polipropileno, acero inoxidable, polietileno, poliéster, poliamida,
inoxidable
acero, polietileno, polivinilo cloruro, PTFE
Válvulas
Cuerpos Acero inoxidable, polipropileno, cloruro de polivinilo,
PTFE Diafragmas EPDM, silicona, FMP (Vitón), PTFE, TPE (Santoprene™)
Filtros PVDF (Kynar® ) , polisulfona, silicona, celulosa ester, microfibra vidrio,
poliéster, polipropileno, uretano
Caudalímetros TPX, PVDF (Kynar), zafiro, inoxidable
sensores de conductividad de acero Polisulfona, acero inoxidable,
PDVF (Kynar)
Ultravioleta celdas polivinilo cloruro, polipropileno, PTFE, cuarzo vidrio, inoxidable acero
y limpieza agentes usó en producción. Típico mojado superficies usó en columna

cromatografía _ son mostrado en Mesa 11.1 . Con la excepción de inoxidable acero,
equipo usó en la producción de material para ensayos clínicos y producto comercializado
debe ser evaluado para extraíbles. Potencial extraíbles venir de aleación rieles y rellenos
en plástica; los pigmentos pueden filtrar de caucho, por ejemplo de columna juntas
polipropileno, cual es usó en muchos sistemas de cromatografía de fabricación, se ha
demostrado que se une a las endotoxinas [4]. Miller ha abordado el aseguramiento de la
calidad de los materiales de producción para la biotecnología, quien afirma que los
materiales más problemáticos para el contacto con la solución del proceso biotecnológico
son los hechos de caucho [5]. Al realizar las pruebas de toxicidad de la Farmacopea de
los Estados Unidos (USP) y la Farmacopea Europea (EP) y calificar a los subproveedores
de materias primas, los proveedores de equipos de hoy en día pueden proporcionar a las
empresas datos suficientes para que los materiales que no sean de acero inoxidable
puedan usarse en aquellas situaciones en las que brindan beneficios. características (por
ejemplo, para sistemas pequeños o sistemas multipropósito o resistencia química
superior).
Los reguladores han expresado su preocupación por los efectos a largo plazo de los
múltiples ciclos de limpieza en la integridad de plástica. Si polímeros descanso abajo al
repetido exposición a productos químicos de limpieza agresivos, la integridad del
producto podría verse afectada negativamente. Debe demostrarse la estabilidad del
plástico y la ausencia de lixiviables.
El gráfico de resistencia química que se muestra en la Figura 11.2 brinda pautas sobre
la resistencia química de diferentes plásticos, elastómeros y acero inoxidable. Es
importante tener en cuenta que la 'resistencia' no es un término absoluto, sino relativo.
Los plásticos y elastómeros, en particular, pueden verse afectados por la exposición
prolongada a productos químicos. Esto no se encuentra en las pruebas estándar,
30 11.
simplemente porque la duración de las pruebas es limitada. Además, bajo presión, los
plásticos y elastómeros mayo ser importantemente más afectado por productos quimicos
Extenso pruebas, por lo tanto, debe ser realizado a verificar fuga y resistencia de la
material a la exacto combinación de productos químicos, presión y temperatura utilizados
en el proceso.
Figura 11.2 Gráfico de resistencia química para materiales seleccionados utilizados en la

cromatografía de procesos. Primario sistema—amplio clasificación: , no resistente; 0, limitado
resistencia; , resistente; espacio, no datos disponibles; paréntesis, la resistencia es condicional o los
datos son de una serie de pruebas limitada. Sistema secundario: calificación de resistencia: 0,
resistencia limitada; 1, resistencia justa; 2, buena resistencia; 3, muy buena resistencia.
Para la cromatografía a escala de producción, una regla general es utilizar solo vidrio,
acrílicos, fluoroplásticos y acero inoxidable. Esto da total libertad en la elección de la
química de separación y las técnicas de esterilización. (Sin embargo, los fluoroplásticos
pueden no ser mecánicamente apropiado por sellando componentes, y vidrio pueden
solamente poco frecuentemente permitir por esterilización por vapor en línea). Los
componentes de acero inoxidable generalmente están electropulidos. El electropulido deja
una superficie lisa que es más resistente a la corrosión y se cree que reduce el potencial
de crecimiento bacteriano. Sin embargo, esta última afirmación tiene recientemente ha
sido cuestionado [6]. Tuthill [7] ha descrito procedimientos para limpiar superficies de
acero inoxidable. Para obtener más información, consulte Wang y Chien [8] y Cowan y
Tomás [9].
11.1.4 Presión especificaciones
Las especificaciones de presión se estiman a partir de mediciones de laboratorio de la

caída de presión sobre la columna de cromatografía empaquetada y la información de los
proveedores de equipos que muestra la presión gotas sobre la manipulación de líquidos
equipo y la vacío columna.
30 11.
Presión mediciones de la ensamblado sistema deber después ser hecha a determinar la

especificaciones. La información de caída de presión debe mostrarse en función del
caudal. La operacion sistema presión es calculado como la suma de la presión soltar sobre
la lleno columna _ y la equipo a ser instalado Entre la bomba y la colección de fracciones
sistema. Con resinas menor que 30–40 metro, la contribución de la extra-columna
equipo para la general presión soltar es normalmente despreciable, y, por lo tanto, la
sistema presión
especificación es definido en gran parte por la columna espalda presión.
Eso es importante a asegurar adherencia a recipiente a presión reglamentos Estas
regulaciones generalmente se especifican por país. Meyer describe las pautas nacionales
para recipientes a presión. [10]. Ya que muchos compañías usar idéntico procesos en
fabricación sitios en más de una nación, la evaluación temprana de los requisitos locales
de los posibles sitios de fabricación puede ahorrar tiempo y dinero al evitar la necesidad
de rediseñar y especificar un sistema.
11.1.5 Higiénico diseño
La compatibilidad de los equipos con disolventes y el diseño higiénico de los sistemas

cromatográficos se han vuelto más evidentes con la introducción de resinas que resisten
soluciones alcalinas fuertes adecuadas para CIP (para obtener más detalles, consulte el
Capítulo 6).
En principio, es posible esterilizar un sistema cromatográfico en línea. En realidad, sin
embargo, es posible que la geometría del equipo no permita que el agente esterilizante
lave todas las partes del sistema. Equipo debería ser elegido que lo hace no crear
estancado zonas Para ejemplo, la geometría de a membrana válvula permite por libre
líquido caudal sobre la entero interno superficie. Mejor prácticas por higiénico diseño son
resumido por la COMO YO bioprocesamiento Equipo (ASME BPE) Estándar, cual es
seguido por muchos equipo proveedores. Pero eso es no Siempre es posible encontrar
equipos diseñados higiénicamente. Por ejemplo, un ultravioleta (UV) de pequeña escala
monitor caudal célula con laboratorio tipos de no sanitario, roscado conexiones podría ser
necesario en el sistema. Todavía es posible lograr una buena higiene del proceso, sin
embargo, por regular apertura la caudal célula y limpieza eso fuera de la sistema. Para
producción sistemas, flujo células son mecanizado o soldado inoxidable acero o
polipropileno con no roscado piezas y conexiones tri-clamp a la línea de proceso.
Bueno higiene en proceso cromatografía depende en usando higiénicamente diseñado
equipo donde esté disponible, soluciones filtradas de 0,2 micras que ingresan al sistema,
un método para la limpieza y desinfección en línea.
11.1.6 Zona extensión
los separación energía de a completo cromatográfico sistema es determinado por la

interacciones químicas entre los medios de separación y las moléculas a separar. El
equipo hace no contribuir a la actual separación; todavía, la mismo separación química
pueden dar un rendimiento diferente cuando se ejecuta en diferentes equipos. Esta
diferencia de rendimiento es el resultado de zona extensión creado por retromezclado
efectos en la manipulación de líquidos sistema o en las entradas y salidas de la columna.
Zona extensión en diferente escamas pueden ser investigado por correr sal pulsos
mediante el sistema sin que a columna. Zona extensión de la manipulación de líquidos
equipo es Medido como
30 11.
Figura 11.3 los efecto de muestra volumen en zona extensión: V 0 , muestra volumen; V 2 , V 0
superpuesto a 'sample out'; V 1 , dispersión de zona (o ensanchamiento de pico) en 'muestreo fuera'.
( Nota : la absorbancia no está a escala)
el factor de dilución, que es igual al volumen de la muestra diluida que sale del sistema
dividido por la volumen de la muestra entrando la sistema. A obtener a importante
medición, el volumen de la muestra entrante debe ser el mismo que el volumen de la
muestra real que se va a separar en el sistema.
Zona extensión en analítico cromatografía posee estado minuciosamente investigado
[11]. En general, la difusión de la zona extracolumna causa menos problemas en la
cromatografía piloto y de producción a gran escala. La dilución de la dispersión de la
zona extracolumna tiene menos efecto en los volúmenes máximos más grandes (consulte
la Figura 11.3).
En las técnicas de adsorción, el equipo instalado aguas arriba de la columna tiene efectos
de dilución mínimos. en la separaciones realizado en la columna. Este es adeudado a la
concentrando efectuar el actual adsorción posee en la muestra. Importante relacionado
con el equipo zona extensión es adeudado a la dilución en la salida de la columna, el
sistema de monitoreo o el sistema de recolección de fracciones. Para minimizar estos
efectos, las celdas de flujo del monitor, los tubos y las válvulas de fraccionamiento deben
diseñarse para minimizar los volúmenes internos.
En la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y otras técnicas de elución
isocrática, los efectos de dilución de todo el sistema del equipo (desde el tanque de
muestra hasta las válvulas de fraccionamiento) pueden afectar zona extensión. Por lo
tanto, estas tecnicas son en general más afectados por el equipo durante la ampliación, y
se debe tener más cuidado en el diseño del sistema.
Mesa 11.2
Típico técnico documentación disponible con a producción cromatografía sistema
Índice de dibujos y documentación Disposición del armario

Tubería y instrumentación diagrama Lista de piezas
General sistema Especificación eléctrica esquemas
Instrumento Especificación Cableado mesa
Especificación mecánica Cable
diagramas Lista de repuestos y capacidad de intercambio
Lista de E/S
Inspección y software de plan de prueba configuración descripción
Calibración Certificados Software configuración revisión documento
Inspección informes Asamblea dibujos
Configuración de programable específicos del instrumento manuales y hojas sueltas
Funcional registros de prueba Instalación y Operacional calificación documentación
11.1.7 Documentación
Documentación necesidades por cromatografía sistemas son extenso y debería ser

establecido antes de la compra del sistema. La documentación adecuada es un requisito
para la calificación del equipo y la validación del proceso (consulte el Capítulo 7). La
Tabla 11.2 muestra una lista de la documentación técnica típica suministrada con un
sistema de cromatografía utilizado para la producción.
11.2 SELECCIÓN DE COMPONENTES
Un sistema de cromatografía puede ser bastante simple, con solo unos pocos
componentes, o muy complejo. Además del hardware y software de automatización que
se describe a continuación, un completo sistema incluye: columnas, válvulas, zapatillas,
monitores y sensores, tubería o tubería, y colección de fracciones dispositivos. Para más
lejos lectura, ver McCabe y Herrero [12] y Coulson y Richardson [13].
11.2.1 columnas
A cromatografía columna es diseñado a crear como poco zona extensión como posible y
para permitir el empaquetamiento de las resinas de cromatografía para dar la mayor
eficiencia. Las entradas y salidas de la columna deben permitir un flujo uniforme de la
muestra sobre el lecho cromatográfico, y la tolerancia a la presión de la columna debe ser
lo suficientemente alta como para permitir el empaquetamiento de las muestras más
pequeñas. partícula Talla resinas que voluntad ser empleado. Técnicamente, la
construcción pueden varían, pero todas las columnas que muestran una distribución
uniforme del flujo tienen una caída de presión radial que es insignificante en relación con
la caída de presión axial en la entrada (Figura 11.4).
Un integral parte de la columna y su caudal distribución sistema es la partícula retener
neto, también llamó cama apoyo (no mostrado en Figura 11.4). A laboratorio escala
31 11.
o por HPLC
11.2 Selection of 30
Figura 11.4 Espalda radial y axial distribución de presión en una columna sistema.
columnas, fritas o tejido mallas con alto lateral permeabilidad mayo ser usó cual distribuir
el líquido entrante dentro de la estructura de soporte antes de que entre en el espacio del
lecho empacado. A piloto y producción escala columnas con más grande diámetro a
altura proporciones, y especialmente cuando usando baja presión resinas sin embargo, a
separado líquido distribución canal en entre la celda del extremo de la columna y la red es
necesaria para una distribución adecuada del líquido sobre la superficie total del lecho
empacado. Los sistemas de distribución a gran escala suelen emplear patrones de
distintos líquido caudal canales alterno con costillas por mecánico soporte de la red y el
empacado cama, respectivamente. Otro comercialmente disponible escribe de
distribución sistema usa un grueso tejido malla en Entre la más fino partícula retener red
y la final célula. los La estructura gruesa distribuye el líquido desde la entrada central
rápida y uniformemente sobre toda la superficie.
área de la cara de la red y la lleno cama.
A más grande columna diámetros, la distribución canal y su sostener volumen mayo
generar una zona adicional que se extiende por las diferencias en el tiempo de residencia entre
el líquido que pasa cerca de la columna la línea central y líquido de viaje a lo largo de la
distribución canal hacia la pared de la columna antes de entrar en el lecho empacado.
Para minimizar esta fuente de dispersión por zonas, los canales de distribución de forma
cónica con una profundidad de canal decreciente hacia el final de la canales cerca la
columna pared son aplicado. De este modo, a balance pueden ser logrado Entre a
30 11.
bajo radial presión soltar y la necesitar por a suficientemente alto líquido velocidad a lo
largo de el canal para minimizar las diferencias de tiempo de residencia.
Otras soluciones de diseño son columnas con múltiples entradas, que predistribuyen el
líquido antes alimentación eso dentro final pieza y distribución canal, respectivamente.
Igualmente eficiente pueden ser columnas con una sola entrada que empleen un medio
para la predistribución interna de líquido. Para este último, por ejemplo, un dispositivo
anti-chorro de gran tamaño (un disco) transfiere el líquido entrante a un intermedio
diámetro antes de liberando eso dentro la distribución canal. Este Dia, metodos de
ingenieria me gusta computacional líquido dinámica (CFD) permitir por diseño
mejoramiento de a sistema de distribución para que coincida con el tipo específico de
resina de cromatografía con el control adecuado de la eficiencia de la columna [14].
Para columnas con más grande diámetros, a número de construcciones son disponible.
Columnas de empaque en el lugar utilizar único boquillas que simplificar embalaje de largo
columnas y proveer a 'sistema cerrado' ambiente que minimiza la riesgo de contaminación.
los elección de la correcto columna depende en la químico y físico especificaciones y, la
mayoría importante, la medios de separación. Para tecnicas tal como expandido cama
adsorción, único líquido distribuidor sistemas en el base de la columna son requerido. Para
baja presión cromatografía (arriba a 3 barra), hay ahora comercialmente disponible
columnas construido de el plastico, vidrio o inoxidable acero. estas columnas rango en
Talla de laboratorio escala arriba a diámetros de aproximadamente 2 metro.
Tradicionalmente, bioquimicos tener privilegiado columnas que permitir por visual
inspección de los medios empaquetados. Pero es útil tener en cuenta que a medida que
aumenta el diámetro de la columna, se puede ver una porción más pequeña de los medios
empaquetados. Tanto el vidrio como algunos plásticos permiten la inspección visual. Para
la fabricación se suelen utilizar tubos de polimetilmetacrilato colado con alta resistencia
química y mecánica. Estas columnas no son tóxicas, toleran altas presiones y tienen una
resistencia química relativamente alta. Las columnas de vidrio y acero inoxidable de alta
calidad permiten altos índices de flujo y cumplen con los estándares de la industria
farmacéutica.
Como se mencionó anteriormente, en ocasiones una construcción de acero inoxidable
normal puede no ser compatible con el entorno químico y las columnas construidas con
acero inoxidable de mayor calidad. acero, p.ej prisa que es inafectado incluso por
fuertemente ácido que contiene haluro tampones, pueden ser necesarios. Esto puede ser
bastante costoso, y se debe considerar la compatibilidad con las superficies húmedas en el
diseño del proceso al seleccionar solventes y tampones.
Para cromatografía de presión media (hasta 20–40 bar), las columnas construidas de
vidrio o acero inoxidable están disponibles en diámetros de hasta 60–100 milímetro Los
diámetros superiores a 60–100 mm requieren acero inoxidable.
Para la cromatografía de procesos de alta presión, el único material de construcción
práctico es el acero inoxidable. acero. Desafortunadamente, como la sistema presión
aumenta asi que lo hace la columna costo. A presiones superiores a un bar, a escala de
proceso, la columna se considera un recipiente a presión. recipiente a presión codigos
diferir de de una país a otro y deber ser definido antes de elegir una columna con fines de
producción [15, 16].
Durante el desarrollo del proceso, el uso de adaptadores permite evaluar el lecho
óptimo configuración y simplifica la frecuente reempacar necesario cuando comparando
diferentes resinas. Hidráulico o conducido por motor adaptadores pueden permitir por
rápido embalaje (Figura 11.5a). el adaptador es bajado o por debajo constante presión o
con constante velocidad, cual facilita rapido embalaje por debajo optimizado condiciones,
seguido por cierre la adaptador en lugar. los embalaje completo operación pueden ser
terminado en 5 min y mayo ser completamente automatizado. En producción, una
columna con extremos fijos puede ser tanto higiénica como económica, pero tanto para el
desarrollo
31 11.
(a) (b)
Figura 11.5 AxiChrom™ (a) columna ensamblada, (b) columna en posición de mantenimiento con
tubo basculante.
y parece preferirse la fabricación del estilo de adaptador que permite el ajuste de la cama.
Gran escala columnas con hidráulico o conducido por motor adaptadores pueden además
simplificar la mantenimiento de la columna internos (es decir juntas tóricas, redes) por
eliminando la necesitar por externo polipastos, que se requieren, por ejemplo, para el
mantenimiento de columnas con piezas finales fijas (Figura 11.5).
11.2.2 Válvulas
Las válvulas se utilizan para dirigir el líquido a través del sistema de cromatografía y las
funciones de la válvula son mostrado en Mesa 11.3. Estas funciones pueden ser o manual
o automático o ambas cosas. Las válvulas pueden operarse electromagnéticamente o por
aire comprimido.
Para buffer selección y fracción recopilación, multipuerto válvulas son privilegiado a
minimizar muertos volúmenes que proveer a ubicación por bacteriano crecimiento. Filtrar
y columna derivación son mejor logrado por múltiple multipuerto diafragma válvulas
bidireccional válvulas algunas veces aumentar el sistema sostener volumen, pero sanitario
Tres- y de cuatro vías diafragma válvulas habilitar la
Mesa 11.3
Válvula
funciones Interruptor de tampón
automático
Fracción colección
Filtro by-pass
By-pass de trampa
de aire Aire
trampa, aire
desbloqueo By-
pass de columna
Interruptor de
bomba
Delantero o reverso caudal mediante la columna
Conexión de columnas en serie o en paralelo
Selección de monitores en línea
Reciclaje producto
Drenaje del sistema
Rutinas CIP
diseño de eficiente sistemas los problemas previamente asociado con muerto volumen y
acumulación de líquido mayo ser evitado con estas multipuerto válvulas que permitir la
diafragma de la válvula esté casi al ras con la pared interior de la tubería [17].
Según la escala de operación, la presión del sistema y los productos químicos
utilizados, las válvulas de diafragma son las válvulas preferidas para la cromatografía a
escala de producción higiénica y confiable. Molinero [5] precauciones que 'a constante
caudal de nivel bajo tóxicos pueden ser extraído afuera de diafragmas de válvula mal
preparados'. Se presenta más información sobre el diseño de válvulas en un libro de
ingeniería de bioprocesos [18].
11.2.3 Zapatillas
Al seleccionar una bomba para cromatografía de procesos, higiene, resistencia química,

