SEPARACIONES

CROMATOGRÁFICAS
UNIDAD 4: MÉTODOS DE SEPARACIÓN
Métodos de separación
CROMATOGRAFÍA
oSeparación, identificación y determinación de los componentes químicos de
mezclas complejas
oMétodo más poderoso y aplicable para la separación
oExisten muchas variantes al método, pero todas coinciden en el uso de una fase
móvil y una fase estacionaria.
oLos componentes de una mezcla son llevados a través de la fase estacionaria
por la fase móvil.
oLa separación se basa en la diferencia de velocidades de migración entre los
componentes de la fase móvil
Clasificación
•Cromatografía en columna
• Fase estacionaria dentro de un tubo delgado

• Fase móvil es forzada a través de un tubo por presión o gravedad

•Cromatografía plana
• Fase estacionaria sostenida sobre una placa

• La fase móvil se mueve por la estacionaria por capilaridad o influencia de la gravedad

Clasificación
Cromatografías de columna
Cromatografía de elusión de columna

La disolución de la
En el tiempo t0 los
mezcla con los Movimiento del
componentes se Elución – adición de una
componentes A y B se eluyente hacia debajo
distribuyen en la fase nueva fase móvil
introduce por la cabeza de la columna
móvil y estacionaria
de la columna

Mayor partición de la Partición simultanea de Separación de los

fase móvil y estacionaria las fases en el sitio componentes en bandas
ene l tiempo t1 original de la muestra o zonas
 Cromatografía
de elusión de
columna

a) Diagrama que muestra la separación por

cromatografía de elución en columna de una
mezcla de los componentes A y B.
b) La señal del detector en las diferentes etapas
de la elución se muestra en a).
 Cromatogramas

Perfiles de concentración
de las bandas de los
solutos A y B a dos
diferentes tiempos en su
migración hacia debajo de
la columna
Velocidades de migración de los solutos
Depende de la velocidad a la que ambas especies son eluidas, que tan bien son determinadas por la
concentración del soluto en cada fase
Grado en que los solutos se distribuyen en las dos fases. Él equilibrio químico para una especie A está
dado por:
𝐴(𝑀ó𝑣𝑖𝑙) ↔ 𝐴(𝐸𝑠𝑡𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛𝑎𝑟𝑖𝑎)
Donde la constante de equilibrio Kc:
𝜎𝐴(𝑒𝑠𝑡𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛𝑎𝑟𝑖𝑎)
𝐾𝑐 =
𝜎𝐴(𝑚ó𝑣𝑖𝑙)
𝜎𝐴(𝑒𝑠𝑡𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛𝑎𝑟𝑖𝑎) y 𝜎𝐴(𝑚𝑜𝑣𝑖𝑙) representa las actividades del soluto en cada fase.
Normalmente se sustituye las actividades por las concentraciones analíticas:
𝑐𝑠
𝐾𝑐 =
𝑐𝑚
K constante de distribución
 Tiempos de retención
•Tiempo muerto: tiempo que transcurre después de haber inyectado al muestra hasta la aparición de un pico.
Proporciona una medida de la velocidad de migración promedio de la fase móvil y permite identificar los
picos del analito
Todos los componentes pasan por los menos por un tiempo muerto
•Tiempo de retención: tiempo requerido para que la zona alcance el detector después de la inyección de la
muestra
•Ts: Tiempo de retención del analito en la fase estacionaria.
•Los tiempos se relacionan de la siguiente manera:
𝑡𝑅 = 𝑡𝑆 + 𝑡𝑀
𝑡𝑅 es el tiempo de retención
𝑡𝑆 es el tiempo de retención del analito en la fase estacionaria
𝑡𝑀 es el tiempo muerto
Velocidades de migración de los solutos
•La velocidad lineal promedio de migración del soluto (cm/s):
𝐿
𝑣ҧ =
𝑡𝑅
L es la longitud de empacamiento de la columna

•La velocidad lineal promedio u, de las moléculas de la fase móvil:

𝐿
𝑢=
𝑡𝑀
Velocidades de migración de los solutos
Relación entre el flujo volumétrico y la velocidad del flujo lineal:
El flujo de la fase móvil suele estar caracterizado por la velocidad del flujo volumétrico F.
F está relacionada a la velocidad lineal en la salida de la columna uo por medio de la
ecuación:
𝐹 = 𝐴 ∙ 𝑢0 = 𝑢0 ∙ 𝜋𝑟 2
A es el área transversal del tubo.
Para una columna empacada:
𝐹 = 𝑢0 ∙ 𝜋𝑟 2 ∙ 𝜀
Donde 𝜀 es la fracción del volumen total de la columna que está disponible al líquido
 Velocidades de migración y constantes de
distribución
Para relacionar la velocidad de migración de un soluto con su constante de distribución, se
expresa la velocidad como la fracción de la velocidad en la fase móvil:

𝑣ҧ = 𝑢 × 𝑓𝑟𝑎𝑐𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑞𝑢𝑒 𝑝𝑎𝑠𝑎𝑒𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 𝑝𝑜𝑟 𝑙𝑎 𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑚ó𝑣𝑖𝑙

