Está en la página 1de 19

RESUMEN: Extraer el pigmento de la espinaca para llevarlo a la C.C.F con la elaboracin previa de las cromatoplacas para encontrar el disolvente.

Que se utilizara en la C.C para separar los pigmentos vegetales que constituyen la mezcla. Posteriormente se verificara por C.C.F. si se logr la separacin de los pigmentos por C.C donde s se logr separar el pigmento y se distinguen la diferencia de colores.

CROMATOGRAFIA

La cromatografa puede definirse como la tcnica de separacin de una mezcla de solutos, basndose esta separacin en la diferente velocidad con que se mueve cada uno a travs de un medio poroso, arrastrados por un disolvente en movimiento. La cromatografa es un mtodo que permite separar los componentes de una mezcla de compuestos por distribucin entre dos fases, una de las cuales es mvil y la otra estacionaria. La fase estacionaria puede ser un slido o un lquido, este ltimo debe de estar inmvil sobre un soporte inerte. La fase mvil pude ser un lquido o un gas. Dependiendo de la naturaleza de las fases usadas; la cromatografa puede clasificarse en varios tipos: solido-liquido, liquido-liquido, solido-gas y liquidogas; por esta diversidad, la cromatografa en las ltimas dcadas ha adquirido un gran valor, ya que su empleo ha contribuido no solo a la identificacin sino tambin al aislamiento de compuestos que son de origen biolgico; aun en cantidades muy pequeas, dichos compuestos generalmente poseen propiedades fsicas y qumicas muy semejantes; siendo muy difcil por otras tcnicas conseguir tales resultados.

Las distintas tcnicas cromatografas se pueden dividir segn cmo est dispuesta la fase estacionaria:

Cromatografa plana. La fase estacionaria se sita sobre una placa plana o sobre un papel. Las principales tcnicas son:

Cromatografa en papel. Cromatografa en capa fina. Cromatografa en columna. La fase estacionaria se sita dentro de una columna. Segn el fluido empleado como fase mvil se distinguen: Cromatografa de lquidos. Cromatografa de gases. Cromatografa de fluidos supe crticos.

TIPO FASE MOVIL-FASE ESTACIONARIA

Cromatografa en papel (liquido-Solido) Cromatografa en capa fina (Liquido-Solido) Cromatografa de gases (Gas-Solido o liquido) Cromatografa liquida en fase inversa (Liquido (polar)-Solido o liquido (menos polar)) Cromatografa liquida en fase normal (Liquido (menos polar)-Solido o liquido (polar)) Cromatografa liquida de intercambio inico (Liquido (polar)-Solido) Cromatografa liquida de exclusin (Liquido-Solido) Cromatografa liquida de adsorcin (Liquido-Solido) Cromatografa de fluidos supercrticos (liquido-Solido)

Al enfrentarse con el problema de separar una mezcla completamente desconocida lo mejor es emplear un ensayo cromatogrfico por medio de la cromatografa en capa fina, la cual dar detalles acerca de la complejidad de la mezcla a separar. La cromatografa en capa fina es uno de los mtodos analticos ms sencillos ya que se utiliza poca cantidad de muestra, pues es sensible en alto grado y requiere de poco tiempo para separar compuestos

estructuralmente muy parecidos. Los resultados de la cromatografa son muy valiosos pues ayudan a seleccionar el adsorbente y eluyentes adecuados que pueden ser empleados para una separacin en columna.

CROMATOGRAFIA DE CAPA FINA La cromatografa sobre papel es muy verstil y sus mtodos se emplean con mucha frecuencia, pero su uso se limita a separaciones sobre celulosa, ya que otros medios adsorbentes, como la almina y el gel de slice, no pueden prepararse en forma de tiras. Esta dificultad puede superarse fabricando capas finas de estas sustancias sobre placas de vidrio. Las capas finas preparadas sobre vidrio se denominan cromatoplacas. Se usan dos tipos de capas: la capa compacta que se adhiere a la placa de vidrio por medio de un agente aglomerante incorporado al adsorbente o por las cualidades adherentes del propio material, y capa suelta. Estas ltimas solo se emplean en la determinacin de la actividad de los adsorbentes y en uno de dos casos especiales. Las separaciones sobre la capa finase parecen en muchos aspectos a la del papel, pero es posible la eleccin de muchos ms medios, ye que con esta tcnica pueden realizarse separaciones por reparto, filtracin sobre gel, adsorcin e intercambio inico. Las propiedades particulares de la cromatografa en capa fina permiten desarrollar el fraccionamiento en un periodo de tiempo mucho menor. Una razn de esto es el tamao de las partculas que constituyen los medios empleados en cromatografa en capa fina, por lo que se consiguen mejores resoluciones y manchas ms compactas. Las capas compactas se preparan aplicando una papilla del medio elegido en un disolvente adecuado, sobre las placas de vidrio. En la cromatografa de capa fina es posible emplearse cualquier medio, habiendo discutido que factores influyen en la eleccin. Los ms populares son la celulosa micro granular o micro cristalina, gel de slice (silica gel) en adsorcin y reparto y almina. La eleccin del disolvente depender de la naturaleza del compuesto que se va a separar y del material en que la separacin va llevarse a cabo. Una regla general para la eleccin del disolvente es la comparacin de la polaridad del mismo y de la sustancia que se va a separar, as aplicamos el criterio en el cual se emplea un disolvente poderoso (activos) para sustancias no polares y adsorbentes con menos actividad para sustancias ms polares.