presión/flujo Velocidad capacidades, la temperatura tolerancia, cizallamiento, velocidad
control y debe tenerse en cuenta la pulsación.
Higiene
Para la cromatografía líquida a escala de producción, la bomba debe desmontarse
fácilmente para su limpieza y permitir la esterilización por vapor y CIP. No debe haber
zonas estancadas en la bomba donde pueda ocurrir el crecimiento microbiano.
Químico resistencia
Los materiales de la bomba deben ser compatibles con los procedimientos de limpieza y
los productos químicos utilizados en el proceso. El número de bombas adecuadas es
31 11.
bastante limitado, especialmente si la esterilización por vapor es a ser usó. Eso es
importante a saber qué materiales son usó en la bomba focas. Muchos procesos
cromatográficos requieren monómero de etileno propileno dieno (EPDM) o cauchos
fluorados debido a su resistencia química.
Presión/caudal Velocidad
Eso es la mayoría importante que la bomba cubre la completo caudal Velocidad rango de
la proceso y que la presión de descarga sea adecuada en todo el rango (Figura 11.6).
Además, los requisitos de la bomba se pueden cumplir mediante la colocación adecuada
de los tanques. Por ejemplo, si un búfer tanque es situado en la piso arriba la
cromatografía operación y gravedad ayuda a la entrega del fluido, el riesgo de cavitación
de la bomba es menor que si el tanque de compensación está situado al mismo nivel que
el sistema.
La temperatura tolerancia
El rango de temperatura de funcionamiento de las diferentes bombas varía. Por lo
general, esto no causa ningún problema porque la mayoría de los procesos
cromatográficos se realizan a temperatura ambiente. Sin embargo, si vapor esterilización
o caliente agua es usó por desinfección, considerable cuidado deben tenerse en cuenta al
seleccionar la bomba adecuada.
Cizallamiento
La mayoría proteinas son sensible a cizallamiento. Cuando eligiendo a bomba por
proteína Procesando, esto es una de la la mayoría importante aspectos a considerar.
Varios comúnmente usó industrial zapatillas,
por ejemplo, las bombas centrífugas, de engranajes y de tornillo provocan el cizallamiento
de proteínas. Se ha observado que el cizallamiento por bombeo representa hasta un 60% de
pérdida de producto proteico.
control de velocidad
Los sistemas de cromatografía líquida normalmente funcionan en un amplio rango de
caudales. Durante la aplicación de la muestra, los cambios de viscosidad pueden afectar
las velocidades de flujo, y la velocidad de flujo de elución suele ser considerablemente
más baja que la velocidad de flujo durante los pasos de equilibrio y limpieza. Para
permitir el funcionamiento en todo el rango de caudales, es necesario tener bombas con
control de velocidad automático.
31 11.
Figura 11.6 Presión/caudal Velocidad curvas por diferente tipos de zapatillas.
pulsaciones
La pulsación de la bomba debe minimizarse para evitar perturbaciones en la columna
empaquetada. Si se debe usar una bomba pulsante, se debe tener cuidado para minimizar
la pulsación. Trampas de aire colocadas después la bomba pueden Actuar como pulsación
amortiguadores, y en línea legumbres amortiguadores pueden también ser usó.
Legumbres amortiguadores mayo, sin embargo, introducir a sostener volumen y reducir
precisión del gradiente .
Adicional bomba caracteristicas que debería ser consideró incluir hermético filtración
opresión, a largo plazo esterilidad, toda la vida y operador la seguridad. Estas problemas
tener estado discutido por alee, quien describe estas y otro caracteristicas por peristáltico,
giratorio lóbulo, y mutando desct zapatillas [19]. En la cromatografía se utilizan bombas
de diafragma, de tornillo, peristálticas, de rotor lobular y de engranajes. En la mayoría de
los casos, la especificación del caudal dictará qué diseño de bomba se elegirá. También se
debe considerar la compatibilidad química. Para los sistemas de gradiente, normalmente
se utilizan dos bombas. usó. En alguno casos, a único bomba es usó con dos control
válvulas o cambiar válvulas a proporción la mezcla. Separado muestra solicitud zapatillas
son algunas veces empleado minimizar muestra dilución. Cada bomba escribe posee
cierto ventajas y desventajas, algunos de cual son discutido por Glaser [17]. Para más
lejos información en zapatillas, ver Stover [20].
11.2.4 monitores, metros y sensores
monitores pueden ser dividido dentro aquellos usó por proceso vigilancia y aquellos usó a
medir el rendimiento del sistema y proporcionar seguridad. Los monitores utilizados para
el control de procesos incluyen aquellos por ultravioleta, conductividad y pH. monitores
por sistema actuación y la seguridad incluir medidores de flujo , presión, aire y la
temperatura sensores los grabado mediciones convertirse en parte de la documentación
del lote.
ultravioleta monitores
Los monitores UV miden la absorbancia de la luz UV. Por lo general, la absorción UV de
las proteínas se mide a una longitud de onda de 280 Nuevo Méjico. Múltiples monitores
de longitud de onda y longitud de onda de barrido mayo ser útil por laboratorio y incluso
piloto escala cromatografía En la producción cromatografía, único longitud de onda
monitores son privilegiado porque de sus fiabilidad y sencillez. Además, poco del equipo
de escaneo disponible está diseñado para uso industrial.
Ahí son funciones que son ventajoso en ambas cosas laboratorio y proceso
cromatografía ultravioleta vigilancia, es decir cero automático base línea y evento
Marcos. Para proceso cromatografía, hay características adicionales a considerar. Estos
incluyen: celda de flujo continuo, longitudes de camino variable, sanitario conexiones y
célula interior, no sensibilidad a eléctrico ruido, lámpara vigilancia, protección contra
explosiones y niveles de alarma ajustables.
Conductividad monitores
Los monitores de conductividad miden la fuerza iónica. La conductividad es el parámetro
de control de entrada principal usó en automatizado cromatografía sistemas a habilitar la
generación de sal gradientes o a control buffer dilución o en línea buffer preparación.
31 11.
Conductividad monitores son también útil por vigilancia y automatizando limpieza y
equilibrio pasos. Eso es importante
tenga en cuenta que las mediciones de conductividad y pH (ver más abajo) dependen de
la temperatura y ambas pueden compensarse con la temperatura.
Los requisitos del monitor de conductividad industrial son, en muchos aspectos,
similares a los descritos anteriormente para los monitores UV a escala de proceso. Dado
que los monitores de conductividad se utilizan para el agua purificación sistemas y aguas
residuales tratamiento unidades, allá son mucho de flujo a gran escala chaquetas
disponible. Sanitario diseño de caudal células y chaquetas, y minimización de volumen
interno de las camisas de flujo, debe tenerse en cuenta al seleccionar los monitores de
conductividad.
monitores de pH
En muchos aplicaciones, preciso pH control es crítico a la éxito de la separación. Las
fluctuaciones menores en el pH pueden arruinar la separación, ya que algunas proteínas
eluyen con una diferencia de 0,1 unidades de pH entre sí. Además, una variación
igualmente pequeña en el pH puede afectar la solubilidad de una proteína y provocar el
bloqueo de la columna. La tabla 11.4 muestra una investigación de sensibilidad al pH. en
a proceso por separación de humano suero albúmina (HSA) de sangre plasma. Los
resultados indicar que la pH durante parte de la proceso mayo no variar más que 0.05 pH
unidad a lograr reproducible resultados. De a técnico punto de vista, este es a muy
angosto limitación que no se encuentra en los procesos biotecnológicos bien diseñados de
hoy.
El monitoreo del pH industrial es muy difícil, particularmente debido a la sensibilidad
de los electrodos de pH al ensuciamiento. El diseño de una unidad de medición de pH, por lo
tanto, necesita una atención especial. Lo más importante es que el electrodo se debe quitar
fácilmente de su camisa de flujo para limpiarlo, calibrarlo o reemplazarlo.
Caudal metros
La velocidad de flujo en un sistema de cromatografía líquida generalmente se controla
mediante una señal de medidor de flujo como aporte y a controlador a ajustar la velocidad
de la bomba. los caudal metro debería no ser sensible a los cambios de viscosidad, y se
prefiere un diseño sanitario. Varios tipos de flujo
Mesa 11.4
Posible variaciones en el pH y la fuerza iónica ( I ) en tampones utilizados en los diferentes pasos

cromatográficos para la purificación de HSA
Paso Correcto Rango

pH yo pH yo
Buffer intercambio 7.0 0.025 No crítico 0,023–0,027
Anión
intercambiar 5.20 0.025 5.10–5.25 0,023–0,027
tampón 1
Buffer 2 4.50 0.025 4.40–4.60 0,025–0,030
Buffer 3 4.00 0.15 No crítico No crítico
Catión
intercambiar 4.50 0.025 4.30–4.70 0,023–0,027
tampón 1
Buffer 2 5.50 0.11 5.45–5.55 0,11–0,12
31 11.
Buffer 3 8.00 0.40 No crítico No No crítico mín.
Gel filtración 0.05 METRO crítico 0.02
NaCl
hay metros disponibles. Los más utilizados, caudalímetros másicos y electromagnéticos

(este último no se puede utilizar para medir Agua WFI o DI): cumplen con los requisitos
sanitarios y de precisión.
Aire sensores
Aire sensores son usó a proteger la cromatografía columna de aire y a habilitar vaciado
completo del tanque de muestra. La columna también se puede proteger con una trampa
de aire. Por lo general, una trampa de aire y un sensor de aire se utilizan en serie.
El vaciado completo del tanque de muestra es esencial si la muestra tiene un valor alto.
Los sensores de nivel se pueden usar para lograr el vaciado del tanque de muestra, pero el
sensor de aire tiene una ventaja sobre los sensores de nivel. Dado que el sensor de aire
generalmente se coloca en la línea de salida, no es en directo contacto con la tanque
contenido. Ultrasónico aire sensores con sanitario diseño Se recomiendan y están
disponibles tanto en plástico como en acero inoxidable.
11.2.5 Tubería o tubería
Los tampones y la muestra se bombean desde sus respectivos contenedores a la columna

de cromatografía en tubos o tuberías. La caída de presión aceptable en un sistema de
cromatografía se determina por la descarga presión de la bomba en la sistema y la máximo
presión operacional de la respectivo componentes en la sistema, incluido la tubería. los
sistema debería ser diseñado en tal a manera que la mayoría de la presión soltar es
producido por la resina en la columna. Como pauta general para la cromatografía de baja
presión, la caída de presión máxima en la tubería debería ser 10-15% de la disponible
presión de la bomba. Este deja alrededor 50% de la disponible presión por la lleno cama y
la descansar por todos otro componentes en el sistema. El tamaño de la tubería también se
basa en la regla general de que la velocidad máxima del fluido del proceso es de
aproximadamente 1,5 m/seg.
Cuando seleccionando tubería o tubería por a cromatografía sistema, la siguiendo
aspectos adicionales necesitar a ser consideró: dimensiones, interno volumen, químico
estabilidad, temperatura, flexibilidad y precio.
11.2.6 Fracción coleccionistas
En la laboratorio, la fracción coleccionista es sólo como importante como la columna. A

proceso escala, otro consideraciones afectar la elección de equipo por coleccionar
fracciones, la la mayoría importante siendo la número de fracciones recogido. Poco
frecuentemente son más que cinco o seis fracciones recogido _ en a bien desarrollado
producción proceso. Durante proceso desarrollo, sin embargo, más fracciones voluntad
normalmente ser recogido. multipuerto válvulas o colectores de bidireccional válvulas son
el método de recolección de fracciones más adecuado para la producción.
11.3. AUTOMATIZACIÓN
Automatización de un proceso incluye control, documentación y evaluación. La

automatización permite la retroalimentación control. Proceso analítico tecnologías
32 11.
(PALMADITA) requerir la usar de automatización.
11.3 31
PALMADITA es descrito en otra parte en este libro (ver Capítulo 7). Este sección
describe ventajas de la automatización, diferentes sistemas de control y especificaciones
de hardware y software para sistemas de automatización cromatográfica desde el
desarrollo hasta las etapas de producción. La validación de los sistemas automatizados se
aborda en el Capítulo 7.
11.3.1 Ventajas de automatización
Hay muchas ventajas en la automatización de procesos cromatográficos. Estos incluyen:

disminución mano de obra costos, reducido proceso desarrollo tiempo, disminuido capital
costos, mayor reproducibilidad, aumentó fiabilidad, mejorado trabajar ambiente,
mejorado visión general y documentación mejorada.
Una de las razones más obvias para automatizar un proceso es reducir el costo de mano
de obra. Automatización posee la adicional ventajas de liberando competente personal
por menos tedioso tareas y reduciendo proceso desarrollo tiempo. Automatización aumenta
reproducibilidad y disminuye las pérdidas de lotes debido a un error del operador. La
confiabilidad se puede aumentar agregando puntos de control y controles automáticos.
alarmas; la operador sabe si la proceso es laboral adecuadamente. los se pueden mostrar
puntos de control y alarmas automáticas para permitir un acceso rápido a todas las partes
del proceso. Los procesos que necesitan estar en cámaras frigoríficas o higiénicas se
pueden controlar de forma remota, lo que mejora la laboral ambiente por la operador y
reduce la riesgo de contaminación. Para un proceso complejo, la automatización puede
mejorar la visión general del proceso con un esquema lógico pantallas, incluido
establecer y actual niveles de control parámetros Métodos, parámetros de proceso y otro
proceso información pueden ser almacenado automáticamente por cada proceso correr.
11.3.2 Control sistemas
Un sistema de automatización puede basarse en diferentes tipos de hardware de control,

por ejemplo, controlador dedicado, controlador lógico programable (PLC), sistema
basado en computadora personal o combinaciones de estos tres.
Dedicado control sistema

Este usos hardware optimizado por a específico solicitud. Este reduce la capital costo
porque solo pagas por lo que necesitas. El controlador es fácil de usar y está listo para su
instalación. los incorporado software es fácil a usar, es decir no programación habilidades
son necesario. los controlador dedicado pueden trabajar como a ser único o como a remoto
unidad en a computadora sistema. Una desventaja _ es que expansión posibilidades y
modificaciones pueden ser limitado. A dedicado El controlador tiene su lugar tanto en el
desarrollo de procesos como en las plantas de producción.
Programable lógico controlador sistema

El sistema PLC es un sistema general que se puede utilizar en cualquier tipo de
aplicación. el hardware es con frecuencia construido en a modular estilo asi que que la
usuario pueden cambio la control capacidad por simplemente agregando o reemplazando
módulos en la sistema. los SOCIEDAD ANÓNIMA sistema necesidades alguno
31 11.
preparación antes de que el sistema esté listo para su uso, por ejemplo, montaje de los
diferentes módulos. Además, una extensa programación es necesario. los SOCIEDAD
ANÓNIMA sistema pueden trabajar como a ser único o como a remoto unidad
11.3 31
en un sistema informático. Los sistemas de PLC utilizados en la producción deben

diseñarse para entornos de proceso.
Personal computadora sistema

Otro general sistema que pueden ser usó en ningún escribe de solicitud es la personal
sistema informático. A menudo, la computadora se comunica con una unidad remota, es
decir, un PLC o dedicado. Alternativamente, las interfaces de entrada/salida (E/S) se
instalan en la computadora o en una caja de interfaz con no inteligencia. En control
sistemas consistente de ordenadores conjunto con unidades remotas, estas últimas
controlan el proceso y la computadora documenta, evalúa y administra una o más
sistemas En la caso de E/S interfaces, la computadora sí mismo control S la proceso. En
este caso, la computadora deber tener software con multitarea y real tiempo capacidades.
Este Dia, vendedores pueden proveer software que posee sufrido años de extenso
desarrollo y es Listo por usar al llegada a la fabricación firma. Ahí son muchos software
programas disponibles que comunicar con laboratorio equipo, es decir computadora
paquetes con extremos frontales inteligentes.
Repartido control sistemas y redes

centralizado repartido control sistemas (DCS) son comúnmente usó Este Dia en plantas
farmacéuticas a control Procesando operaciones. Personal computadora (PC) basado de
supervisor controlar y datos adquisición (SCADA) paquetes son además siendo empleado.
Redes unidad Las operaciones y el empleo de paquetes de control estándar disponibles
comercialmente son cada vez más deseables en la industria biotecnológica [21].
11.3.3 Especificaciones de hardware y software
Las buenas prácticas de fabricación automatizada (GAMP) describen la documentación y

la validación de la construcción en un sistema durante las etapas de diseño y
especificación funcional (consulte también el Capítulo 7).
Las diferentes etapas de un proyecto necesitan diferentes tipos de automatización. En
la fase de desarrollo, por ejemplo, se necesita un sistema de automatización más flexible.
En producción, la confiabilidad es más importante.
los hardware especificaciones por un automatización sistema son básicamente la
mismo por desarrollo de procesos como para la producción. Cualquiera de los sistemas de
control anteriores podría cumplir con las especificaciones que se muestran en la Tabla
11.5 .
La capacidad de hardware requerida varía con la complejidad del proceso. En proceso
de desarrollo allá es a necesitar por expansión posibilidades, tiempo en producción la sistema
es a menudo fijo. Hay muchas señales que deben incluirse en el hardware. Estos se
muestran en la Tabla 11.6 .
los software especificaciones por un automatización sistema por proceso cromatografía
depender de cual escenario la proceso es en, es decir proceso desarrollo o producción. En
proceso desarrollo, el mismo sistema de cromatografía se puede utilizar para muchos
procesos diferentes y el métodos pueden variar a a estupendo medida. Muchos funciones
necesitar a ser incluido en la software (Tabla 11.7) .
31 11.
Mesa 11.5
Automatización por proceso desarrollo y producción sistemas: hardware
especificaciones Compatibilidad con entornos industriales Fluctuaciones de tensión

Estático electricidad
de alta electricidad ruido
niveles Humedad
Polvo, suciedad
Explosión prueba, dónde adecuado
Visualización de información relevante Estado de la válvula
Paso del
proceso Caudal
Presión
Monitor
señales
Diagrama de
flujo
Número de E/S (digitales y cosa análoga)
Documentación Impresora/trazador
unidad de CD
Puerto USB para datos transferir
Manejo automático de alarmas Diferencial presión sobre columnas y filtros
Niveles de alta y baja presión
Alto- y pH bajo niveles
Alto- y baja conductividad
caudales Caudales altos y bajos
Alto- y tanque bajo niveles
Detección de aire
Válvula Funcionamiento defectuoso
Monitor Funcionamiento defectuoso (especialmente
ultravioleta monitor lámpara) Documentación de
todas las alarmas
Mesa 11.6
Automatización por proceso desarrollo y producción sistemas: señal

especificaciones
Salidas
1–3 sistema zapatillas, cosa análoga
control 5–20 encendido, apagado
Entradas
1–2 caudal metros, cosa
análoga entrada 1–3
monitores, entrada analógica
De 10 a 40 entradas digitales para fines de alarma en sistemas de
producción De 1 a 2 entradas digitales por salida digital para
registrar
Lazos de control
1 proporcional integral (PI) control círculo por bomba
a
Para rutinas CIP automáticas y extenso colección de fracciones, este número de digitales aumenta la producción
dramáticamente.
11.3 31
Mesa 11.7
Automatización por proceso desarrollo sistemas: software funciones
Número flexible de entradas y salidas