𝑛𝑢𝑚. 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑚ó𝑣𝑖𝑙

𝑣ҧ = 𝑢 ×
𝑛𝑢𝑚. 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑐𝑜𝑙𝑢𝑚𝑛𝑎
El número de moles se obtiene de multiplicar la concentración molar por el volumen, por lo
tanto:
𝑐𝑀 𝑉𝑀 1
𝑣ҧ = 𝑢 × =𝑢×
𝑐𝑀 𝑉𝑀 + 𝑐𝑆 𝑉𝑠 1 + 𝑐𝑆 𝑉𝑠 /𝑐𝑀 𝑉𝑀
Si sustituimos con la expresión de la constante de distribución:
1
𝑣ҧ = 𝑢 ×
1 + 𝐾𝑐 𝑉𝑠 /𝑉𝑀
Factor de retención k
Permite comparar las velocidades de migración de los solutos en la columna. Por ejemplo, para el
soluto A:
𝑉𝑠
𝑘𝐴 = 𝐾𝐴
𝑉𝑀
𝐾𝐴 es la constante de distribución del soluto A.

Si reemplazamos esta ecuación en la anterior:

1
𝑣ҧ = 𝑢 ×
1 + 𝑘𝐴
Para calcular 𝑘𝐴 reemplazamos v y u:
𝑡𝑅 − 𝑡𝑀 𝑡𝑆
𝑘𝐴 = =
𝑡𝑀 𝑡𝑀
Factor de selectividad
El factor de selectividad de una columna para los solutos A y B se define como:
𝐾𝐵
𝛼=
𝐾𝐴
𝐾𝐵 y 𝐾𝐴 son las constantes de distribución de las especies B y A respectivamente.
𝛼 siempre es mayor que 1 porque la retención de la especie B es mayor que la de la especie A.
Esta ecuación también puede escribirse:
𝑘𝐵
𝛼=
𝑘𝐴
Sustituyendo con la ecuación que relaciona los tiempos de retención:
𝑡𝑅 𝐵 − 𝑡𝑀
𝛼=
𝑡𝑅 𝐴 − 𝑡𝑀
Ejercicios
•Una columna tubular abierta utilizada para cromatografía de gases tenía un diámetro interno de
0.25 mm. Se utilizó una velocidad de flujo volumétrico de 0.95 mL/min. Encuentre la velocidad
lineal del flujo en cm/s en la salida de la columna. R=32.31CM/S
•Una columna empacada para cromatografía de gases tenía un diámetro interno de 5.0 mm. La
velocidad del flujo volumétrico medida en la salida de la columna fue de 48.0 mL/min. Si la
porosidad de la columna era de 0.43, ¿cuál era la velocidad lineal del flujo en cm/s? R=9.5cm/s
•A partir de los siguientes datos, calcule para A, B, C y D: a) el factor de retención y b) la
constante de distribución.
Descripción cuantitativa de la eficiencia
de una columna
1. La altura del plato H
2. El número de platos N
Relacionados a través de la ecuación:
𝐿
𝑁=
𝐻
•Donde L es la longitud (generalmente en cm) del empacamiento de la columna
•La eficiencia de las columnas aumenta a medida que el número de platos
aumenta y la altura del plato se reduce
Determinación del número de platos

𝑡𝑅 2
𝑁 = 16
𝑊
Variables que afectan la eficiencia
Teoría del ensanchamiento de bandas
La eficiencia de las columnas de la cromatografía capilar y de las columnas empacadas
para cromatografía a bajas velocidades de flujo se puede aproximar por medio de la
expresión:
𝐵
𝐻 = + 𝐶𝑠 𝑢 + 𝐶𝑀 𝑢
𝑢
Donde:
H es la altura del plato en cm
u es la velocidad lineal de la fase móvil en cm/s
B es el coeficiente de difusión longitudinal
𝐶𝑠 y 𝐶𝑀 son los coeficientes de transferencia de masa para las fases estacionaria y móvil
Resolución de la columna
Nos indica cuán separadas están dos bandas en
relación con su anchura.
La resolución proporciona una medida
cuantitativa de la capacidad de la columna para
separar dos analitos.

∆𝑍 2∆𝑍 2 𝑡𝑅 𝐵 − 𝑡𝑅 𝐴
𝑅𝑆 = 𝑊𝐴 𝑊𝐵 =𝑊 =
+ 𝐴 +𝑊𝐵 𝑊𝐴 +𝑊𝐵
2 𝐵
Resolución de la columna
Efecto del factor de retención y del factor de selectividad en la resolución

𝑁 𝛼−1 𝑘𝐵
𝑅𝑆 =
4 𝛼 1 + 𝑘𝐵
La ecuación anterior puede ser reordenada para encontrar el número de platos que se necesita para
conseguir una resolución específica:
2 1+𝑘 2
𝛼 𝐵
𝑁 = 16𝑅𝑆 2
𝛼−1 𝑘𝐵
Efecto de la resolución sobre el tiempo de retención