El revelado de las placas pude llevarse a cabo con agentes corrosivos, tal como cidos concentrados y compuestos fuertemente oxidantes, a alta temperatura, debido a la naturaleza inorgnica de la capa. Otro reactivo muy empleado son los vapores de yodo. En una cmara que contiene en el fondo algunos cristales de yodo, se introduce el cromatograma y se deja durante unos minutos. El yodo tiende a concentrarse en los sitios donde estn los compuestos, por lo que aparece una mancha marrn oscuro, sobre el fondo amarillo plido. Otros mtodos que no afectan el revelado son la fluorescencia y la radioactividad. Muchas placas llevan sustancias fluorescentes como aditivos para el revelado de los compuestos, localizndose los mismos por la aparicin de machas no fluorescentes. Adems muchos compuestos que se separan absorben ultravioleta, siendo este el mtodo ms sencillo para localizarlos.

CROMATOGRAFIA DE COLUMNA (filtracin en gel) La cromatografa de filtracin en gel se realiza empleando unas matrices formadas por unas esferas porosas. El volumen de los poros es muy elevado y su dimetro est determinado. Cuando penetran en el lecho de la columna dos protenas de tamaos tales que una penetra en los poros de las bolas de gel y la otra no, la primera se reparte entre el espacio entre las bolas y el interior de los poros, reducindose la concentracin en la fase libre entre las bolas. La segunda protena, por tamao, slo puede encontrarse entre las bolas. El flujo de solvente es ms elevado entre las bolas que en el interior de los poros de stas, por lo que el efecto neto es el de acelerar el desplazamiento de las protenas de mayor peso molecular respecto al de las de menor peso molecular. En esta cromatografa se eluyen primero las protenas mayores, y en segundo lugar las menores, y tiene una gran influencia en el resultado la longitud de la columna y el volumen de la misma. Columnas largas aseguran separaciones de mayor calidad. Empleando patrones de protenas de peso molecular conocido se emplea para determinar el peso molecular de protenas de tamao desconocido. Son numerosos los adsorbentes empleados en la cromatografa de columna. Las separaciones pueden realizarse por reparto, adsorcin o intercambio inico. Pueden usarse cualquier medio adsorbente, siendo los ms generales la celulosa, gel de slice, almina, oxido de magnesio. El tamao de la columna est determinado por la cantidad de mezcla que se va a fraccionar. El primer paso en el montaje de la columna cromatogrfica es colocarla fija en posicin vertical. A continuacin se pone en la columna un disco de porcelana con varios orificios, y encima de este un poco de lana de vidrio. Este dispositivo

retiene el material solido de la columna, mientras que el lquido puede circular libremente. El adsorbente puede introducirse en seco, pero lo ms frecuente es echarlo en forma de una papilla con eluyente. La papilla formada por el adsorbente y el disolvente se agrega lentamente en porciones, lo que permite que se pose en el adsorbente por la fuerza de gravedad, hasta alcanzar la altura deseada. Finalmente se abre la llave inferior de la columna para que salga el exceso de disolvente contenido. La altura del disolvente no debe exceder ms de 2 a 5 mm sobre el slido. Una vez realizado esto la columna esta lista para introducir la muestra que se va a separar.

OBJETIVOS: Seleccionar a tcnica cromatogrfica para purificar compuestos coloridos y no coloridos. Identificar a la cromatografa en capa fina como una herramienta en la determinacin del nmero de componentes de una mezcla. Elegir la cromatografa en columna como una tcnica para purificacin de compuestos.