Programación rápida por 'no experto'
Manual control de todos salidas durante a
ejecutar Documentación automática y
visualización de:
Caudal Velocidad
monitor de
presión señales
Estado de la
válvula
Evaluación de
resultados
Resolución
Economía
Mesa 11.8
Automatización por producción sistemas: software
requisitos Documentación del costo

Documentación de
rendimientos Fácil a usar
por operadores Análisis
de tendencias
Manual control
Seguridad, usuario definido acceso a diferente niveles de control
Documentación automática y visualización de:
Caudal Velocidad
monitor de
presión señales
Estado de la
válvula
Evaluación de
resultados
Resolución
Economía
En producción, la automatización es usó por a bien definido proceso. los software los
requisitos se muestran en Tabla 11.8. El sistema de automatización óptimo para la
cromatografía de procesos es un sistema que se puede utilizar en el desarrollo de
procesos, ejecuciones piloto y producción completa. Entonces se minimizará el tiempo
requerido para probar y evaluar el control del proceso.
En resumen, selección de cromatografía equipo requiere Cuidado consideración de las
necesidades por flexibilidad, documentación, fiabilidad, higiene, automatización y
validación. Después de establecer las especificaciones funcionales, químicas y de presión,
32 11.
se pueden seleccionar componentes o sistemas que cumplan con los requisitos de
laboratorio, planta piloto y producción. Las normas locales y nacionales, como las
relativas a los requisitos eléctricos y a prueba de explosiones, también deben ser evaluado
a asegurar cumplimiento. Para producción sistemas y incluso alguno piloto escala
Referenc 31
sistemas, la usuario debería trabajar con la proveedor empresa a asegurar que todos diseño
criterios son claramente definido. los usuario mayo incluso deseo a inspeccionar largo
diseñado sistemas a la sitio de montaje . Funcional pruebas (fábrica aceptación prueba,
GRASA) que la proveedor mayo llevar a cabo incluir bucle pruebas por conductividad,
caudal metros, pH, presión, fuga, ultravioleta, válvula y aire sensores Otro pruebas incluir
aquellos por alarma y reloj funciones, degradado actuación, presión/flujo, bomba y fuga.
Calibración debería ser realizado a la tiempo de entrega y la función crítica pruebas
voluntad ser realizado a comisión la sistema, es decir asegurar eso es en laboral ordenar.
Capacitación de operadores y Servicio ingenieros en la correcto usar y mantenimiento
normalmente tener lugar en el momento de la puesta en servicio.
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– 12 –
Columna Embalaje
12.1 INTRODUCCIÓN
Una columna empacada eficientemente es a menudo crítica para la purificación exitosa

de moléculas biológicas. El propósito de la separación (es decir, captura inicial,
purificación intermedia o pulido) como bien como la elución modo (es decir paso elución,
degradado o isocrático) voluntad influencia la requisitos por columna eficiencia. En
general, la menor la promedio partícula tamaño y la mayor que la cama altura, la más
crítico la embalaje se convierte en ordenar a completamente explotar el inherente beneficio
de pequeña partículas y largo camas Columna embalaje deberá no solamente proveer un
eficientemente lleno columna pero además a estable cama que voluntad no deteriorarse
tiempo extraordinario.
Para la purificación acuosa de moléculas biológicas, las columnas de cromatografía
estándar varían en diámetro de aproximadamente 5 milímetro a 2 metro. Columna
longitudes además variar, típicamente de 5 a 100 cm. En general, una relación de aspecto,
es decir, la relación entre el diámetro de la columna y la altura del lecho, no debe exceder
10 o eso mayo ser difícil a forma a homogéneo cama. Es más, líquido la distribución
puede ser un problema con una relación de aspecto muy grande, es decir, camas
demasiado cortas y anchas. Los sistemas de distribución de fluidos varían de un
proveedor a otro. Las propiedades físicas, así como las propiedades superficiales. de la
cromatografía resina voluntad además variar Entre tipos de resinas y este afectará _
columna embalaje. Claramente, allá pueden ser no una método por embalaje todos
columnas pero si el método es no suministrado por la vendedor allá son alguno general
principios que pueden ser aplicada en el desarrollo de un método de empaque.
12.2 TEORÍA
Muchos factores influencia la columna embalaje proceso y su Salir y teoría describiendo

el interacción de estas factores posee no aún estado completamente mapeado afuera [1–
5]. Por lo tanto experiencia y Saber cómo es importante por desarrollo de a apropiado
embalaje método. Sin embargo, hay algunos aspectos fundamentales que son valiosos en
el diseño de un método de empaque [6].
El primer requisito es obtener una buena dispersión de las partículas de resina en el tampón
de suspensión utilizado . por embalaje. Aditivos mayo tener a ser adicional a prevenir
partícula-partícula o interacciones partícula -columna-pared. Las interacciones partícula-
partícula dependen de la rugosidad de la superficie, la forma y superficie química y pueden
ser estudió por medición de la propiedades reológicas de la suspensión.
32 11.
321
32 12. Column
los actual embalaje de la homogéneo estiércol líquido es con frecuencia dividido

dentro dos pasos. los objetivo de la primero paso es a forma a homogéneo consolidado
cama. Este es logrado por resolver el partículas a a constante líquido velocidad, dónde
partículas son lleno adeudado a la viscoso arrastre del fluido. La velocidad elegida
depende de la rigidez del material y debe ser lo suficientemente baja para evitar la
deformación elástica de las partículas (ver más abajo). La fase de consolidación mayo ser
simulado usando computacional líquido modelos a varios niveles de detalle, donde
incluso el seguimiento de partículas individuales se ha investigado recientemente para el
ejemplo de tamaño de lecho pequeño de relleno [2, 5].
Después de haber formado el lecho consolidado, debe comprimirse para crear un lecho
estable que no se reorganice ni se comprima más si se usa dentro de la ventana de
operación establecida. La ventana de operación está determinada por la deformabilidad de
las partículas debido a la tensión del fluido. y la apoyo pared fricción (es decir pared
apoyo). Este compresión a la final La altura del lecho se puede lograr ya sea aplicando
una tasa de flujo alta y, por lo tanto, aumentando el arrastre viscoso sobre las partículas y
el lecho, respectivamente, o mediante compresión mecánica empleando un dispositivo
móvil. adaptador, asi que llamó axial compresión. los deformación de la cama por debajo
este El paso de compresión se ha descrito mediante la aplicación de la teoría elástica
basada en coeficientes como el módulo de Young, el módulo de corte y la relación de
Poisson además de la pared fricción coeficiente [1–4]. Estas mayo ser determinado, p.ej
por triaxial instrumento configuración pero eso es principalmente usó por vendedores y por
básico investigar por caracterización de la material [1]. los elástico teoría ilustra además la
fundamental diferencias Entre cama compresión por flujo y mecánico axial compresión:
Tiempo la axial compresión de la cama voluntad resulta en a uniforme compresión y a
uniforme vacío fracción sobre la longitud de la cama, la compresión _ por caudal y
viscoso arrastrar en la partículas voluntad resultado en a degradado de compactación y
vacío fracción, resultante en más alto compactación y más bajo vacío a la columna toma
de corriente dónde el exceso líquido es remoto. Este comportamiento es inherente a la
hecho que axial compresión de el lecho dará como resultado una compresión por parte de
la pieza final superior e inferior, mientras que el arrastre viscoso es ejerciendo a fuerza y
carga acumulando en dirección a la columna toma de corriente partida el lecho en la
entrada de la columna sin comprimir.
los viscoso arrastrar por la líquido velocidad voluntad compacto la cama y reducir la
fracción vacía entre partículas, a partir de la salida, lo que conduce a una reducción de la
permeabilidad y un aumento en la presión soltar. A más alto presión soltar voluntad en
giro causa más lejos compactación, lo que da como resultado el comportamiento de
presión-flujo no lineal que es característico de la compresión de a cromatográfico cama
por caudal (comparar Figura 12.1). De este modo, la la caracterización del
comportamiento de presión-flujo del gel es de suma importancia para desarrollar un
relleno método en caso que adecuado datos no poder ser obtenido de la vendedor. Ambas
cosas Para el objetivo de tal un experimental caracterización, pero además por la
embalaje de la columna por compresión de flujo, es esencial tener un buen control de la
velocidad de flujo y la caída de presión tanto en la columna como en el sistema para
lograr la compresión de lecho adecuada sin colapsar el lecho o incluso dañar el gel.
Después del empaque, se producirá una relajación de la tensión y la fracción vacía en
todo el lecho una vez que se lleve la pieza del extremo superior de la columna. dentro
lugar y la caudal posee estado detenido. Por eso, camas de elástico rosario comprimido
por la caudal método fueron fundar a dar uniforme camas como Medido por la uniforme
vacío fracción de la cama [6]. Si el lecho se ha comprimido con demasiada fuerza durante
12.3 Preparation of Column and 3
el paso de compresión, esta relajación puede verse perturbada por la generación de
canales o desplazamientos importantes en la estructura del lecho, lo que da como
resultado una baja eficiencia de la columna.
32 12. Column
Figura 12.1 Caída de presión sobre un lecho de cromatografía en función del caudal (línea
continua). Desviación de la punteado línea, representando la teórico presión soltar de ec. (10.16), es
adeudado a consolidación de la cama en la lineal parte y talón compresión resultante en decreciente
caudal canales en la mano derecha parte. los máximo caudal por este gel-columna-fluido
combinación es arbitrariamente establecer a 80% de el flujo a la inflexión punto, un , y es 1.0
ml/min. los laboral caudal Velocidad deber ser mantuvo sustancialmente más bajo que este, p.ej 80%
y este rendimientos a caudal Velocidad de 0.8 ml/min. Experimento realizado con Superose ™ 6
grado preparatorio (34 m agarosa reticulada) en un HR 10/30 (10 mm DI) columna. (Reproducido
de
l Hagel y t Andersson, j Cromatogr. 285 (1984) 299 por permiso de Elsevier.)
12.3 PREPARACIÓN DE COLUMNA Y SISTEMA
Además de la relación de aspecto y las técnicas de empaquetamiento compatibles

(empaque de flujo o compresión axial ) embalaje), importante información por cada
columna incluye su presión clasificación, materiales de construcción y químico resistencia
(ver Capítulo 11). A asegurar que la sistema no lo haré rendir excesivo contrapresiones o
que ningún presión límite de la resina establecer por la fabricante es no comprometido a
presión/caudal prueba de ambas cosas sistema y columna es realizado.
Antes de medir la curva de presión/caudal, se debe comprobar el sistema (y la
columna) para fugas los filtración prueba es realizado después montaje la columna y
auxiliar sistema, que incluye zapatillas, mangueras, calibres, válvulas y guarniciones. los
filtración prueba es típicamente realizado llenando la columna con agua y presurizándola
hasta su presión nominal y luego cerrando la entrada lado válvula, haciendo Por supuesto
no a superar presión clasificación. Después 1 minuto, la presión esta grabado y después la
medición es repetido después 30 mín. A pérdida de presión es indicativo de una fuga.
los columna sí mismo juntos con tubería y conectores significativamente influencias
presión. los presión soltar sobre la vacío columna es normalmente más alto a laboratorio
escala columnas y columnas destinadas a su uso con diámetros de partículas pequeñas, lo
que se debe a su pequeño diámetro
12.3 Preparation of Column and 3
tubería y líquido distribución dispositivos empleando fritas de bajo porosidad. La

temperatura mayo también influir la presión/caudal actuación adeudado a la influencia en
viscosidad (p.ej ver ec. (10.16)) y debe ser consistente con la utilizada para la columna
empacada.
Como delineado arriba, la conocimiento de presión soltar sobre la vacío columna y la El
sistema es esencial para el control adecuado de los métodos de relleno de columna que se
basan en la compresión del lecho por flujo. La caída de presión del sistema con una
columna vacía debe restarse de la del sistema con una columna empacada para obtener la
verdadera caída de presión sobre el lecho empacado.
12.4 EMBALAJE LA COLUMNA
Instrucciones por embalaje a resina en columnas con especificado diseños y dimensiones

son generalmente disponible del proveedor. Sin embargo, los usuarios pueden comprar la
resina de un proveedor y las columnas de otro. En este caso, las instrucciones de embalaje
completas no suelen estar fácilmente disponibles. En el caso de que las instrucciones de
empaque sean insuficientes o no den resultados satisfactorios, se puede intentar el
siguiente procedimiento general.
los pasos involucrado son; eligiendo embalaje solución, seleccionando estiércol líquido
concentración, fluido definitorio velocidad, presión o compresión factor por la embalaje
paso por a presión/caudal prueba del lecho consolidado y finalmente empaquetando la
columna.
12.4.1 Embalaje solución
La mayoría resinas son Enviado en 20% etanol, pero embalaje en este solución es
normalmente inaceptable a gran escala debido a preocupaciones a prueba de explosiones
y el costo de los solventes y su eliminación. En muchos casos, la etanol contenido pueden
ser reducido a sobre 10% por dilución con agua. un etanol concentración de 10% obras
bien en paquete en el lugar columnas y en axial columnas de compresión . Dependiente en
la escribe de resina y la escala de operación, la mejor embalaje el búfer puede contener
sal (p.ej 10–250 mm), o alternativamente a hidrofóbico solvente tal como etanol (p. ej.,
10 %) para reducir las interacciones partícula-partícula. Para algunos intercambiadores de
iones, se agrega sal a lograr óptimo embalaje. Si corrosión de inoxidable acero es a
problema (p.ej si soluciones quedan sobre noche) después No corrosivo aniones, p.ej
sulfato mayo ser útil. Alguno Las resinas de interacción hidrófoba se empaquetan mejor
en una solución de etanol al 10-20%.
12.4.2 Preparación de la estiércol líquido
los estiércol líquido concentración debería ser suficientemente alto a permitir la adecuado
Monto de resina a adaptar dentro la columna, juntos con ningún extensión de la columna
tubo que mayo ser usó para el relleno de columnas. Sin embargo, la concentración
generalmente no debe exceder el 70% para evitar que las partículas agregación y captura
de aire burbujas los la mayoría común estiércol líquido la recomendación es 50%, pero
eso pueden rango Entre 30 y 70%. los concentración de estiércol líquido es determinado
al dejar la resina, disperso en la embalaje solución, asentarse sobre noche y la establecido
32 12. Column
volumen de resina se ajusta al 100% de suspensión. Al empacar columnas con una gran
relación entre la altura del lecho y el diámetro de la columna (es decir , h / d 1), es
preferible un recipiente de las mismas dimensiones que la columna
12.4 Packing the 3
para la determinación de la concentración de lodo para tener en cuenta el impacto del

soporte de la pared. Si es necesario, la lechada se diluye con solución de empaque a la
concentración deseada. Para garantizar que se logre la altura correcta del lecho con el
factor de compresión correcto (ver más abajo), se debe transferir la cantidad exacta de
resina a la columna. El experimento de presión/flujo brindará orientación sobre la
relación entre el volumen sedimentado de la lechada y el volumen del lecho empacado.
12.4.3 Determinación de embalaje parámetros
Como delineado en la teoría sección la líquido velocidad adecuado por embalaje a no

rígido la resina es dependiente al muchos parámetros y por lo tanto la elástico
deformación deber ser probado mediante la ejecución la columna a o aumentó caudal
(cual es recomendado) y Registrarse la contrapresión o por creciente la presión y
Registrarse la resultante caudal. Este es típicamente se realiza agregando la suspensión
(como se preparó anteriormente) a la columna, montando el adaptador y ejecutando a
caudal degradado tiempo tomando nota la presión soltar. Tal un experimento pueden ser
visto En figura 12.1 por la ejemplo de a laboratorio escala columna y la máximo caudal
aplicable a esta configuración se puede estimar en 1.0 ml/min (es decir, 80% del flujo en
el punto de inflexión de la presión/caudal curva). En caso la cama es continuamente
comprimido durante este prueba, por ejemplo, como se observa por un aumento no lineal
continuo en la caída de presión también a bajo flujo, la prueba debe ser realizado usando
a paso a paso aumentar de caudal dejar la cama estabilizar, es decir alcanzando una caída
de presión constante, entre cada paso.
Tiempo la presión soltar sobre la cama y de este modo líquido velocidad son la revisado
parámetros _ por embalaje métodos establecido en cama compresión por líquido caudal,
eso es la la licenciatura de volumétrico _ compresión que es revisado en axial compresión
embalaje métodos. los compresión volumétrica es expresado como compresión factor,
cual es la relación de la volumen ocupada por la establecido o consolidado cama
establecer a la volumen de la lleno cama a su final cama altura. Si la óptimo compresión
factor por a resina es disponible de la vendedor, eso es directo a determinar la requerido
Monto de estiércol líquido y establecido cama volumen, respectivamente. En En la
práctica, el factor de compresión resultante de un método de empaquetamiento de flujo
optimizado suele ser muy cercano a a compresión factor que haría ser usó por axial
compresión embalaje. Por eso, la caracterización del lecho consolidado por las curvas de
presión-flujo como se describe anteriormente también se puede utilizar para desarrollar
un relleno de compresión axial midiendo la compactación volumétrica del gel durante el
transcurso del experimento. El factor de compresión encontrado en la caudal Velocidad
óptimo por la caudal embalaje método voluntad ser apropiado por controlador la relleno de
compresión axial , una compactación del 15% suele ser una buena pauta para las resinas
elásticas.
12.4.4 Embalaje métodos
Muchos embalaje modos y métodos existir y columnas mayo ser diseñado a ser lleno
utilizando uno o varios métodos. También existen métodos de combinación. Los métodos
utilizados principalmente son flujo constante, presión constante, succión, empaque en el
lugar y compresión axial. En principio, todas las columnas pueden empaquetarse
mediante los métodos de presión o flujo constante. Si el fabricante no proporciona ningún
32 12. Column
método de empaque, se sugiere un método de flujo constante o presión constante .
12.4 Packing the 3
En a constante caudal o presión método, la estiércol líquido en el interior la columna es

establecido y empacado usando a caudal de líquido de la parte superior a la abajo. los
mejor método es a dos pasos una, donde la resina se sedimenta primero a una velocidad
de fluido baja (por ejemplo, 30% del flujo máximo determinado en 12.4.3) a crear a
consolidado homogéneo cama. los cama es después comprimido al factor de compresión
correcto usando un flujo más alto, por ejemplo, 80% del flujo máximo o en el presión
correspondiente a este caudal. Este es la máximo operando caudal (o presión operacional)
por debajo ideal condiciones, pero con frecuencia la actual caudal (o presión) es más bajo
adeudado a por ejemplo, alta viscosidad de la muestra o eluyente (por ejemplo, si la
columna se ejecuta a una temperatura más baja).
En succión embalaje métodos, la estiércol líquido es lleno usando a bomba en la toma de
corriente lado de la columna . Normalmente, estas columnas utilizan depósitos de relleno
para acomodar el volumen total de suspensión. Succión embalaje es solamente aplicable
por suave resinas que requerir a bajo presión caer durante embalaje realizable por succión.
Paquete en el lugar métodos utilizar a boquilla que es insertado en la columna, lo que
permite la operación en un sistema cerrado mientras se bombea la resina en la columna.
los principal ventajas de la paquete en el lugar concepto son automatización, velocidad y
reproducibilidad cuando reempacar (y desempacar) la columnas Cuando utilizando la
concepto de empaque en el lugar para columnas con piezas finales fijas, las columnas se
empaquetan con una alta velocidad de suspensión y el exceso de líquido se elimina a
través de la salida mientras se forma y comprime el lecho. Otro concepto es el uso de una
boquilla de empaque en el lugar en una compresión axial columna. Aquí, la completo
estiércol líquido volumen pueden ser introducido dentro la columna por usar de la móvil
adaptador previo a correr cama consolidación y compresión por desplazamiento _ de la
adaptador en a segundo paso. Comparado a la paquete en el lugar columna con extremo fijo
piezas, la último columna concepto es más versátil y facilita camas lleno a mayor
homogeneidad y eficiencia.
12.5 EVALUANDO COLUMNA EMBALAJE CALIDAD
Es importante probar el lecho para verificar que la columna esté empaquetada de manera
eficiente. Se recomienda repetir periódicamente la prueba para garantizar la consistencia
de la eficiencia de la columna y el lecho. integridad. los prueba condiciones son muy
importante ya que a mal realizado prueba pueden Conducir a rechazo de a bueno cama.
Mucho énfasis deber ser poner en definiendo la especificaciones, y correlacionarlos con
el rendimiento de separación requerido, por ejemplo, una columna para elución por pasos
en la captura modo voluntad no requerir la mismo especificación de eficiencia como a
columna por elución isocrática en modo pulido. Sin embargo, una reducción significativa
en la eficiencia medida, la simetría del pico o la caída de presión pueden indicar que la
columna se está deteriorando y debe ser reparada. reempacado Como señalado en otra
parte en este libro (ver ec. (10.19)), la Medido eficiencia del lecho empacado depende,
entre otros parámetros, del tamaño de las partículas de resina, la calidad del lecho
empacado, la velocidad de flujo y el volumen de la muestra y la viscosidad del solvente.
Los dos métodos más utilizados para evaluar la calidad del relleno de la columna son el
método de pasos y el de pulsos, ambos son medidas de la distribución del tiempo de
residencia (consulte el Capítulo 10.7.2).
12.5.1 los paso método