16𝑅𝑆 2 𝐻 𝛼 2 1 + 𝑘𝐵 3
𝑡𝑅 𝐵 =
𝑢 𝛼−1 𝑘𝐵 2
Ejemplo
Las sustancias A y B tiene tiempos de retención de 16.40 y 17.63 min, respectivamente, en una
columna de 30.0 cm. Una especie química no retenida pasa a través de la columna en 1.30 min.
Los anchos de los picos (en la base) para A y B son de 1.11 y 1.21 min, respectivamente. Calcule
a) la resolución de la columna
b) el número de platos promedio en la columna
c) la altura de plato
d) la longitud de la columna necesaria para conseguir una resolución de 1.5
e) el tiempo requerido para eluir la sustancia B en la columna que tiene un valor de Rs de 1.5

𝑡𝑅𝐴 = 16.4 𝑚𝑖𝑛 𝐿 = 30 𝑐𝑚 𝑊𝐴 = 1.11 𝑚𝑖𝑛

𝑡𝑅𝐵 = 17.63 𝑚𝑖𝑛 𝑡𝑀 = 1.3 𝑚𝑖𝑛 𝑊𝐵 = 1.21 𝑚𝑖𝑛

a) la resolución de la columna

2 𝑡𝑅 𝐵 − 𝑡𝑅 𝐴 2(17.63 − 16.4)
𝑅𝑆 = = = 1.06
𝑊𝐴 + 𝑊𝐵 1.11 + 1.21

b) el número de platos promedio en la columna

2 2
𝑡𝑅 17.63
𝑁 = 16 𝑁𝐵 = 16 = 3397
𝑊 1.21
2
16.4 3493 + 3397
𝑁𝐴 = 16 = 3493 𝑁𝑃𝑅𝑂𝑀𝐸𝐷𝐼𝑂 = = 3445
1.11 2
 c) la altura de plato

𝐿 𝐿 30 𝑐𝑚
𝑁= →𝐻= = = 8.7 × 10−3 𝑐𝑚
𝐻 𝑁 3445

d) la longitud de la columna necesaria para conseguir una resolución de 1.5

𝑁1 𝛼 − 1 𝑘𝐵
𝑅𝑆−1 = 𝑅𝑆−1 = 𝑁1 1.06 = 3445
4 𝛼 1 + 𝑘𝐵
=
𝑁2 𝛼 − 1 𝑘𝐵 𝑅𝑆−2 = 𝑁2 1.5 = 𝑁2
𝑅𝑆−2 = 4 𝛼 1 + 𝑘𝐵
2 𝐿
𝑁2 = 3445 ∗
1.5
= 6899 𝑁 = → 𝐿 = 6899 ∗ 8.7 × 10−3 𝑐𝑚 = 60.02𝑐𝑚
1.06 𝐻
e) el tiempo requerido para eluir la sustancia B en la columna que tiene
un valor de Rs de 1.5

𝑡𝑅 𝐵−1 𝑅𝑆1 2 17.63 1.062

= → =
𝑡𝑅 𝐵−2 𝑅𝑆2 2 𝑡𝑅 𝐵−2 1.52

2
1.5
𝑡𝑅 𝐵−2 = 17.63 ∗ = 35.3 𝑚𝑖𝑛
1.06
Técnicas de optimización
Las ecuaciones están formadas por tres partes:
• Ecuación que describen la eficiencia en términos de 𝑁 o H.

• Término de selectividad α que depende de las propiedades de los solutos

• Término de retención, que depende de las propiedades del soluto y la columna.

La optimización se puede dar interviniendo en cualquiera de los tres factores de

la ecuación.
Técnicas de optimización
1. Variación en la altura del plato
La resolución de una columna mejora a media que la raíz cuadrada del número
de platos aumenta.

𝑁 𝛼−1 𝑘𝐵
𝑅𝑆 =
4 𝛼 1 + 𝑘𝐵

**Reduciendo la altura del plato y no aumentando la altura de la columna

Técnicas de optimización
2. Variación en el factor de retención k
El aumento de 𝑘𝐵 mejora la resolución de la
columna. Paras encontrar intervalo optimo de
𝑘𝐵 :
𝑘𝐵 1 + 𝑘𝐵 3
𝑅𝑆 = 𝑄 𝑡𝑅 𝐵 = 𝑄′
1 + 𝑘𝐵 𝑘𝐵 2

Donde Q y Q’ representan al resto de términos de

las ecuaciones.
Técnicas de optimización
3. Variación en el factor de selectividad α

Opciones disponibles para mejorar la selectividad

a) Cambia la composición de la fase móvil

b) Modificar la temperatura de la columna

c) Variar la composición de la fase estacionaria

d) Utilizar efectos químicos especiales

Problema general de la elución
Cambiar las condiciones de k mientras se da la
separación

• En cromatografía liquida se varia k cambiando la fase

móvil (elución por gradiente o programación del
disolvente)
• La elución en condiciones en las que la composición de
la fase móvil se mantiene constante se denomina
elución isocrática.
• Para la cromatografía de gases, se modifica la
temperatura para producir cambios en k (programación
de temperatura)