HIPOTESIS: En la cromatografa de capa fina obtendremos un buen ensayo para encontrar el eluyente ms apto para la CC, siendo este aquel que sea ms afn a la mezcla problema y muestre una mayor ascendencia en los componentes del extracto. En la cromatografa de columna observaremos la separacin de los componentes del extracto de la espinaca. MATERIALES EMBUDO DE SEPARACION 300ML SOPORTE UNIVERSAL 2 PINZAS DE TRES DEDOS CON NUEZ 20 CUBREOBJETOS 10 TUBOS DE ENSAYE GRADILLA 2PIPETAS GRADUADAS 5ML 20 FRASCOS DE JUGO GERBER MORTERO CON PISTILO CHAROLA DE ALUMINIO BOLA DE ALGODN EMBUDO TALLO CORTO 3 VASO DE PP DE 100 ML VASO DE PP DE 250 ml

REACTIVOS:

HEXANO 250 ml ETER DE PETROLEO 250 ml CICLOHEXANO 250 ml BENCENO 250 ml COLRURO DE METILO 250 ml TOLUENO 250 ml ETER DIETILICO 250 ml

CLOROFORMO 250 ml ACETONA 250 ml ETANOL 250 ml METANOL 250 ml SILICA GEL P/CAPA FINA 30gr SILICA GEL P/COLUMNA 30gr

PROCEDIMIENTO: Obtencin del extracto: 1. Se lav la espinaca para quitarle la tierra y suciedad que tuviera 2. Se macero la espinaca en un mortero con pistilo y se le agrego 10 ml de etanol para ayudar a la obtencin del extracto. 3. se agreg ____ ml de ____________ y _______ ml de _________ en total entre 3 veces que se realiz para la extraccin en un embudo de separacin (como no se separaba agregamos una disolucin de salmuera para ayudar a separar las fases). 4. se separan las fases en los vasos de precipitados y el que se va a utilizar es el concentrado verde, se le agrega el agente desecante se deja reposar en un recipiente perfectamente sellado (para evitar que el disolvente se evapore) y luego se filtra. Preparacin de la papilla para la cromatografa de capa fina: 1. Se coloc una cantidad de cloruro de metileno dentro de un frasco y se fue agregando poco a poco la silica gel para capa fina. 2. Se agito hasta que en el agitador se observ una capa opaca y uniforme (sin grumos y no debe ser espesa).

Preparacin de las cromatoplacas: 1. Se tomaron dos cubreobjetos juntos y se sumergieron en la papilla de silica gel. 2. Se sacaron cuidando no daar la papilla adherida al cubre objetos, se separaron y se colocaron en una charola de aluminio. 3. Se activaron las placas en la estufa a no ms de 100 por 5 min.

Preparacin de las cmaras de elucin: Se lavaron 20 frascos de gerber con tapa, se etiquetaron y se les coloco el papel filtro alrededor dejando solo una pequea ventana para observar el proceso. El desarrollo de las placas se lleva a cabo en las cmaras de elucin por el mtodo ascendente. En el interior de la cmara debe colocarse un papel filtro empapado de disolvente, que cubra las paredes interiores de la misma, para conseguir que la atmosfera este saturada de vapor del disolvente. El fondo de la cmara se cubre de disolvente hasta una altura de 0.5 a 1 cm y, despus de un periodo apropiado en el que se consigue el equilibrio se introduce la placa. Durante el desarrollo no puede moverse la cmara de elucin.

Eleccin de la efectividad del disolvente: 1. Se eligieron varias mezclas de disolventes con diferentes polaridades, sumando un total de 5 ml de cada combinacin. Se colocaron en la cmara de elucin y se esper a la absorcin del papel filtro. 2. En las cromatoplacas activadas se colocaron, con ayuda de un tubo capilar, dos puntos de la sustancia problema a una distancia de la base de la cromatoplacas a los puntos de 1 cm, para que el disolvente no toque los puntos. Guardando adems una distancia entre dichos puntos para evitar su cruce en la corrida cromatogrfica. 3. Se introdujeron las cromatoplacas en la cmara de elucin y se esper el ascenso del disolvente, cuidando que este no rebasara la capa de silica. 4. Al terminar la corrida se retir la cromatoplaca y se esper a su secado para corroborar la efectividad de la mezcla.

Preparacin de la columna para la cromatografa fraccionada: 1. Se mont la bureta en forma vertical se le agrego el eluyente q fue 70ml de hexano y 30ml de etanol para quitarle la burbuja de aire a la bureta Se le introdujo un pedazo de algodn en el fondo. 2. Se prepararon cerca de 8gr de silica para columna con el disolvente escogido y se vertieron en la columna esperando que la silica fuera asentndose lentamente hasta tener un aproximado a 10 cm de silica en la columna. 3. Se coloc despus cerca de 1 cm de sal, cuidando quedase esta de forma horizontal. CORRIDA DE LA CROMATOGRAFIA DE COLUMNA: 1. Se introdujo una cantidad de mezcla problema sobre la columna preparada y despus se coloc el disolvente elegido. 2. Se abri la llave de la bureta permitiendo la evacuacin del disolvente a ms o menos 1 gota cada 10 segundos. 3. Se esper a la separacin de los componentes de la sustancia problema reservando cada uno de ellos en tubos de ensaye. Separados por sus tonalidades en cada tubo desde el primero hasta el ltimo.