32 12. Column
El análisis de la distribución del tiempo de residencia por un método de pasos es práctico

para los procesos de fabricación en los que se cambia la concentración de sal tampón. En
este método, la eficiencia
12.5 Evaluating Column Packing 3
es Medido por vigilancia la transición en conductividad como la buffer es cambió de bajo

a alto sal o vicio viceversa los forma de la curva es a paso parecido a frontal análisis. Este
análisis pueden ser realizado en proceso y lo hace no requerir suma de a separado muestra
hacia columna. Transición análisis es menos sensible a la externo volumen de la sistema;
por lo tanto , la resultados voluntad diferir de levemente de aquellos de la legumbres
método. Evaluación de a tiempo de residencia distribución curva es discutido en Sección
7.2 de Capítulo 10 En ordenar a aplicar este evaluación, eso deberá ser verificado que allá
es a lineal relación Entre la cambio en concentración de la sustancia trazadora y la señal
medida sujeta a la evaluación.
12.5.2 los legumbres método
El método más común para medir la eficiencia ha sido agregar un pulso, es decir, una
muestra estrecha zona, de a bajo molecular peso sustancia disoluta y después calcular la
valores por zona ampliando en términos de H (o HETP, altura equivalente a a teórico
lámina) y cima simetría ( A s , la asimetría factor). Cálculo de H es dado por Figura 10.9 y
la cálculo El factor de asimetría pico viene dado por la Figura 12.2.
Tradicionalmente, a legumbres de sodio cloruro, bencilo alcohol o acetona posee estado
usó por pruebas de ensanchamiento de zona y simetría de pico. Mientras que un monitor
ultravioleta (UV) se utiliza para detectar acetona y bencilo alcohol, sodio cloruro es
monitoreado usando a conductividad metro. Alternativamente, a muestra que contiene
concentrado equilibrio buffer mayo ser usó a prueba el embalaje, p.ej 0.8 METRO NaCl
en a solución de 0.4 METRO NaCl posee estado fundar a ser en general aplicable . Eso es
importante a ser consciente que, en alguno casos, sal mayo obrar recíprocamente con la
resina y dar erronea absoluto valores. Y acetona o bencilo alcohol mayo obrar
recíprocamente con alguno embalaje polimérico en tal a camino que zona ampliando ocurre.
Este Interacción pueden ser impedido por usando acetona en etanol como la prueba muestra
y 100% etanol como la móvil fase. Este es, sin embargo, solo realista cuando a firma es
correr a proceso en orgánico disolventes y es preparado a acuerdo con disposición,
explosión prueba y relacionado con el costo problemas. En suma, eso es imperativo que
si la acetona es usó su calidad es excepcionalmente alto a evitar contaminando la
columna con impurezas a veces fundar en laboratorio calificación acetona. Eso mayo ser a
bueno estrategia a prueba a pocos diferentes sustancias y eluyentes a asegurar que solvente
soluble interacciones hacer no causa falso resultados.
Figura 12.2 Cálculo de la simetría del pico, medida al 10% de la altura del pico. Un factor de
asimetría, como , _ 1 es llamó principal y indica canalización y si eso es 1, cual es más común, el
32 12. Column
pico es una cola y es típico para la dispersión por mezcla y las interacciones soluto-resina.
12.5 Evaluating Column Packing 3
Se recomiendan tres pulsos separados (es decir, inyecciones de muestra) para cada
empaque. La media valores por H y un s son más preciso ya que allá es con frecuencia
alguno variabilidad en muestra aplicación _ volumen y velocidad incluso con la mismo
sistema, además considerando que la lámina altura se calcula de la cuadrado de la Medido
cima ancho. En suma, señales de mejorando o disminuyendo cama actuación pueden ser
visto si resultados cambio por cada inyección. Un hacia arriba la tendencia puede indicar
que la cama necesidades más tiempo a estabilizar antes de la prueba es empezado.
Si H y un s son establecido en a pequeña escala, eso es importante a mantener en mente
que falta de El soporte de la pared a gran escala puede conducir a una menor calidad de
empaque que da como resultado columnas con menor eficiencia. Tiempo este mayo no
impacto un adsorción técnica tal como ion intercambio, podría resultar en la pérdida de
resolución en una técnica como la exclusión por tamaño.
En proceso cromatografía, eso es importante a mantener en mente que H y un s son
medidas que debería ser usó como instrumentos por comparando la embalaje calidad de
diferente un montón de resina y diferente columna tamaños y diseños y después por
calculador la reducido lámina altura, h (ver ecuación (10.11)). La eficiencia de la
columna, la simetría máxima y la caída de presión de la columna son útiles para evaluar
la calidad del empaque entre corridas, después de la limpieza y después del
almacenamiento. Un aumento significativo en la caída de presión puede indicar que la
columna está parcialmente obstruida o comprimida. los esperado presión soltar mayo ser
calculado de ec. (10.16). los condición de la columna también puede ser seguido
continuamente por análisis de distribución de tiempo de residencia en paso a paso buffer
cambios. Realista rangos que correlación con columna actuación (es decir producto _
pureza y recuperación) debería ser especificado (ver además columna calificación en
Capítulo 7).
Eso es además importante a reconocer que columna diseño posee a importante impacto
en la calidad de columna embalaje, y sistema diseño influencias la prueba resultados (ver
además Capítulo 11). correctamente diseñado columna entrada (por líquido distribución) y
toma de corriente (por líquido recopilación) proveer uniforme _ caudal a través de la cama
superficie resultante en uniforme embalaje densidades Durante pruebas de las entradas y
salidas de la columna empaquetada correctamente diseñadas minimizan el
ensanchamiento de la banda. H y A _ mediciones reflejar no solamente la calidad de la
embalaje en la columna pero la columna diseño y todos los componentes desde el punto de
entrada de la muestra de prueba hasta el monitor. Componentes (es decir , bombas, válvulas y
monitor células) y tubería diámetro y longitud contribuir a zona ampliando, cual Guías a a
pérdida de resolución. Para ejemplo, si la diámetro de la tubería es también grande en
relación a la columna Talla, zona extensión en la tubería voluntad degradar la producción
de un de lo contrario bien empacado columna. Cuando comparando la embalaje calidad de
en pequeña escala a columnas a gran escala , la influencia de extra columna componentes
deber ser tomado dentro consideración.
La expansión de la zona adicional debido al gran volumen de vacíos en el lecho se
observa cuando una columna no está densamente lleno y/o es no homogéneo Si, en la otro
mano, la cama es lleno también densamente, la caudal mayo ser canalizado y este voluntad
Plomo a zona extensión como bien. H no poder distinguir entre estas causas muy
diferentes. Pero la determinación de la simetría de los picos puede ser útil. Un un s valor
menos que 1 (principal cima) indica la cama posee estado lleno también estrechamente
causando canalización en la cama. Un un s valor mayor que que 1 (tiro cima) mayo ser
causado por presión de empaque insuficiente , aire debajo de la red de distribución u
obstrucción parcial de las redes o material de resina. en el otro mano, relaves mayo además
32 12. Column
indicar Interacción de la prueba muestra con la resina como discutido arriba. Si relaves es
no visto en la original prueba, pero eso aparece después un extendido tiempo y es no
aliviado por columna limpieza, eso mayo significar que la columna necesidades a ser
reempacado Después embalaje a columna y medición H y/o cima asimetría, eso es
recomendado que el lleno columna ser permitió a correr por a dado tiempo (p.ej durante
la noche) a sobre 80% de el embalaje caudal Velocidad y la mediciones de HETP y un s
realizado otra vez. Bastante frecuentemente,
12.6 Scale 3
25000
dp=5 m, L=25 cm
20000
dp= 10 m, L= 30 cm
15000
dp= 30 m, L= 60 cm
Plate
10000 dp= 75 m, L= 60 cm

dp= 110 m, L= 60 cm
5000
0
0.00
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00
Volumen de muestra relativo (%)
Figura 12.3 El efecto del volumen de la muestra en la ampliación de la zona medida, expresado
como eficiencia de la columna, N , calculado a partir de N L / H donde L es el largo de la cama.
Volumen de muestra en % del volumen del lecho.
el relleno de la columna se estabiliza y la eficiencia de la columna aumenta después de

haber funcionado durante la noche. Esto se puede repetir varias veces para evaluar la
estabilidad de la columna.
los contribución a zona extensión de muestra volumen es más importante cuando
utilizando resinas de pequeño tamaño de partícula. La Figura 12.3 ilustra la importancia
del volumen de la muestra cuando se mide la ampliación de la zona. Cuando se usa un
volumen de muestra superior al 1 % del volumen del lecho con resinas de alta eficiencia,
como las que se usan para la cromatografía de exclusión por tamaño y de fase inversa, es
posible que el valor medido no brinde información precisa. Bajo estas condiciones, el
empaque de la columna podría estar deteriorándose y no observarse al determinar H. _ En
la otro mano, por aquellos aplicaciones en cual columna eficiencia es no es crítico, el
volumen de la muestra es menos importante. Para obtener más información sobre la
influencia del volumen de la muestra en la dispersión por zonas, consulte Hagel [7].
Además a muestra volumen, la caudal Velocidad usó a medida zona extensión deber
ser especificado, ya que aumentó zona extensión voluntad ser visto como a resultado de no
equilibrio Entre los móvil y estacionario etapas adeudado a resistencia a masa transferir.
Este es influenciado por la velocidad de difusión del soluto y la distancia de difusión, que
está dictada por el tamaño de las perlas (ver ec. (10.10)). Eso mayo además ser señalado
que la difusión Velocidad es la temperatura dependiente. Finalmente, estándar operando
procedimientos por medición H y/o un s como bien como columna contrapresión deber
ser escrito en tal a manera que ellos son fácil a seguir y pueden ser repetido. A no ser que
estas mediciones son hecha en la mismo camino, la interpretaciones de la resultados son a
menudo engañoso. Este podría, por ejemplo, plomo a a decisión a reempacar a columna
que estaba
en hecho ejecutando como eso debería, debilitante tiempo y incluso causando producción
retrasos
12.6 ESCALA ARRIBA
Dado que el éxito de la ampliación depende, en la mayoría de los casos, del

mantenimiento de la altura del lecho, es importante medir con precisión la altura del
33 12. Column
lecho a pequeña escala. Desafortunadamente, las alturas de las camas usando columnas
de pequeña IDENTIFICACIÓN mayo dar un sobreestimar de la relación Entre cama
altura y volumen de gel para columnas a gran escala debido a la influencia de apoyo de
las paredes de la columna
12.6 Scale 3
por columnas de pequeña escala. Además, la pérdida de soporte de la pared puede

conducir a una mayor compresión del lecho al aumentar la escala. Recientemente se
describió una técnica independiente de escala para lograr lechos empacados de la misma
densidad, independientemente de los diámetros de columna de hasta 1 m [8].
Un esfuerzo a mejorar Gran escala columna embalaje consistencia usos elasticidad teoría
a predecir limites en móvil fase velocidad y presión soltar. Este Acercarse permite
definición de un predicho ventana de escalable columna operación como demostrado por a
número de resinas [9]. establecimiento escalable parámetros a pequeña escala permite
fabricación a implementar el proceso sin que reurbanizando eso. A teórico modelo por
cromatografía escala arriba usa un bidimensional modelo a describir compresión y
presión/caudal propiedades durante el estado estacionario caudal. Este modelo posee
estado usó a predecir Gran escala columna actuación usando
un limitado datos establecer de pequeña escala [10].
REFERENCIAS
[1] K. Östergren, Compactación, flujo y dispersión en una columna cromatográfica, tesis

doctoral, Universidad de Lund, 1997.
[2] X. Luo, NG Barton, KH Gebauer y AN Stokes, Simulación de formación de lecho empacado
en columnas de cromatografía, Actas de la WCPT Congreso Mundial de Partículas
Tecnología, Sídney, 2002.
[3] enfermero más entusiasta, JE Manival y EJ Fernández, Hacia a robusto modelo de embalaje y
aumento de escala para cromatográfico camas 1. Mecánico compresión. Biotecnología. prog.
20: 1146-1158, 2004.
[4] BG Tejo, j ureta, REAL ACADEMIA DE BELLAS ARTES Shalliker, CE Tambor y GRAMO.
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columna camas II—Modelado de la estrés: comportamiento de deformación. AICHE J. 49:
642, 2003.
[5] R. Hemph, J. Svensson, B. van Wachem y AE Almstedt, Simulaciones discretas de eluyentes
y validación experimental del empaquetamiento de partículas en una columna de
cromatografía de 5 mm, presentado en la Conferencia internacional sobre flujo multifásico,
Leipzig, del 9 al 13 de julio de 2007.
[6] UNA. Williams y L. Hagel, Exclusión por tamaño para análisis y purificación de
macromoléculas acuosas. En Columna manual por Talla exclusión cromatografía, C.-S. Wu
(editor), Académico Press, Nueva York, 1999, págs. 62–64.
[7] l Hagel, Efecto de muestra volumen en cima ancho en alto rendimiento gel filtración
cromatografía . J. Chromatogr. 324: 422–427, 1985.
[8] JS Moscariello, R. Henrickson, E. Rydholm y R. Hershberg, Una técnica rápida para
proporcionar un comportamiento de flujo de presión reproducible al aumentar la escala de las
columnas de cromatografía, resumen BIOT 48, presentación oral 232. Reunión Nacional de la
ACS, San Francisco, 10 al 14 de septiembre de 2006.
[9] RN Keener, EJ Fernandez y R. Hart, Uso de la teoría de la elasticidad para predecir los límites
de la fase móvil velocidad y presión soltar por fabricación escala columna operación, resumen
BIOT 421, Presentación oral Reunión Nacional de la ACS, San Francisco, 10 al 14 de
septiembre de 2006.
[10] JT McCue, j Weidner, C. Chu, UNA. Spann, NORTE. beckley y r Williams, Formulación y
aplicación de un modelo teórico para el escalado cromatográfico, BIOT 418, Presentación oral
Reunión Nacional de la ACS, San Francisco, 10 al 14 de septiembre de 2006.
33 12. Column
– Apéndice A –
simbolos y Definiciones en
líquido cromatografía
A.1 INTRODUCCIÓN
Durante el desarrollo de las diferentes técnicas de cromatografía líquida para la

separación y caracterización de solutos pequeños y grandes, las designaciones utilizadas
tienen, desde un punto de vista general vista, algunas veces dirigió a inconsistencias
Desafortunadamente, asi que lejos, no único La sugerencia para la nomenclatura de la
cromatografía líquida ha ganado total aceptación. Sin embargo, la propuesta de la IUPAC
a la que se hace referencia en la primera edición todavía parece proporcionar una buena
base para una nomenclatura general para la cromatografía líquida. La IUPAC [1, 2] hizo
una adición a esta nomenclatura con referencia a la nomenclatura para la cromatografía
no lineal. La propuesta de la IUPAC, en la medida de lo posible, se ha implementado en
este libro y forma la base para los símbolos y definiciones que se dan en la Tabla A1. Las
unidades dadas son las sugeridas por ISO [3]. Esto puede necesitar ser ajustado de
acuerdo a la escala (es decir, mientras que un volumen de muestra de l se utiliza para la
caracterización analítica de fracciones, L (litros) es una unidad más apropiada para la
alimentación a escala de proceso).
A.2 SÍMBOLOS USÓ EN CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
Mesa A1
Símbolos utilizados en líquido cromatografía
Parámetro Símbolo Ecuación a Unidad

Referencias Masa molecular relativa del soluto Mr
('molecular peso')
Coeficiente de difusión de soluto en D m 2 /seg [1]
solución libre
Coeficiente de difusión de soluto en D M m 2 /seg [1]
fase móvil
( Continuación )
331
33 Appendix A. Symbols and Definitions in Liquid
Table A1 (Continued )
Parameter Symbol Equationa Unit References

Diffusion coefficient of solute DS 2
m /sec [1]
in stationary phase
Axial dispersion coefficient DA m2/sec
Hydrodynamic volume of solute Vh ml [4]
Effective radius of solute R nm
Hydrodynamic (viscosity) Rh, Rvis (Vh 3/4 )1/3 nm
radius of solute
Stokes radius of solute RSt nm
Viscosity of solvent Pa s [4]
Intrinsic viscosity of solute [ ] [5]
Density of solvent kg/m3
Particle diameter dp cm, m [1, 4]
Pore radius rp nm [1]
Effective pore radius r nm
Break-through capacity of QB mmol/ml [1]
adsorptive bed g/ml
Maximum monolayer qm 10.28, 10.44 mmol/ml
capacity of bed
Ionic capacity of QV mmol/ml [1]
ion-exchange bed
Column inside diameter dc m, cm [1]
Column cross-sectional area Ac (dc /2) 2
m2, cm2 [4]
Column length, bed height L m, cm [4]
Column inlet pressure pi MPa [1]
Column outlet pressure po MPa [1]
Pressure drop over a packed bed p pi po, 10.16 MPa [1]
Void (inter-particle) V0 L, ml [1, 5]
volume of column
Volume of stationary phase VS L, ml [1]
in column
Hold-up volume VM L, ml [1]
Pore (intra-particle) volume Vi L, ml [5]
Extra-column volume Vext L, ml [1, 5]
Total liquid volume Vt Vt V0 Vi Vext L, ml [1, 5]
Geometric column (bed) volume Vc Ac L L, ml [6]
Specific permeability B0 d2 3/(180(1
pags )2) [1]
Interstitial fraction, inter-particle 10.16 [1]
porosity
Intra-particle porosity p
10.48
Tortuousity factor 10.48
Mobile phase flow-rate F l/h, ml/sec [1, 4]
Mobile phase (interstitial) velocity u F/( Ac) m/h, cm/sec [1, 4]
(Continued
A.3 Definitions of Chromatographic Parameters and 33
Mesa A1 ( Continuación )
Parámetro Símbolo Ecuación a Unidad Referencias

Móvil fase nominal velocidad tú n F/Ac m/h, cm/s [6]
Reducido móvil fase velocidad 10.12 [1]
Degradado Pendiente gramo
tiempo de retención tR h, s [1, 4]
Retencion (elución) volumen VR _ 10.4, 10.37 L, ml [1, 4]
Retencion factor k 10.3, 10.35 [1, 4]
Separación factor 10.6 [1, 4]
Distribución coeficiente KD 10.5, 10.17
Asociación constante k un 10.28
Disociación constante k re 10.29
Delantero Velocidad constante k1 10.50
Hacia atrás Velocidad constante k2 10.50
Entrada concentración de sustancia C0 10.51 prostituta
disoluta
Toma de corriente concentración de C 10.51 prostituta
soluto
Móvil fase concentración de CM _ prostituta
soluto
Estacionario fase concentración CS _ 10.32 prostituta
de soluto
Gel fase distribución coeficiente, K av ( VR _ V0 ) / ( Vc
constante V0 ) _
Exclusión límite V h, máx. Nuevo [5]
Méjico
Estándar desviación 10.7, 10.41 [1]
de un pico gaussiano
Cima ancho a base de wb _ 10.39 L, ml [1, 4]
un pico gaussiano
Cima ancho a mitad altura de ¿Qué ? 10.39 L, ml [1, 5]
pico de un pico gaussiano
Resolución factor Rs 10.1, 10.24 [1, 5]
Número de teórico placas, norte 10.9, 10.40 [1, 5]
número de placa
Lámina altura (HETP) H 10.7 cm, metro [1, 5]
Reducido lámina altura h 10.11 [1, 5]
Cima asimetría factor un s
a
Cifras se refiere a ecuaciones en el
Capítulo 10
A.3 DEFINICIONES DE CROMATOGRÁFICO PARÁMETROS Y

ECUACIONES
A s , se calcula a partir de los anchos de pico parciales al 10 % de la altura del pico como
b / a representando a el ancho de pico de la parte ascendente del pico y b de la parte
descendente del pico. Por lo tanto, un pico de cola tendrá A s 1 mientras que un pico
gaussiano tendrá A s 1.
, la separación factor expresa la pariente retencion de dos consecutivo picos, 1.
B 0 , la permeabilidad específica expresa la resistencia de una columna empacada al

3
flujo de la fase móvil. segundo 0 re 2 /(180(1 ) 2 ) y la caída de presión sobre la
p
columna empaquetada está teóricamente dada por pags tu n L / B 0 .
dp _ representa el diámetro de la partícula. Con frecuencia se utilizan diferentes
estimaciones de la distribución del tamaño de las partículas para expresar el diámetro de
partícula “promedio”. Las estimaciones incluyen la primera
momento de la peso distribución de partícula diámetros, número promedio partícula
diámetro y media armónica de la distribución.
representa la intersticial porosidad de la lleno cama. Este es determinado de la
relación entre el volumen entre partículas y el volumen geométrico total del lecho.
pags representa la porosidad de la cromatografía talón o partícula y es determinado de
la relación entre el volumen de poros y el volumen total de partículas.
g representa la pendiente del gradiente y se calcula a partir de ( X final X inicio )/ V
gradiente donde termina X y X comienzo son las condiciones de la fase móvil al final y al
comienzo del gradiente, respectivamente, y V gradiente es el volumen del gradiente. Para
IEC y HIC X es a menudo fuerza iónica y gramo expresado en m/ml, por RPC X mayo
ser % acetonotril y gramo es %/ml. En el cromatoenfoque X será el pH.
K D , el coeficiente de distribución (constante de distribución) es la concentración de un
componente en la fase estacionaria dividida por la concentración del componente en la
fase móvil. 0 K D por general cromatografía mientras 0 K D 1 por gel
filtración (cromatografía de exclusión por tamaño). Tenga en cuenta que el coeficiente de
distribución sugerido por la Ref. [1] es denotado como K c . Sin embargo, ya que este es
no en general usó la designacion K D se ha empleado a lo largo del libro. La relación K D
( VR _ V M )/ V S también es aplicable a la filtración en gel donde, por definición, V M V
0 y VS _ Yo _ (ver ecuación (10.17)).
K av es la gel fase distribución coeficiente calculado en gel filtración por ajuste la esta-
cionario fase igual a la talón volumen (es decir además incluido la matriz volumen en la
California-
culación, por lo tanto K av KD ) .
k , la retencion factor (algunas veces llamó la capacidad factor cual sin embargo debería ser
evitado ya que puede confundirse con la capacidad de adsorción) es la cantidad de soluto
en la fase estacionaria dividida por la cantidad de soluto en la fase móvil. La designación
k es sugerida por la Ref. [1]. Sin embargo k se utiliza en este libro para evitar
confusiones con k como símbolo de constantes de velocidad.
Señor _ es la pariente molecular masa de la sustancia disoluta y es adimensional los
designacion M w se usa para la masa molecular promedio en peso de una muestra de
polímero y, por lo tanto, debe evitarse para el uso tradicional como peso molecular de,
por ejemplo, proteínas. La designación MW para masa molecular podría considerarse
como una abreviatura de peso molecular. Sugerimos el uso
de g/mol en lugar de Daltons como unidad de masa molecular o el uso de la designación
adimensional, M r .
norte es la lámina número de la columna. Eso es calculado de un isocrático correr
por
norte 5.545 · ( V R / w h ) 2 suponiendo un pico gaussiano. VR y w h deben tener la misma
unidad, por ejemplo ml. Uno puede sustituir VR en la fórmula con t R , pero entonces la
unidad de w h debe ser el tiempo. N / L se utiliza para calcular el número de platos
teóricos por unidad de longitud de columna, a menudo normalizado a una longitud de
columna de 100 cm (es decir, número de placas por metro).
p , la caída de presión sobre el lecho empacado se da frecuentemente en bar, psi (
libras por cuadrado pulgada) o Pensilvania (Pascal). los número mayo ser convertido
por: 100 kPa (100,000 Pensilvania) 1 barra 14,5 psi.
Q V , la capacidad teórica en mmol de grupo ionogénico por volumen de

intercambiador iónico hinchado (forma H del intercambiador catiónico y forma Cl del
intercambiador aniónico).
Q B , es la descubrimiento capacidad, la dinámica Unión capacidad, de a cama a a dado
nivel de ruptura, obtenido experimentalmente al pasar una solución de un soluto
particular a través de la columna. La cantidad que ha absorbido el lecho cuando la especie
se detecta por primera vez en el efluente o cuando su efluente alcanza alguna fracción
arbitrariamente definida de la concentración de entrada, es decir , x , es la capacidad de
ruptura del lecho, Q B, x . Puede expresarse en milimoles o miligramos por gramo de
resina seca o por ml de volumen de lecho.
Rs , _ la resolución factor es determinado de acuerdo a a R s 2( V R2 V R1 )/( w b1 b2 )
_ siempre que VR2 VR1 . _ Para picos de forma gaussiana; wb _ 4 y wh _ (8ln 2) y el
factor de resolución se puede calcular a partir del ancho a la mitad de la altura del pico de
acuerdo con R s (2ln 2) · ( V R2 V R1 )/( w h1 w h2 ). Normalmente, picos en CEI
o RPC mostrar seguimiento y la relación no es válida. Por otro lado, la ecuación aún se
puede usar para estimar la resolución aparente entre bandas superpuestas para las cuales
el ancho de la base puede no ser calculado. Sin embargo, cabe señalar que el número
obtenido no es R s (a menos que los picos sean gaussianos y de aproximadamente el
mismo tamaño) y para enfatizar esto se recomienda que la cálculo procedimiento usó es
claramente fijado en la texto y que se utiliza otro símbolo, por ejemplo, R s(h) , para indicar
que el cálculo se realiza a partir de la mitad de la altura del pico.
, la tortuosidad factor es a geométrico factor a correcto por la actual, tortuoso, longitud
de
a poro en comparación con la longitud recta, no tortuosa .
t R , el tiempo de retención es el tiempo entre el comienzo de la elución y la aparición
del pico máximo. Para grandes volúmenes de muestra, el punto de inicio correcto se
establece en la mitad del volumen inyectado (ver V R ).
tu es la lineal velocidad de eluyente en la lleno cama o en a tubo. Este es expresado en
dis-
tancia por unidad de tiempo (p. ej. cm/min) en contraste con el caudal que se mide por la
cantidad de líquido entregado por unidad de tiempo (p. ej. ml/min). Tenga en cuenta que
el caudal lineal es un nombre equivocado y debería no ser usó. los velocidad mayo ser
calculado de caudal Velocidad por ti F /( una c ). Para a tubo 1. los calculado lineal
velocidad mayo ser más bajo que la velocidad local real debido a las trayectorias
tortuosas del flujo de un lecho empacado.
u n , la velocidad lineal nominal es la velocidad lineal en una parte de la columna que
no contiene relleno. Por lo tanto, esta es una medida artificial de la velocidad. Se utiliza
para comparaciones entre columnas de diferente diámetros cuando la entre partículas
porosidad es no conocido _ _ F / A c .
V ext es la externo volumen y incorpora la volumen contribuciones de todos sistema
componentes externos a la columna.
Yo _ es el volumen del líquido (fase móvil) que está estacionario en los poros del gel o
relleno sólido, es decir, el volumen de poro. En ciencias materiales la designación V p se
utiliza para el volumen de los poros. La relación V i / V 0 expresa el volumen de
separación máximo sobre el volumen de no separación en filtración en gel y se denomina
permeabilidad (no confundir con la permeabilidad específica, B 0 ).
V h , el volumen hidrodinámico de soluto es una propiedad eso es proporcional a [ ] Sr. _
_
Vh ,max , es el volumen hidrodinámico del mayor soluto que es capaz de penetrar en una
resina de cromatografía porosa, es decir, define el límite de exclusión de la resina.
VM _ es el volumen de la fase móvil del sistema que es detectado por el soluto bajo
condiciones no retentivas condiciones. Eso incluye ningún volúmenes contribuido por
la muestra inyector, la
detector y conectores [1]. Para solutos pequeños, esto es igual al volumen total de líquido,
V t , pero para moléculas grandes, por ejemplo, excluidas de la matriz, esto es igual al
volumen vacío, V 0 .
V 0 , la vacío volumen es la volumen de la móvil fase en la intersticios Entre la perlas
de gel o la sólido partículas contenido en la columna. Este es calculado de la cima vértice
de una sustancia totalmente excluida (elegida para evitar efectos secundarios de
exclusión). El verdadero volumen vacío se obtiene restando el volumen externo.
V R , el volumen de retención es el tiempo entre el comienzo de la elución y la
aparición de la cima máximo. En caso la muestra volumen es constante eso mayo
simplemente ser considerado como parte del volumen externo. En caso de que se varíe el
volumen de la muestra, el punto de inicio correcto se establece en la mitad del volumen
inyectado. En SEC es más frecuente hablar de volumen de elución, V e .
VS _ es el volumen de la fase estacionaria en la columna, es decir, el volumen de la fase
líquida estacionaria. Para filtración en gel V S es igual al volumen de poro, V i . V S / V M
se llama la relación de fase y a veces se denota .
vt _ es el volumen total de la fase líquida en el sistema. En RPC e IEC, esto a menudo
se indica como igual a VM bajo el supuesto de que los solutos son muy pequeños (ver VM )
. wb _ es el ancho de pico en la base, es decir, el segmento de la línea base interceptado
por las tangentes
dibujado mediante la inflexión puntos de la cromatograma.
¿Qué ? es la ancho de pico a mitad altura, es decir la longitud de la línea, dibujado
paralela a la línea de base, que es interceptada por el pico al 50% de la altura del pico.
Tenga en cuenta que el uso de w 1/2 ya que se desaconseja esta estimación (ver Ref. [1]).
es la viscosidad de la móvil fase o la muestra a ambiente la temperatura.
[ ] es la viscosidad intrínseca, equivalente a la viscosidad específica reducida a
dilución infinita.
REFERENCIAS
[1] LS Ettre, Nomenclatura por cromatografía (IUPAC recomendaciones 1993). Puro

aplicación química 65: 819–872, 1993.
[2] J.A. Jönsson, Nomenclatura para cromatografía no lineal (Recomendaciones IUPAC 1996).
aplicación pura química 68: 1591–1595, 1996.
[3] Cantidades y Unidades, YO ASI Estándares Manual, 3ro edn, Internacional Organización
de Normalización, Suiza, 1993.
[4] ASTM D 3016-78. Anual Libro de ASTM Normas, Americano Sociedad por Pruebas
and Materials, Filadelfia, 1978.
[5] ASTM mi 682-79. Anual Libro de ASTM Normas, Americano Sociedad por Pruebas
and Materials, Filadelfia, 1979, págs. 541–549.
[6] LS Ettre, La nomenclatura de la cromatografía. II. Cromatografía líquida. J. Chromatogr. 220:
29–63, 1981.
– Apéndice B –
adimensional Números
B.1 INTRODUCCIÓN
En ordenar a llegar a resultados que son en general válido, es decir no limitado a a

específico situación de medición , adimensional números son frecuentemente usó en
químico ingeniería. Alguno En esta sección se explican los números adimensionales que se
utilizan para la cromatografía líquida.
bi , Biot número expresa la relación de tiempo por película masa transferir a la tiempo
eso toma para que una molécula se difunda a través de la partícula cromatográfica ( cf. eq.
(10.46)). esta dado por
Kf _ r
Bi
Ds _
donde Kf _ es el parámetro de transferencia de masa de la película, r el radio de la

partícula y D s la difusión intrapartícula efectiva. Así si Bi 1 entonces se puede esperar
que la transferencia de masa de la película será limitante de la velocidad en comparación
con la difusión de poros y viceversa.
Pe , el número de Peclet se usa en un contexto diferente. Una es estimar la extensión
total de la dispersión axial para un modelo de tanques en serie. El número de Peclet se
calcula en este caso por
la
En
DA _
donde u es la velocidad de la fase móvil, L la eslora del buque y D A la dispersión axial

coeficiente ( cf. ec. (10.43)). Largo valores de Educación física indicar pequeña la
dispersión (p. ej., flujo de pistón en un recipiente) y los valores pequeños son causados
por una gran dispersión (p. ej., flujo mixto en un recipiente). La suposición de que el
retromezclado sigue una ecuación del tipo de la ley de Fick puede ser una simplificación
excesiva [1]. El número de Bodenstein, Bo , es idéntico al número de Peclet para un
reactor cerrado.
La dispersión axial local de lechos empaquetados también ha sido caracterizada por el
número de Peclet. En este caso el número de Peclet está definido por
tu p
Educación física
DA _
337
33 Appendix B. Dimensionless
donde la longitud característica ahora es el diámetro de la partícula, d p . Esta definición

del número de Peclet produce el transporte de masa relativo de solutos en la fase móvil
causado por convección, es decir, la velocidad de la fase móvil, en comparación con la
difusión. se puede notar que la Peclet número es muy similar a la reducido velocidad (ver
ec. (10.12)), es decir, suponiendo que la dispersión solo es causada por la difusividad del
soluto en la fase móvil (es decir, D A D M ) rendimientos pe _
El número de Peclet también se ha utilizado para expresar la relación de tiempo para el
transporte de masa de solutos a través de medios porosos por difusión molecular en
comparación con el flujo convectivo. los característica longitud es la longitud de la poro,
dado por dp _ , dónde es la tortuosidad, la dispersión se iguala a la difusividad del poro,
D S , y tiene lugar en tres dimensiones y el flujo intrapartícula es u i (ver ecuación
(10.49))
tu yo d p
yo _
12 D S
Para valores de Pe i 1 el transporte de masa por convección domina sobre la difusión.

Sin embargo, el cálculo de Pe i no es trivial ya que los datos precisos para el flujo
intrapartícula y la difusión restringida generalmente no son fáciles de obtener.
Re , la Reynolds número expresa la relación de inercial fuerza y viscoso fuerza. En
Re 100 domina la fuerza viscosa y el flujo a través de un lecho empacado es laminar o
viscoso. A un número de Reynolds alto, el flujo es turbulento, lo que interrumpe las capas
laminares y da como resultado un perfil de flujo de pistón [2]. El transporte radial de
moléculas está dominado por la difusión molecular a bajas Re y por la mezcla turbulenta
a grandes Re . El número de Reynolds está dado por
tu p
Re
dónde es la densidad y la viscosidad de la móvil fase.

SC , el número de Schmidt viene dado por [2]
Carolina del Sur

DM _
los Schmidt número es igual a Pe / Re y de este modo Rápido la relación de convectivo

a transporte de masa por difusión relacionado con la relación entre la fuerza inercial y la
viscosa del líquido.
Sh , el número de Sherwood es similar al número de Biot pero expresa el transporte de
masa en la fase móvil debido al transporte de masa activo (p. ej., causado por el flujo) en
relación con la difusión molecular. Está definido por
Kf _ dp _
Sh
DM _
Referencias 339
El parámetro de transferencia de masa de la película, K f , se puede calcular a partir del

número de Sherwood mediante la relación [3]
Sh 2 1.45
Resc 1 3
dónde es la cama vacío.

, el módulo de reacción de Thiele expresa la velocidad de reacción en comparación con
la difusividad intrapartícula y se calcula a partir de [4]
d 2 kq
p m
4CS
dónde k es el reacción directa Velocidad constante y q metro la sustancia disoluta capacidad de

la adsorbente.
REFERENCIAS
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[2] licenciado en Derecho Karger, LR Snyder y C. Horvath, Un Introducción a Separación
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[4] JA Berninger, RD whitley, X. zhang y N.-HL Wang, A versátil modelo por simulación de
reacción y dinámica de no equilibrio en procesos de adsorción de lecho fijo multicomponente.
compensación química Ing. 15: 749, 1991.
Este página intencionalmente izquierda vacío
– Apéndice c- _
Actividades para la producción
biofarmacéutica a partir de células
de mamífero modificadas
genéticamente
C.1 INTRODUCCIÓN
Una de la más confuso problemas es qué a hacer y cuando a hacer eso. En este cuadro,
nosotros proporcionar un resumen de las actividades y consideraciones críticas desde los
estudios de toxicología hasta la solicitud de licencia.
C.2 ACTIVIDADES CUADRO DE TOXICOLOGÍA

PARA LICENCIAR SOLICITUD
Actividad Para tóxico estudios Para INDIANA y Para la Fase 3 y Después

durante Fase 1 y 2 validación durante P3 validación/ pre-
BLA
Ensayos Todos validado un Todos validado un
Liberar Significativo Calificado/validado
La seguridad Calificado/validado Validado
Estabilidad Significativo Calificado/validado
carga Revisado Control a CGMP Control a CGMP Control a CGMP
biológica nivel nivel; establecer nivel; emplear
límites razonables acción limites o
corsé dentro de
predeterminado-
especificaciones
extraídas
Calibrar Instrumentos Instrumentos Instrumentos Mantener
calibración
calendario
( Continuación )
341
34 Appendix C. Activities for Biopharmaceutical

BLA
Caracterización Bancos de células: Crudo materiales; Caracterización/ Caracterización
mínimo las pruebas justamente buen calificación de puede continuar a lo
pueden ser entendimiento de proceso (robustez largo con esfuerzos
suficiente: producto y perfiles estudios); aumentó para desarrollar
esterilidad, de impurezas entendimiento de proceso mejoras
micoplasma, en vitro producto y para futuro
o si es apropiado impurezas; revisión implementación Los
PAM/HAP; banco celular gráficos de control
producto e caracterización pueden dictar dónde
impurezas: los más lejos la
ensayos son caracterización es
significativo necesario
Limpio todo b todo b Todo, validar Mantener validado
ensayos de limpieza limpieza; rutina
validación, validar vigilancia; revalidar
limpieza dación dictada por
cambios o aumento
conocimiento;
completo revisar (al
menos anual)
comparabilidad A tóxico material A tóxico y Fase 1 y A clínico material,
2 especialmente la
Fase 3
Cumplimiento c BPL BPF (calificado) BPF BPF
contaminantes _ unidad de empleo Mejor control Mejor control Mantener control
operaciones Prueba cosechas Prueba de
predicho minimizar por acuerdo a a ICH
contaminantes agentes adventicios Q5A una vez
con a el menos en proceso es finalizado
vitro prueba,
micoplasma y
biocarga
Definir Producto, Producto, Producto, Manténgase dentro
proceso, proceso, proceso, de la vali-
materias primas materias primas materias primas aceptación fechada
criterios para definir
producto, proceso, y
materias primas
Documento Todo Usar SOP; lote Validación Todo: formalizado
registros; escrito protocolos y y control de calidad
control de calidad validación plan aprobado;
responsabilidades Maestro aprobado mantenido
por control de
calidad
Equipo Calibrar, calificar Calibrar; califica- recalibrar y Plenamente
(debe ser de ción ejercicio re-IQ/OQ/PQ cualificado,
confianza) similar a abreviado cuando cambios mantenido; rutina
IQ/OQ/PQ para realizados calibración de
equipo critico (nota: acuerdo a POE
Fase 1 equipo no establecidos
probable para ser
usado en etapas
posteriores). definir
mojado materiales
Extraíbles Evitar (potencial a Evaluar potencial Utilice materiales Mantener proveedor

causar fallas tox ) antes de entrar húmedos dentro de auditorías y
estudios clínicos e ; definido límites; conciencia de
definir límites para realizar la liquidación cambios de
los que son estudios si es proveedor que
potencialmente pertinente podría impactar
dañino extraíbles
( Continuació
n)
34C.2 Actividades Cuadro de Toxicología a Licencia
Appendix C. Aplicación
Activities for Biopharmaceutical 343

BLA
Formulación Definir preliminar Poner en Refinar con Mantener
estabilidad por por dosis requisitos
lo menos la y más lejos
longitud de comprensión de
estudio clínico. estabilidad
Continuar
formulación Empezar final
desarrollo conformidad
lote estabilidad
(final de Fase
3)
impurezas Mayor: definido Mucho Aumentó Definido y
mejor comprensión; especificado
definición aplicación de limites
ensayos validados;
detectar y monitorear
la mayoría al 0,1% de
producto; todos sobre
1%; realizar riesgo
evaluación a
determinar necesario
nivel de detección f
Proceso Suficiente por definido pero Todavía mejorando Definido y
captura de API, mejorando; Hasta que mantenido Cambio
unidad de empleo necesitar no ser el finalizado después control.
operaciones previstas proceso final caracterización/ Desviaciones
minimizar esquema, estudios de investigado
contaminantes desviaciones robustez; grandes
investigado por raíz cambios después
causa; cambio inicio de la Fase 3
control son una mala idea.
Usar, cambio de
control;
desviaciones
investigado
Producto definido Aumentar Más lejos definido y reunión
comprensión aumentó especificaciones
comprensión
Producción Suficiente por tóxico y Suficiente por Suficiente por esencial Suficiente por
temprano
cantidad estudios de estudios clínicos y estudios clínicos, marketing;
formulación; mayor estabilidad y estudios de robustez, retencion muestras
retencion muestras por la mejora de procesos estabilidad, proceso-
comparabilidad estudios; mejora estudios;
comparabilidad comparabilidad
demostración; demostración;
muestras de muestras de
retención retención
Calificar Equipo abreviado Caracterización y
IQ/OQ/ PQ (escala ensayos
también pequeña compendiales
Para luego
desarrollo); crudo
materiales;
limpieza
Crudo definido Definir calidad Conoce a todos Auditoría
materiales atributos y especificaciones; vendedores;
especificaciones; comienzo validación volver a auditar
pruebas de de ensayos; periódicamente
identidad; comienzo proveedores de
estabilidad auditoría de crítico
evaluación para crudo materiales
algo crudo
materiales
( Continuaci
ón )

durante Fase 1 y 2 validación durante validación/ pre-
P3 BLA
Especificaciones Preliminar laboral Laboral Especificaciones Definido y
especificaciones especificaciones establecidas después especificaciones
de la caracterización/ reunió
estudios de robustez
Estabilidad comienzo Estudio cambiado Inicio forzado Mantener
estudios preliminar material/nuevo degradación de condiciones que
estudios de formulaciones en finalizado asegurar estabilidad
estabilidad estabilidad; asegurar formulación si está
estabilidad por justificado; asegurar
completo estudio estabilidad durante
clínico (concurrente ensayos clínicos
con programa
clínico)
Capacitación Crítico para fabricar En curso En curso
de clínico
materiales,
especialmente BPF
capacitación
Validar carga biológica impurezas toxicas Ensayos como Mantener validado
ensayos; ensayo eliminación, necesario debido a estado
de endotoxina específico cambios
eliminación de (p.ej esterilidad, en
impurezas (p. ej. vitro adventicio
Proteína A para agentes);
producción de aclaramiento viral si
MAb). Iniciar potencial para ser
limpieza viral impactado por
(normalmente 2 cambios; proceso
virus previo a la finalizado
Fase 1) validación; una vez
proceso finalizado
existe, realizar viral
estudios de
autorización para
solicitud de licencia,
Donde es importante
un
Excepto caracterización ensayos, cual debería ser significativo y calificado.
b
Considere desechables por tóxico y temprano clínico estudios a minimizar limpieza validación.
c
Riesgo evaluación voluntad dictar nivel de cumplimiento requerido por estudios clínicos .
d
Contaminantes definido como aquellos agentes no esperado a ser parte de proceso (p.ej adventicio virus).
mi
Vendedor datos mayo ser suficiente.
F
Estos números son solo estimaciones.
– Apéndice D –
Simulaciones Usando el software
suministrado
D.1 INTRODUCCIÓN
Muchos de la fundamental ecuaciones describiendo teórico relaciones de cromatografía

se describieron en el Capítulo 10. Información sobre cómo los diferentes parámetros
pueden afectar el resultado final pueden ser logrado mediante simulaciones y por lo tanto
a número de seleccionado Las aplicaciones se suministran en un CD, que se entrega junto
con este libro. El CD está destinado a ser utilizado como ayuda didáctica para facilitar el
proceso de divulgación de las relaciones que rigen la cromatografía. separaciones.
Innecesario a decir, la resultados previsto por la ecuaciones en el CD son no más preciso
o de confianza que la básico ecuaciones permitir y deber por lo tanto no ser considerados
como datos verdaderos. Al igual que con otros tipos de software, los resultados deben
confirmarse mediante experimentos.
Aplicaciones suministrado en
CD
Expediente nombre Ecuación Descripción
Presión soltar (10.16) Presión soltar sobre a lleno cama
Muestra volumen (10.19) Influencia de volumen de muestra en la
ampliación de la zona
Resolución en SEGUNDO (10.20) Resolución en exclusión de tamaño
Resolución en IEC RPC HIC (10.1) Resolución en cromatografía de adsorción
isocrático separación (10.51) Simple simulación de un lineal separación
isocrática
Rendir y pureza Parcelas la rendir y pureza como función de
resolución
Langmuir isoterma (10.32) Adsorción isoterma, tipo Langmuir
D.2 CÓMO A USAR LA ¿SOFTWARE?
En ordenar a correr las aplicaciones tú deber tener un basado en PC versión de Microsoft®

_
Sobresalir.
(1) comienzo Microsoft Excel.

(2) Insertar disco.
345
34 Appendix D. Simulations Using the Supplied
(3) Para ejecutar las aplicaciones; abra el archivo específico (nombre de archivo como
se indica en la tabla anterior).
Cada solicitud es dividido dentro Información y Cálculo .

Información proporciona información básica sobre el contenido de la aplicación, cómo
ejecutar la aplicación, las ecuaciones utilizadas para el cálculo y los derechos de autor.
El cálculo es donde se insertan nuevos datos, se realiza el cálculo y se obtiene un
informe impreso.
comienzo por entrando la valores por la Variables tú desear a estudiar en Cálculo. los
Para cada variable se introduce el valor máximo y mínimo para el cálculo, así como el
valor fijo utilizado para los cálculos de otras variables. Tenga en cuenta que este valor
fijo se puede elegir a ser fuera de de la rango seleccionado por máximo y mínimo valor.
Solamente datos en los campos verdes en el cuadro se va a cambiar (para evitar la pérdida
de información el documento esta protegido).
Los resultados son inmediatamente dados por los gráficos que ilustran los resultados en
función de los diferentes valores de entrada. Se obtiene una impresión de un lado de los
resultados presionando el símbolo de impresión. Es posible que sea necesario ajustar el
tamaño del área de impresión cambiando la escala de el formato de impresión para que
se ajuste al tamaño del papel utilizado.
Información con respecto a la CD y cómo a usar eso son además fundar en la
expediente LÉAME.TXT en el CD.
D.3 PRESIÓN SOLTAR
Esta aplicación calcula la resistencia al flujo de un lecho empacado e imprime un informe

de los resultados.
D.3.1 Cálculos
La caída de presión se calcula a partir de la ec. (10.16)
L
pags tu n 180(1 )
2 2
dpag
s
3
dónde estás ? nominal es la velocidad de la fase móvil, la fracción vacía, V 0 / V c , L la

longitud de la lleno cama, dp _ la partícula Talla (esférico partícula forma es ficticio)
y
la solvente viscosidad (0.001 Nseg/m 2 por H2O _ _ a 20 C).
Un gráfico que ilustra el parámetro de resistencia al flujo, 180(1 ) 2 / 3 , en función de
también se da. Esto es útil para comparar la permeabilidad de lechos empacados de
diferente densidad de empaque. los largo cambio de caudal resistencia por a pequeña
cambio en vacío fracción a bajo ¡Pueden notarse fracciones vacías!
La caída de presión sobre los componentes del sistema no está incluida en la ecuación
anterior. Los efectos del sistema pueden ser sustanciales a altas velocidades y pueden
verificarse pasando el eluyente a través de una columna vacía.
D.4 Sample 3
D.4 MUESTRA VOLUMEN
Esta aplicación calcula la influencia del volumen de la muestra en el ancho del pico, el
número de placa e indirectamente la resolución, en elución isocrática e imprime un
informe de los resultados. Resultados son inmediatamente dado por la gráficos ilustrando
la influencia de muestra volumen en función de los diferentes valores de entrada.
D.4.1 Cálculos
El ancho del pico se calcula a partir de las ecs. (10.19), (10.10) y (10.8) de la altura total
de la placa, H
H inyector H columna H
V 2
L
2 d (0,6 D M D S ( VR _ / V 0 1)) V0  V0 2
2 1 tud
K V
muestra 2p _
inyector R
uVR __ VR pags
30D _
S
 _ 

donde V muestra es el volumen de muestra aplicado, L la longitud de la columna, K inyector

una constante dependiente del inyector, un factor dependiente del empaquetamiento
geométrico, d p el diámetro de la partícula, D M la difusividad del soluto, D S el
coeficiente de difusión de poro restringido , VR el volumen de retención, V 0 el volumen
vacío entre partículas yu la velocidad de la fase móvil.
los aporte parámetros que son necesario por la cálculo son la móvil fase volumen VM _
(aquí VM _ vt _ ), ya sea el volumen de retención VR o el factor de retención k (si k no
se le da es calculado de VR , _ VM _ y Yo _ / V 0 ), la difusión coeficiente D M , o la pariente
molecular masa Señor , _ si la sustancia disoluta es a globular proteína (es decir si DM _
es no dado eso es calculado de la masa molecular por la relación aproximada D M
r
260M _ 1/3 , que es aplicable a las proteínas globulares), y la constante del inyector (que
es cercana a 5 para los inyectores de laboratorio,
para grandes volúmenes de muestra, la constante tiene un valor más alto, por ejemplo,
cerca de 12). Los parámetros variables son el volumen de muestra, el tamaño de partícula,
la velocidad de la fase móvil, la fase relación de poro volumen sobre intersticial volumen,
Yo _ / V 0 y la columna longitud. los el valor fijo del volumen de la muestra se da como %
del volumen del lecho.
los la altura de la placa se convierte al ancho del pico con la ayuda de la ec. (10.8).
Los resultados aclaran la influencia del volumen de la muestra en el ancho total del
pico en comparación con la contribución de solo la columna (es decir, con un volumen de
muestra infinitamente bajo). Otro gráfico útil es el efecto sobre el número de placas. Aquí
esto se da como N / N máx . que muestra el número de placas medido en un determinado
volumen de muestra en comparación con el número de placas en un volumen de muestra
infinitamente bajo. El grado de 'pérdida' El número de placas depende del tamaño de las
partículas, el volumen de poros del medio de cromatografía, la longitud de la columna y
la velocidad de la móvil fase. los influencia en columna longitud es calculado asumiendo
a constante cama volumen, es decir la columna lámina número aumenta con columna
longitud y así también aumenta la influencia relativa de un cierto volumen de muestra. El
efecto de la velocidad seguirá el gráfico de van Deemter y, por lo tanto, se verá afectado,
por ejemplo, por el coeficiente de difusión del soluto (consulte la ecuación (10.10)).
D.4 Sample 3
los efecto en coronilla número mayo ser convertido a resolución Entre la picos con
ayuda de la ec. (10.1) declarando que la resolución factor es proporcional a la cuadrado
raíz de la lámina número _ (p.ej a reducción en N / N máx . de 1.0 a 0.9 da a reducción en
resolución factor por 5%).
D.5 RESOLUCIÓN EN SEGUNDO
Esta aplicación calcula la influencia de diferentes variables sobre la resolución en la

filtración en gel (cromatografía de exclusión por tamaño) e imprime un informe de los
resultados.
Los datos para explorar la influencia de los parámetros pueden tomarse de la hoja
denominada Datos típicos . Esta hoja proporciona un cálculo del coeficiente de
distribución del volumen de retención según K D ( VR _ V 0 )/( V t V 0 ), véase la ec.
(10.17). El radio de las proteínas globulares se puede calcular a partir de la masa
molecular y la pendiente de la selectividad
curva se puede estimar a partir de dos solutos.
D.5.1 Cálculos
los se calcula la resolucion de la ecuación

(10.20)
1 b  L 
Resolución
R2 Iniciar
sesión
 
4   R 1   ( V0 _ Yo _ H  
  
 
KD _ )  
donde R es el radio de la molécula, b la pendiente de la curva de selectividad (d K D /d log

R ), Yo _ el volumen de poro intrapartícula y V 0 el volumen vacío entre partículas, K D es
la distribución promedio coeficiente (aquí este es establecer igual a la valor de
'Distribución coeficiente'), L la altura del lecho y H la altura media de la placa. La altura
de la placa se calcula para 'Solute2' a partir de la ecuación de van Deemter (ecuación
(10.10)) asumiendo que la relación entre el tamaño y la difusividad para las proteínas es
aplicable.
D.6 RESOLUCIÓN EN IEC, RPC Y HIC
Esta aplicación calcula la resolución entre dos solutos en cromatografía de elución

isocrática. y huellas dactilares a reporte de la resultados. Resultados son inmediatamente
dado por la gráficos que ilustran la resolución en función de las diferentes variables.
D.6.1 Cálculos
los resolución factor es calculado de ec. (10.1)

k 2 k 1 12
R 2(2 k 2  k 1  ) N
s
D.7 Isocratic 3
donde k es el factor de retención y N el número de platos de la columna. la retención el

factor para el soluto 1 se calcula a partir del factor de selectividad, , con ayuda de la
relación
k 2 /k1 .
D.7 ISOCRÁTICO SEPARACIÓN
Esta aplicación simula una separación de una mezcla de hasta cinco componentes en
modo isocrático lineal.
D.7.1 Entrada de parámetros
comienzo por entrando la valores por la componentes en 'Fijado parámetros por la

solutos'. Los campos de entrada de datos son de color verde, mientras que los campos de
resultados son de color amarillo brillante. Puede ingresar el volumen de retención, VR o el
k de los solutos ( k se utiliza en el cálculo para permitir variaciones en el volumen del
lecho y, por lo tanto, se calcula a partir del volumen de retención y el volumen de la fase
móvil, VM _ o vt , _ si no explícitamente dado. De este modo VM _ deber ser fijado juntos
con VR _ _ Un aproximación de VM _ es dado de la columna datos en la segundo entrada
mesa). Tú mayo ingresar la difusión coeficiente, D M , o la pariente molecular masa por
globular proteínas, Señor _ (de este modo, si tiene otros solutos además de proteínas
globulares, debe ingresar el coeficiente de difusión y no usar la conversión incorporada
entre masa molecular y difusividad).
los segundo entrada mesa contiene la correr parámetros que mayo ser interesante a
estudiar. El tamaño de partícula, la velocidad superficial y la longitud de la columna
pueden alterarse para ver efectos en la columna zona ampliando los muestra volumen
pueden ser cambió a estudiar contribución de los efectos extra-columna (el volumen de la
muestra en relación con el volumen del lecho se calcula mediante la programa). los cama
volumen necesitar a ser equilibrado si la columna longitud es cambió y el diámetro de la
columna debe permanecer constante. La fracción de poros V i / V 0 ilustra los efectos de la
cromatografía medios de comunicación de diferente intra-partícula porosidad.
Finalmente, lambda mayo ser usó para simular la influencia de cómo bueno la columna es
lleno (lambda 0.6 corresponde a una columna excelentemente empaquetada, 1.6
puede obtenerse para una columna aceptable mientras
4.6 indica que la columna es no aceptable).
En ordenar a obtener a gráfico de lo más alto posible resolución la rango por la cálculo
necesitar para ser ingresado en la tercera tabla de entrada.
Los resultados se muestran inmediatamente en el gráfico que ilustra el cromatograma
simulado. También se da la resolución entre solutos sucesivos. Se obtiene una copia
impresa de los resultados presionando el símbolo de impresión.
D.7.2 Cálculos
los zona ampliando es calculado de ec. (10.10) y expresado por la lámina altura, H
H 2 d 2(0,6 D M D S ( VR _ V 0 1)) V0  V  2 tu
  0
PU
V_ V _1  pags d30D _
35 Appendix D. Simulations
R UsingR the Supplied
S
D.7 Isocratic 3
dónde , lambda, es un factor geométrico dependiente del empaquetamiento, d p el tamaño

de partícula, D M la difusividad del soluto, D S el coeficiente de difusión de poro
restringido , VR el volumen de retención, V 0 el volumen vacío entre partículas y u la
velocidad de la fase móvil.
los la curva de elución es entonces simplemente calcula con ayuda de la ec. (10.51).
Para las proteínas globulares, el coeficiente de difusión se calcula a partir de la masa
molecular relativa, M r , mediante la relación aproximada D M 260M _ 1 3 .
r
D.8 RENDIR Y PUREZA
Esta aplicación calcula la influencia del factor de resolución en el rendimiento del

producto como una función de requerido pureza de la producto a diferente alimento
pureza y huellas dactilares a reporte de Los resultados. Los resultados se dan
inmediatamente por el gráfico que ilustra la relación entre el rendimiento en varios
requisitos de pureza. El rendimiento para niveles opcionales de pureza se interpola a
partir de los datos y se presenta en una tabla.
D.8.1 Cálculos
En este solicitud eso es ficticio que la elución picos tener gaussiano formas y que el
cima anchos son la mismo por la dos picos (es decir ya que ellos son eluir bastante
cercanos entre sí). En aras de la simplicidad, se supone que la impureza se eluye en el
segundo pico.
los picos de elución son simulados de
 1  ( V V )4  2 
C CoEXP 
R
  
⎝2 wb  _  
donde VR _ es el volumen de retención del objetivo, V el volumen de efluente y w b e l

ancho del pico .
El rendimiento y la pureza del primer pico en función del volumen de efluente se
calcula a partir de la simulado picos Eso pueden ser observó que si la concentración
relación de la dos picos es 1/10 la pureza mínima que se alcanza es 91%, es decir 10/11
(igual a la alimentación).
Para juzgar la relevancia de los parámetros elegidos, se calcula el número de placa para
el pico principal y el volumen de retención para la impureza.
El factor de resolución para diferentes condiciones experimentales se puede calcular a
partir de las aplicaciones Resolución en IEC, HIC y RPC o Resolución en SEC (ver
arriba).
D.9 LANGMUIR ISOTERMA
Esta aplicación calcula la concentración de soluto adsorbido como monocapa en función

de los parámetros experimentales e imprime un informe de los resultados.
D.9.1 Cálculos
los cálculo es establecido en la langmuiriano adsorción isoterma dado por ec. (10.32)
kA
C C q
SM _ metro
C
METRO A
donde CS _ es la concentración de soluto adsorbido, C M la concentración de soluto en la

fase móvil, q m la capacidad máxima de la resina cromatográfica para el soluto y k A la
constante de asociación del soluto.
los resultados consiste de a hipotético Langmuiran adsorción isoterma, a grafico de CS _
en función de la constante de asociación (para ilustrar la influencia de k A sobre la
eficiencia de sorción a diferentes C M ) y un gráfico de C S en función de la capacidad de
la cama (para mostrar el exceso capacidad necesario a lograr a objetivo adsorbente
capacidad como a función de k un y C M ) además de dos gráficos que ilustran la variación
de la función de distribución.
D.10 SOBRE ESTE SOFTWARE
Este es un software no comercial que se suministra de forma gratuita con el libro titulado
'Manual de cromatografía de procesos, desarrollo, fabricación, validación y economía.
2do Edición, l Hagel, GRAMO. jagschies, y GRAMO. más suave, Elsevier 2007'. los El
software es una herramienta de tutoría y los resultados se interpretan y utilizan por cuenta
y riesgo del usuario. Las sugerencias de mejoras son bienvenidas y pueden enviarse al
autor.
El software está protegido por la ley de derechos de autor. Con la compra del libro se
obtiene una licencia no exclusiva para utilizar el software con fines no comerciales.
Autor: Lars Hagel, GE Healthcare Bio-Sciences AB, Departamento de I+D, S-75184
Uppsala, Suecia.
Fecha: enero 31, 1997 y 2007
Derechos de autor 1997, 2007 Lars Hagel y GE Cuidado de la salud Biociencias AB.
En ningún caso, GE Healthcare será responsable de ningún daño que surja del uso de o
incapacidad a usar la software, excepto como expresamente previsto por por aplicable
leyes
D.10 About this 3

Tema Índice
acelerado estudios, 134
asociación constante, 113
aceptación criterios, 173
asimetría factor, 172, 327
aceptación criterios por resinas de
automatizado cromatografía sistemas, 311–312
cromatografía, 165
relleno de columna automatizado, 308
aceptación límites, 74
automatización, 24, 299–300, 314–316
activo farmacéutico ingrediente (API), 41, automatización, ventajas de, 315
164, 178, 184
automatización hardware y software, 306
acilación, 51 compresión axial, 322
adaptador, 308–309 axial presión soltar, 306
adsorción, 267
adsorción isotermas, 269 retromezclado, 304
adsorción técnicas, 305 contrapresión, 181
afinidad cromatografía (C.A), 34, 210, 265 bacteriano crecimiento, 309
resinas de afinidad, 181 bacteriófagos, 138
afinidad resina costos,
costo del lote, 200
193
lote ciclismo, 211
agregación, 51, 129, 136–137
lote documentación, 312
aire sensores, 314
lote fracasos, 78
aire trampa, 314
lote frecuencia, 24, 27, 37, 203
alarma función verificación, 170
tamaño de lote, 25
niveles de alarma, 312
tiempo de lote, 24
alarmas, 300
lote a lote variabilidad, 20, 56
análisis de aminoácidos, 129
cama compresión, 322
aminoácidos, 220, 224
cama apoyo, 306
análisis, 219, véase también
bencilo alcohol, 157
ensayos costes analíticos, 193
unir-eluir modo, 67
analítico métodos, ver
bioensayo, 134
ensayos
carga biológica desafío estudios, 155
analítico ultracentrifugación, 129–130
pruebas de biocarga, 174
derivado de animales materiales, 165
carga biológica, 132-133, 139, 163, 174, 180
anión intercambio cromatografía, 67, 181, 196
biogenéricos, véase biosimilares
intercambiador de aniones,
biológicos actividad, 31, 47, 54
98, 173 anual producción
biomasa, 23
necesitar, 32
productos biofarmacéuticos, 6–7, 26
anticoagulación factores,
biorreactores, 29
26
bioseguridad riesgos, 23
antiespumante agentes, 131-132, 165
biosimilares, 13, 140, 191, 195
antichorro dispositivo, 308
vacío carreras, 149, 178
API, ver activo farmacéutico procesamiento
encefalopatía espongiforme bovina
aséptico de ingredientes, 163
(BSE), 153
ensayo validación, 164
entre paréntesis por equipo
ensayos por monoclonal anticuerpos, 135
validación limpieza, 178
ensayos, 127, 129, 174, 178, 183
limpieza validación, 179
potencia, 164
pureza, 164
353
35 Subject
descubrimiento capacidad, 282

caracterización, 127, 161, 165, 173, 221, 226,
buffer concentrarse, 212
230, 232
buffer consumo, 211
químico y físico especificaciones, 308
buffer costos, 197, 211 resistencia química, 302, 310
buffer dilución, 312 químico especificaciones, 300
buffer intercambio, 92 químico pruebas, 166
buffer tanques, 178 químicamente equivalente agregados,
tampones, 25, 68, 183, 205, 300, 308 129 células CHO, 3, 49
sustancia farmacológica a elección del organismo de producción,
granel, 41 a granel 24 elección de la tecnología, 19
impureza eliminación, 198 cromatografía columnas, ver columnas
cromatografía resinas, 19, 33, 86, 208–209
calibración, 169, 183, 319 CIP, ver limpieza en el lugar
campaña de producción, 197 circular dicroísmo, 130
capacidad del proceso, 23 aclaración, 82
capacidad, 21, 53, 90, 113, 197, sobrenadante de cultivo celular clarificado,
203 limpieza 208, 147–148, 164, 175, 177–178,
capacidad utilización, 90 310, 312
electroforesis capilar (CE), 127 automatizado, 312
electroforesis en gel capilar (CGE), 136 contacto tiempo, 178
enfoque isoeléctrico capilar (CIEF), 129 tiempos de espera antes de,
capilar zona electroforesis (CZE), 129
178 limpieza y desinfección,
bienes de capital, 202 197 frecuencia de limpieza,
captura, purificación, pulido, 63 149
paso de captura, 34, 66 limpieza método desarrollo, 177
carbohidrato fuga, 176 protocolo de limpieza, 149–150
a base de carbohidratos vacunas, 130 limpieza reactivos, 66, 68, 147, 150,
Continuar, 148-149, 177, 180 152, 208
categorías de riesgos, 56 limpieza validación, 148, 164, 177,
catión intercambio, 176, 181
182, 197
catión intercambiadores, 98
ensayos por, 179
causa efecto relaciones, 73
limpieza en el lugar (CIP), 68, 151, 209,
cultivo celular, 6, 165 300,
célula escombros, 53 304, 310
célula densidad, 31 autorización estudios, 131, 183–
lisis celular, 48, 72 184 clínico prueba fabricación,
célula eliminación, 42, 53 148 ensayos clínicos, 28
cultivo de células lote coagulación factores viii y IX, 2
tiempo, 205 medios de fraccionamiento de Cohn, 2
cultivo celular, 193 columnas, 37, 306, 308
cultivo de células proceso, 82 columna espalda presión,
centrifugación, 82 304 costo de columna, 308
hidroxilapatito cerámico, 67 columna eficiencia,
certificados de análisis, 165 celda final de columna
certificados de idoneidad, 277, relleno de
165 CE-SDS, 129 columna 307, 20
CGE por plásmido ADN, 136 columna abordaje, 66
CGMP, ver bueno fabricación estudios de columna sumideros y puntos de venta,
desafío de prácticas, 152, 180 304–306 mantenimiento de columnas,
cambio de sistema de 147–148
control, 184 cambio, 29, 36, columna redes, 307
69, 203 columna embalaje, 68, 172–174, 300, 306,
canalización, 328 308, 321, 325–326
Subject 35
columna embalaje calificación, 172

cristalización, 85
procedimientos de relleno de
cultura medios de comunicación, 24
columnas, 172 calidad de relleno
Actual Bueno Fabricación Práctica (cGMP),
de columnas, 326 almacenamiento
ver bueno fabricación practicar la
de columnas, 172–173
tecnología actual, 197, 201
columna volumen, 33
efectos de curvatura, 75
combinatorio desinfección y limpieza, 154
ciclos por lote, 33–34
puesta en servicio, 169, 319
comparabilidad, 140, 164, 183–185
muerto volumen, 310
demostrando comparabilidad ensayos, 129
desamidación, 51
situación competitiva, complejo
eliminación de cuellos de
190 proceso comportamiento, 74
botella, 200 disminución del
factor de compresión, 325
costo de la resina, 210
computacional líquido dinámica (CFD), 308
descontaminación agentes,
validación concurrente, 181
154
conductividad monitores, 312
dedicado control sistema, 315
construcción materiales, 300
instalaciones dedicadas, 21, 24
consumibles, 193
definiendo aceptable residual niveles, 180
contacto tiempo, 102, 113, 147, 173, 175,
definiciones, 168
183 pruebas de integridad de contenedores,
degradación, 129, 141
134 contaminantes, 132, 308, 315
grado de sustitución, 165
cultivo celular continuo, 24, 204
capacidad de entrega, 62
contrato fabricación organizaciones
densidad determinación, 167
(CMO), dieciséis
depreciación, 192, 202
contrato investigar organizaciones (CRO), 16
profundidad filtración, 83
gráficos de control, 173
desalinización, 96, 149
control hardware, 315
diseño criterios, 163
control límites, 74
diseño de experimento (Gama), 73, 76,
control sistemas, 315
162 diseño de equipos, 152
convectivo masa transporte, 286–287
diseño calificación (DQ), 162
gestión corporativa, 190
diseño espacio, 73–74, 173, 185
costo conductores, 193
desorción cinética, 288
costo, 182, 315
detergentes, 132
costo de depreciación, 202
desarrollo plan, 43–44
costo mejora opciones, 193, 202 costo
desarrollo prioridades, 215
de desarrollo, 10
desarrollo registros, 47
costo por río abajo Procesando, 193
desarrollo informes, 73
costo de la atención médica, 11
desarrollo veces, 11
costo de Ventas (CoS),
diafiltración, 118, 178
190 costo de uso, 21
diafragma válvulas, 310
costo por gramo, 195, 202, 204
dilución factor, 305
económico procesos, 196
dimensionamiento datos, 299
coste de propiedad, 62
descarga presión, 314
cupones, 152, 178
descolorado columnas, 180
cobertura de global mercados, 195
desinfección, 147
parámetros críticos del proceso (CPP), 73,
dispersión, 286
161 críticos producto calidad atributos
desplazamiento cromatografía, 273
(CQA), 23,
desechable fermentadores, 29
45, 161, 173, 197
desechable ferretería, 37
flujo cruzado filtración, 152
desechables, 29, 37, 69, 132, 148, 168, 180,
flujo cruzado filtración casetes, 151
203, 299
35 Subject
repartido control sistemas (DCS), 316 canal de

expandido cama adsorción, 85, 308
distribución, 192, 308
experimental parámetros, 248, 254
distribución coeficiente, 239, 247
explosión proteccion, 312
sistemas de distribución, 307
expresión niveles, 50
disulfuro puente formación, 51
expresión sistemas, 48
ADN, 58, 173, 178, 184
externo proveedor de tecnología, 195
ADN autorización, 58, 181, 184
extraíbles, 131–132, 138,
ADN plásmidos, 136
168, 302
ADNasa, 58
documentación, 169, 306, 316
Fab-región, 228
documentación administración, 47
instalaciones diseño, 25, 164
DoE, ver diseño de experimento
instalaciones propiedad, 192
de selección de donantes, 60
instalaciones utilización, 28, 195, 202
Dosis regímenes, 26
factorial diseño, 74–75
río abajo costos, 195
factores influenciando rendimiento
río abajo Procesando (DSP), 23–24, 34, 45,
cromatográfico, 174
60, 192–194
factores conmovedor resina
río abajo proceso mejoras, 215 capacidad de
esperanza de vida, 182 prueba de
unión dinámica, 63, 75,
aceptación de fábrica, FAT, 319
167, 181
Fc-región, 228
dinámica luz dispersión, 129
FDA Forma 483, 152
cultivos por lotes
MI. coli , 49, 82
alimentados, campo 31, 204
ciencias económicas, 189-190, 195–196, 199
caudal fraccionamiento, 129
eficiencia, 306, 308 hongos filamentosos, 50
elastómeros, 302 película masa
electropulido, 303 transferir, 286 filtros
ELISA, 131–132 extraíbles, 168
elución cromatografía, 272 filtrar integridad, 182
elución modos, 246 filtrar medios de comunicación, 151
elución volumen, 276 primera generación proceso, 208
Enbrel, 29 costes fijos, 192
endotoxina, 53, 56, 60, 129, 132–133, 138, fijado final piezas,
155, 308
163, 174, 302 flexibilidad en fabricación, 38, 203, 205
endógeno virus, 53, 133 caudal células, 304, 312
ingeniería carreras, 183 caudal distribución, 306
ambiente, salud y la seguridad (EHS), 62 caudal mediciones, 166
actividad enzimática, 56 caudal metros, 169, 313
equilibrio de columnas, 183 caudal resistencia, 244
equipos, 121, 165, 168
líquido velocidad, 314
equipo limpieza validación, 178, 180
fluidizado cama, 85, 274
equipo componentes, 165
tasas de flujo, 120
cualificación de equipos, 168
FMEA (falla modo y efecto análisis), 55
relacionados con equipos zona
siguen a las proteínas, ver biosimilares
extensión, 305 eritropoyetina (EPO), 3
seguir en biológicos, ver criterios de
etanol, 156
procesamiento directo de biosimilares,
europeo Medicamentos Agencia (EMEA), 15 165 colección de fracciones, 305, 314
virus exógenos, 53
fraccionamiento, 2, 92, 96
fritas, 307
frontal cromatografía, 272
TLC (culpa árbol análisis),
Prueba de 55 funciones,
Subject 35
166–167
35 Subject
funcional especificaciones, 300

climatización, 164
Fv-región, 228
hidrofóbico Interacción cromatografía (HIC),
66, 72, 107, 262,
gaussiano forma, 277
gel filtración, ver Talla cromatografía de PCI Q8, 73
exclusión
Identidad pruebas métodos, 127–128, 165, 167
genérico y matriz viral autorización estudios, pruebas de identidad para productos de ácido
133 análisis genético, 134
nucleico, 136 inmunoadsorbente, 111
genético estabilidad, 127, 134
inmunogenicidad, 56, 129, 131, 139, 175–176,
genómico ADN, 53, 56
180, 198
global economía, 190
inmunoglobulina fracciones, 2
glicanos, 129–130
mejora jerarquía, 215
glicoproteína carbohidrato estructura, 130
impurezas, 23, 35, 45–47, 66, 127–128,
glucosidasa, 56
130–131, 137, 181
glicosilación, 24, 51
en vitro bioensayos, 134
bueno automatizado fabricación prácticas
cuerpos de inclusión, 49
(GAMP), 172, 316
optimización incremental, 56
bueno fabricación prácticas (BPF), 15, 132,
individuos proceso diseños, 45
162–165, 168, 181, materias primas industriales,
184, 299 61 ensayos de infectividad,
gradientes, 104, 312 132
Gram-negativo bacterias, 53 espectroscopia infrarroja,
inhibición 167 de microbiano
HACCP (peligro análisis y puntos crecimiento, 174 fabricación
críticos de control), 55 propia, 25
hardware y software especificaciones, 315– sumideros, 308
317 capacidad de hardware, 316 en línea buffer preparación,
cosecha, 30, 81 312 filtros en línea, 300
profesional de la salud, ver anfitrión inoculación trenes, 24
célula heterogeneidad de proteínas, 128 en proceso y final producto análisis, 127, 165
HETP, 172, 181, 240, 327 intermedios en proceso, estabilidad de,
enfoque heurístico, 61 164, 182
alto costo procesos, 195 pruebas de liberación en
alto presión proceso cromatografía, 308 de proceso, 164 en proceso
alto rendimiento, 17 especificaciones, 140
tiempos de espera antes de la limpieza, de entrada y salida (E/S) interfaces,
178 espera veces, 147, 177-178, 181, 316 células de insecto, 50
200 instalación calificación (coeficiente intelectual),
hueco fibras, 118 162, 169-170
homogeneidad pruebas, 167 insulina, 2
anfitrión célula ADN, 131, 137 integración de todos
anfitrión célula proteínas (HCP), 129, 131, pasos, 44 interferón- , - y
138, 173, - , 3 producto intermedio,
178, 184 61
HPSEC, 141 Internacional Conferencia en Armonización
anticuerpos humanos, (ICH), 15
226 humanos sangre intravenoso IgG, 26
plasma, 23 inventario administración, 197
humano derivado de la sangre ion cromatografía de intercambio (CEI), 34, 66,
productos, 60 hormona de 72, 96–97, 176, 252
crecimiento humana (hGH), 2 ion trampa movilidad espectrometría (ITMS),
albúmina sérica humana, 2 152, 179 capacidad iónica, 281
parecido a un humano glicosilación, 49 movilidad iónica espectrometría (SOY
Subject 35
S), 152 IQ, ver calificación de
instalación
36 Subject
isoelectrico enfoque (IEF), 128

matriz y familia enfoques, 178
punto isoeléctrico, 225
indicación médica, 8
media presión cromatografía, 308
llave actuación atributos, 197
membrana adsorbedores, 67
criterios clave de selección, 62
membrana cartuchos, 37
cinética de adsorción, 288
membrana cromatografía, 67, 196
ecuación de Knox, 242
membrana microfiltros, 83
membranas, 118, 178, 182
mano de obra, 192, 200, 205, 315
metros, 312
Langmuir isoterma, 269
método calificación y validación, 140 –141 pruebas
Gran escala equipo, 43
de provocación microbiana, 158
Gran escala plásmido ADN purificación,
microbiano fermentación, 23
72 última tecnología de resina, 208
microbiano crecimiento, 310
lixiviables, 132, 138, 165, 167-168, 173–176,
microbiano sistemas, 24
302
micro-heterogéneo formularios, 51
prueba de
mal plegado, 51
fugas, 323
fase móvil volumen, 278
Fabricación LEAN, 44, 197 LEAN
modelo coeficientes, 76 –77
Seis Sigma programa, 197 sensores
modelo ecuaciones, 74
de nivel, 314
modelo proceso, 200 –201
esperanza de vida, 20, 177, 180–182, 211
modelado, 285
esperanza de vida estudios por ultrafiltración y
modificado producto, 129
membranas de diafiltración, 182
molécula propiedades,
esperanza de vida validación
monitor 54 caudal
estudios, 181 ligandos, 111
células, 305 monitores,
dispersión de la luz métodos, 130
169, 312
lipopolisacáridos, 133
monoclonal anticuerpos (Mab), 3, 26, 30, 135,
líquido entrega sistema, 299–300, 303–
167, 176
304 costo-beneficio a largo plazo, 196
agregación de anticuerpos monoclonales,
más bajo) costo ubicaciones,
129 monoclonal anticuerpo producción,
196 menores márgenes de
30, 193 purificación de anticuerpos
beneficio, 196
monoclonales, 70 MS, ver
baja presión cromatografía resinas, 307
espectrometría de masas
multimodal cromatografía, 67, 209
mantenimiento de columna embalaje
multipuerto válvulas, 309–310
integridad, 174 mantenimiento del estado
multiproducto comodidades, 21, 36, 148, 180, 299
validado, 170 procedimientos de
varios pasos purificación, 58
mantenimiento, 169
haciendo cambios, 185 micoplasma, 133
mamífero célula cultura, 23–24, 30, 82
administración estructura, 43, 190 NORTE- y C-terminal
secuenciación, 129 NaOH, ver
fabricación costos, 192, 195
fuentes naturales de hidróxido de
fabricación carreras, 177
sodio, 23
fabricación escala, 25
negativo cromatografía, 90
mercado necesidades, 23
valor actual neto (VAN), 18
marketing y relacionado con las ventas
redes, 316
costos, 190 balance de masa, 285
nuevos productos
masa espectrometría (EM), 128–
biológicos, 12 nuevos
130 banco de células maestras
droga aprobaciones, 12
(MCB), 42 planes maestros, 43
nuevo molecular entidades (NME),
material balance, 243
espectroscopia de 12 RMN, 130
material costos, 197
no lineal cromatografía, 271
filtración de flujo normal, 83
Subject 36
normalizado limpio agua permeabilidad,

fase proporción, 239
182 VAN: valor presente neto, 211
fosforilación, 51
NS0, una línea celular de mieloma, 3
físico pruebas, 166
nuclear magnético resonancia (RMN), 130
Pichiá pastores , 50
ácidos nucleicos, 53, 58, 228
tubería y instrumento (PI) dibujo, 300 tuberías,
nucleico ácido productos, 136
314
nucleótidos, 228
placa ensayos, 138, 233
número de placas, ver placa número
plasma derivados, 2
plásmido ADN, 71-72, 136-139, 230
Omnitropo, 140
isoformas de ADN plásmido,
pérdidas de beneficios operativos,
plásmido 137 ADN potencia
203 presión del sistema operativo,
ensayos, 139 plásticos, 302
304 la temperatura rango, 311
lámina modelo, 290
condiciones operativas, 174
lámina número, 240, 278
Operacional modo, 67
plataforma tecnologías, 18, 43, 66, 69, 72, 214
Operacional calificación (OQ), 160,
pulido pasos, 34, 67, 196
162, 170
Pulido, 67
operador error, 315
polimerasa cadena reacción (PCR), 59, 131,
operador la seguridad, 312
138, véase también Q-PCR
mejoramiento, 75, 91, 119–120,
poro difusión, 286
237 OQ, ver calificación
porosidad, 166
operacional
posterior a la aprobación cambios en
afuera de especificación (OOS), 26, 73, 184
cromatografía, 185 post-Proteína A pulido,
externalización, 25
196
oxidación, 51
postraduccional modificaciones, 47, 51
potencia, 130, 134, 139, 164
P&L (ganancias y pérdidas),
presión soltar, 243, 303–304, 308, 314, 322–323
191 integridad del lecho
presión mediciones, 304
empacado, 172 empaque, ver
presión especificaciones, 303
columna paquete de
presión tolerancia, 306
embalaje en el lugar, 308
presión/caudal Velocidad, 311
PÁGINA, 2-D, 131
recipiente a presión códigos, 308
pandemia, 6
recipiente a presión regulaciones, 304
partícula Talla distribución, 165–166
precio de medicamentos, 192, 195
PALMADITA, ver proceso analítico
prión proteína, 60
tecnologías PCR, véase anchura del
proceso analítico tecnologías (PALMADITA),
pico de la reacción en cadena de la
15, 17,
polimerasa, 278
141–142, 152, 169, 173–174, 178, 181,
pegilado proteínas, 12
315
péptido vínculo, 220
proceso capacidades, 23
péptido cartografía, 134
proceso cambio, 18, 38, 73, 164
péptidos, 219
proceso caracterización, 73, 77
atributos de rendimiento, 173
proceso controlar, 78
rendimiento calificación (PQ), 162
proceso diseño, 23, 41, 43–44, 87, 122, 308
espacio periplasmático, 50
proceso desarrollo, 43, 308, 315
control de supervisión basado en
proceso economía, 200, 291
computadora personal (PC) y datos
proceso falla, 56
adquisición (SCADA) paquetes, 316
proceso mejoras, 73, 190
pH electrodos, abordaje de, 313
proceso impurezas, 52, 130, 137
monitores de pH, 313
pH sensibilidad investigación, 313 proceso integración, 45, 56, 67
ensayo clínico fase 3, 164 proceso intensificación, 24
36 Subject
proceso intermedios, 127

zapatillas, 299–314
proceso limitaciones, 74
compra costo, 200
proceso vigilancia, 312
adquisitivo materiales, 62
proceso parámetros, 45
purificación plataforma, 71
proceso actuación, 73
purificación pasos, 60
proceso robustez, 74–75
purificación, 30, 63, 66, 86
proceso simulaciones, 199
pureza, 88, 128, 136
proceso comprensión, 17, 73, 78
pureza y potencia ensayos, 164
proceso validación, 19, 78, 155, 161–162, pirógenos, 132–133, 138
172, 306
proceso variabilidad, 56 q anión intercambiadores, 149
proceso rendir mejoras, 207 Q-PCR, 131–133, 137, 184
rendimiento del proceso, 28, 195, 206
calificación de escala abajo, 181, 183
Procesando agentes, 130
calidad garantía, 165
Procesando ciclo, 200
calidad atributos, 140
Procesando tiempo, 35
cantidad, 133, 139
integración de procesos retos, 68
cuaternario estructura análisis, 130
producto relacionado impurezas, 51–52, 128–
129, 205
I+D gasto, 190
producto intermedio, 43
I+D tubería, 38
producto aislamiento, 53
radial presión soltar, 306
producto ciclo vital, 38, 192
rápido microbiológico métodos (RMM), 133,
producto pureza, 127
155, 174
producto calidad, 73
extraño 'huérfano'
producto recuperación, 45
enfermedades, modelo de
producto liberar, esterilidad, 163
9 tipos, 289
fuente de producto, 52
crudo materiales, 18, 29, 61, 163–165, 193
producto estabilidad, 198
Listo para procesar equipo, 37
producto título, 25, 194-195, 203–205
reactivos, 147
producto rendimiento, 27, 56
recombinante crecimiento hormona,
producción campañas, 203
140 insulinas humanas recombinantes,
producción capacidad, 194
26 proteínas recombinantes, 26
producción célula, 47
recombinante vacunas, 5
producción organismos, 23–24
recuperación operaciones, 61
producción cantidades, 26–27
recuperación pasos, 60
producción guión, 23
recuperación unidad
producción escasez, 203 operaciones, 164 recuperación,
productividad, 21, 91, 96, 102, 106, 109 81, 90, 178, 283 altura de placa
programable lógico controlador sistema reducida, 241 velocidad
(SOCIEDAD ANÓNIMA), 315 reducida, 241
proteasas, 56, 155 referencia estándares, 140
Proteína A, 4, 34, 70, 131-132, 151, 181, replegable, 49
192, 228 regulador cumplimiento, 61
Proteína A-anticuerpo complejos, 176 eliminación de limpieza agentes, 152,
Proteína G, 228 178 retiro de soluciones de
Proteína L, 228 almacenamiento, 174 reempaque, 308
proteína modificaciones, 129 informes, 47
proteínico ligandos, 176 reproducibilidad, 315
libre de proteínas cultura medios de residencia tiempo distribución, 279, 326
comunicación, 53, 208
residencia tiempo, 307–308
probado tecnología, 215
residuos, en línea mediciones de, 179
Subject 36
resina integridad, 177

desinfección, 147, 154, 175, 180, 304, 311
resina fuga, 165 tiempos de espera de desinfección, 178
resina esperanza de vida, 148, 173, 181, 200 desinfección validación, 180
resina propiedades, 173–174 ahorros por kilogramo, 205
resina pruebas, 66 cambios de escala, 173
resinas, 34, 180, 208 escala abajo, 183
resolución, 67, 88, 93, 98, 104, 108, 238, 248, escala de operación, 203
254, 259, 263 aumentar proporcionalmente, 46, 114, 122, 183,
respuesta superficie, 77 329
retencion factor, 239, 252, 258, escala arriba precisión, 183
262, 276 evaluación DoE, 74
retencion volumen, 245, 276 poner en pantalla estudios, 75
retención, 265 FDS–PÁGINA, 127, 129–131
eliminación de retrovirus, SEC-HPLC, 129
181 reutilización modo SEGUNDO, ver Talla exclusión
operación, 29 estrategias cromatografía estructuras secundarias y
de reutilización, 209 terciarias, 130 proceso de segunda
reutilizar, 20, 210 generación, 208 selección de una nueva
resinas reutilizadas tecnología, 196 selección de
virus autorización estudios de, 181 componentes, 306
revalidación, ensayos, 164 selección de industrial
fase inversa cromatografía, RPC, 103, 258 instrumentos, 44 selección de
prueba de hisopado de fluidos de enjuague, métodos, 61
179 selección de piloto y producción sistemas, 299
muestreo de agua de selección de celda de producción, 47
enjuague, riesgo 179 selección de la mejor métodos, 44 factor
evaluación, 45, 55, 175 de selectividad, 240
Evaluación de riesgos métodos, 197 selectividad, 63, 98, 119
riesgo categorías, 56 venta, general & administrativo gastos (SG&A),
riesgo factores, 55 190
riesgo administración, 55, sensores, 312
57–58 riesgo /análisis de separación rango en
beneficios, 162 limpieza SEGUNDO, 93 secuencia de
basada en riesgos, 178 pasos, 61 cizallamiento, 311
ARN, 137 señal especificaciones, 317
ARN eliminación, 72 sílice resinas, 176
robusto proceso, 19, 166 similar biológico medicinal productos,
robustez, 19, 63, 75, 198 ver biosimilares
rodillo botellas, 30 simulados Moviente cama,
rutina carga biológica vigilancia, 180 275 simulación, 291
costos de regalías, 195 de un solo uso, 29, 196
Talla exclusión cromatografía (SEGUNDO), 92,
Saccharomyces cerevisiae , 50 245
seguridad, 58, 198, 312 estiércol líquido concentración, 324
Ventas valor, 27, 191 SMA modelo, 270
sal degradado elución, 176 viruela, 4
muestra concentración en en pequeña escala calificado
SEGUNDO, 93 flujo de muestra, 306 modelos, 184 pequeña escala
carga de muestra, 99, 106 estudios, 177, 182–183
muestra tanques, vaciando de, 314 sodio hidróxido, 68, 147, 150–151, 174, 180
volumen de muestra, 329 hidróxido de sodio estabilidad, 209
sanitario conexiones, 312 sodio hipoclorito (lejía), 151 software,
sanitario diseño, 313 316
36 Subject
software funciones, 318
Subject 36
software requisitos, 318

torunda pruebas, 179
software especificaciones, 316
sistema diseño, 305
software pruebas, 171
sistema sostener volumen,
sustancia disoluta capacidad, 281 309 rendimiento del sistema,
compatibilidad con solventes, 312
304 fuentes de contaminación, sistema idoneidad, 163
154 repuestos, 169
específico costos, 194 –195
tizón, 328
específico productividad, 31
tándem MS/MS, 130
especificaciones, 140
tangencial caudal filtración,
espectrofotometría, 129 83 colocación de tanques,
espectroscopia, 130 311
velocidad control, 311 impuestos, 192
pico volumen, 184 tecnología elecciones, 19
clavando estudios, 155 mejoras tecnológicas, tecnología 215
esporas, 155 plataformas, ver plataforma
estabilidad, 54, 134, 139, 164 temperatura de las
estabilidad pruebas, 134, 165 tecnologías , 183, 314
cama estable, 322 la temperatura compensación, por monitores de
dotación de personal nivel, 24 conductividad, 313
escenificado validación la temperatura tolerancia, 311
actividades, 162 zonas diez mandamientos por mejorar la
estancadas, 310 economía, 216
inoxidable acero, 303 terciario estructura, 130, 134
estadístico diseño de experimentos, 73 ensayo de resinas, 166
vapor, 180 TFF sistema, validación de limpieza, 178
vapor esterilización, 310–311 proteínas terapéuticas, 190
paso cambios, 214 cromatografía de interacción tiófila, 72 de
rendimiento escalonado, 181 tres y de cuatro vías diafragma válvulas,
esterilidad ensayo, 163 309 proceso de tres pasos, 36
esterilización, 147 Límite sistema, 131
almacenamiento, 174-175, 177 rendimiento, 91
lleno cromatografía columnas, 174 tiempo a 1º en humano, 198
condiciones de almacenamiento, 174 tejido plasminógeno activador (tPA), 3
almacenamiento soluciones, limpieza efecto TOC, véase carbono orgánico total
de, 177 análisis estructural, 129 parte superior venta biofarmacia drogas, 7
estructural cambios, 129 total orgánico carbón ( TDC), 152,
estructural caracterización, 129 176, 178, 180
ensayo estructural, 171 total proteína, 133
estructura de proteínas, 222 toxicidad pruebas, 302
estructurado Acercarse a proceso diseño, 44– toxicología estudios, 163–164
45 subclases, 227 capacitación, 319
subunidad vacuna, 5 transgénicos, 23, 48, 51
éxito tarifas, 11 transicional análisis, 172
superenrollado plásmido ADN, transmembrana presión, 182
72 vapor sobrecalentado, 157 transmisible espongiforme encefalopatías
proveedor auditorías, 165, 167 (TSE), 53, 59, 131,
suministro compañías, 10 153-154, 165, 184
superficie propiedades, 221, 223 tri-abrazadera conexiones, 304
sustituto parámetros, 181 EET, ver transmisible encefalopatías
espongiformes
36 Subject
tubería, 314
camioneta Deemter ecuación,
bifásico sistemas, 84 241 longitudes de trayectoria
dos pasos proceso, 209 variables, 312 velocidad, 308
vendedor auditorías, 62
ultrafiltración/diafiltración, 72 vendedor Certificación, 20
ultrafiltración, 118, 178 buque dispersión número, 280
ultravioleta (ultravioleta) monitor viral autorización, 59, 132, 163–164, 181, 198
caudal célula, 304 operaciones viral la seguridad, 59, 163–164
unitarias, 43
virus, 56, 132, 184, 231
Unido estados Alimento y Droga
virus filtros, 37, 120
Administración (FDA de EE. UU.), 12
basado en virus terapia de genes
río arriba costos, 195
productos, 136 viscosidad, 311, 313
río arriba proceso, 30, 45, 193
viscoso arrastrar, 322
utilidades, 169
visual inspección, 152, 179–180, 308
ultravioleta A280
absorbancia, 133 monitores
desperdicio desecho, 212
UV, 312
agua flujo recuperaciones, 151
mojado superficies, 148, 183, 302, 308
vacunas, 4, 6
WFI (agua para inyección), 147
fabricantes de vacunas, 9
ventana de operación, 56, 71
validados limpieza protocolos,
flujo de trabajo plataformas, 44
168 validación, 161, 164, 316
laboral célula banco (WCB), 42, 164
validación de limpieza, 178
patrón de referencia de trabajo, 163
validación de río abajo procesos, 164,
173–174
radiografía cristalografía, 130
validación de reutilización,
197 validación protocolos,
levadura, 50, 82
172
rendir, 206
valor diseño, 310
rendir mejora, 207
valor generación, 198
valor cuadrícula, 198
Zona ampliación, 240, 247, 253, 258, 262,
valor de perdió Ventas, 206
266, 278, 304–307, 327
válvulas, 170, 309
válvulas, multipuerto válvulas, 2 vías
colectores de válvulas, 314
Subject 36

Handbook Procesos Cromatograficos 2da Edicion Pag 257-End

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10.

10.2 BÁSICO RELACIONES

El propósito de la cromatografía de proceso es separar, es decir, resolver, un componente

los mano derecha lado de la ecuación expresa la resolución en términos de la retencion

La migración relativa de un soluto será igual a la cantidad relativa encontrada en la

donde VM _ es el volumen de la fase móvil. El factor de retención está relacionado con el

dónde VS _ es la volumen de la estacionario fase. Eso es importante a Nota que la

en el coeficiente de distribución. En la elución en gradiente, el coeficiente de distribución

mientras k puede variar debido a las diferencias en la relación de fase de diferentes

10.2.3 Zona ampliando

El ancho del pico se ve afectado principalmente por el ensanchamiento de la zona en la

Conversión de longitud a volumen y ajuste z L , donde L es la longitud de la

los número de platos por columna, N , es dada por L / H y de este modo

dónde es un factor geométrico de orden unidad, d p el tamaño de partícula, D M y D S ,

y la reducido velocidad, , dado por

donación la siguiendo simplificado ecuación

20.6 S ((VR V0 ) 1) (V0 VR )(1 (V0 VR )) 1.5

dónde S es a factor a cuenta por la restringido difusión en la intrapartícula espacio

cromatografía (SEC), cromatografía de intercambio iónico (IEC) y cromatografía de fase

10.2.4 Masa transferir

El transporte de soluto a través de la columna depende de la concentración local de soluto

De este modo, por un infinitesimal pequeña segmento dentro de la columna la cambio

10.2.5 Caudal resistencia de lleno camas

los primero término de ec. (10.16) es a conversión de intersticial líquido velocidad, tu ,

indicativo de columna deterioro. ecuación (10.16) es útil por determinando ya sea a el

10.3 PURIFICACIÓN PRINCIPIOS

10.3.1 Gel filtración/tamaño exclusión cromatografía, SEGUNDO

En la filtración en gel, o cromatografía de exclusión por tamaño, los solutos se separan en

Mobile phase composition

0.50 Mobile phase composition

Mobile phase composition

dónde K D es la distribución coeficiente. los distribución coeficiente es relacionado a

donde R es el radio efectivo del soluto, r el radio de exclusión por tamaño de la

Ampliación de zona en SEGUNDO

dónde dK D / día Iniciar sesión R es la Pendiente de la selectividad curva, K D la promedio

Influencia de experimental parámetros en SEGUNDO

PROPIEDADES DE LA SUSTANCIA DISOLUTA

Figura 10.5 Influencia de soluto forma sobre la retención en Talla exclusión.

o la viscosidad del eluyente cambia o cuando se compara el ensanchamiento de zona de

PROPIEDADES DE LA MÓVIL FASE

donde F es el caudal (ml/min) y A c el área de la sección transversal de la columna (cm 2

PROPIEDADES DE LA CROMATOGRAFÍA RESINA

donde V alimenta ml de muestra se va a procesar por hora. Se encontró que la ecuación

concentración de muestra de aprox. 70 mg/ml de una proteína globular como la albúmina

10.3.2 Ion intercambio cromatografía, CEI

La interacción en IEC se ha descrito tradicionalmente mediante un modelo

dónde k 0 es relacionado a la ion intercambio capacidad de la medio, Q v , ( k 0 es

20 z=4 z=2 z=1

Zona ampliando en CEI

de nitidez para un gradiente más pronunciado) y también en la relación entre k y la fuerza

dónde L es la columna longitud, gramo la degradado Pendiente (Topo / L por litro

Influencia de experimental parámetros en CEI

PROPIEDADES DE LA SUSTANCIA DISOLUTA

proteinas apartado en a catión intercambiador la retencion voluntad disminuir con un

PROPIEDADES DE LA MÓVIL FASE

elución fuerza de diferente iones [30]

Cromatografía de intercambio de aniones

la cinética es lo suficientemente rápida como para permitir el uso de velocidades de flujo

PROPIEDADES DE LA CROMATOGRAFÍA RESINA

resinas de cromatografía como resultado del aumento en la transferencia de masa [39]. La

10.3.3 fase inversa cromatografía, RPC

El mecanismo de retención en RPC aún no se comprende completamente [46]. La

Zona ampliando en RPC

Influencia de experimental parámetros en RPC