ES IMPORTANTE NO DEJAR SECAR LACOLUMNA DURANTE LA CORRIDAYA QUE SE ESTROPEARIA EL TRABAJO

COMPROBACION DE LOS COMPONENTES DE LA SUSTANCIA PROBLEMA:

Una vez obtenidos los componentes de la sustancia problema por separado en los tubos de ensaye: Para comprobar si los componentes de la sustancia se obtuvieron puros, se realiz una corrida en CCF para cada componente desde los ms claros hasta los ms oscuros. Se revelaron las cromatoplacas para ver si efectivamente los componentes eran puros. Aquellos que no se podan notar a simple vista se revisaron con luz UV en un lugar oscuro para una mayor eficacia.

Resultados:

ANALISIS DE RESULTADOS: En la cromatografa de capa fina cremos haber obtenido la mezcla de disolventes apropiada para realizar la CC, sin embargo comprobamos al final que tal vez pudo haberse adecuado alguna mezcla de mayor eficacia ya que al comprobar la pureza de los extractos no fue posible encontrarlos todos ellos en estado puro. Algunos de estos estaban en mezcla. Por lo tanto recomendamos realizar la eleccin de la mezcla de disolventes de una manera ms eficaz, lo cual permitira una mejor obtencin de los componentes en sus estados puros.

CONCLUSION: La cromatografa es un mtodo muy recomendable para quien quiere comprobar los componentes de una mezcla descocida. Facilita en todo caso la obtencin de estos y resulta ser sencilla y superficial (CCF) o compleja y eficaz (CC).

BIBLIOGRAFIA:

http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/cromatografia.htm http://www.uprm.edu/biology/profs/velez/cromatografias.htm Anlisis qumico e instrumental moderno. Harold F. Walton y Jorge Reyes. Ed. Revert. Mxico D.F. Anlisis Qumico Cuantitativo. Gilbert H. Ayres. Ed. Harla. Mexico D.F.

CUESTIONARIO: A qu grupo de compuestos pertenecen los pigmentos? Carotenoides y a la Clorofila A qu se deben que estos compuestos sean coloridos? A la presencia de los carotenoides que otorgan ese color respectivo amarillo y naranja o rojos y a la clorofila, esta da un color verde caracterstico de los vegetales. Explique la diferencia entre cromatografa de adsorcin y particin. Los mtodos cromatogrficos se pueden clasificar de acuerdo a la naturaleza de las fases estacionarias y mviles. Cromatografa de adsorcin: Cuando la fase estacionaria es un slido Cromatografa de reparto: Cuando la fase estacionaria es un lquido Cules son las ventajas y desventajas de la cromatografa en capa fina en comparacin con la cromatografa en columna? La cromatografa en capa fina presenta una serie de ventajas frente a otros mtodos cromatogrficos (en columna, en papel, en fase gaseosa, ...) ya que el utillaje que precisa es ms simple. El tiempo que se necesita para conseguir las separaciones es mucho menor y las separacin es generalmente mejor. Pueden usarse reveladores corrosivos, que sobre papel destruiran el cromatograma. El mtodo es simple y los resultados son fcilmente reproducibles, lo que hace quesea un mtodo adecuado para fines analticos. En la cromatografa en columna, se pueden obtener las separaciones de los compuestos coloridos, las cuales pueden concentrarse y as obtenerse cada uno de los componentes por separados, es decir es un proceso de purificacin y aislamiento total de la sustancia. La desventaja de este mtodo es que solo es para sustancias coloridas, para que puedan observarse las separaciones

Explique la diferencia que existe entre el adsorbente utilizado en cromatografa en capa delgada y el de columna. Hacer una lista en orden creciente de actividad En columna: Puede usarse cualquier medio adsorbente siendo los ms generales la celulosa, gel de slice, almina oxido de magnesio, oxido de clcico y carbn activo (para separaciones por adsorcin y de intercambio inico). Se emplea para la separacin de mezclas o purificacin de sustancias a escala

preparativa. Como fase estacionaria se usa, generalmente, gel de slice o almina dentro de una columna. La eleccin del disolvente es crucial para una buena separacin. Dicho disolvente pasa a travs de la columna por efecto de la gravedad o bien por aplicacin de presin (cromatografa flash). La columna se prepara mezclando el soporte con disolvente

Capa delgada: Silica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones) xido de Aluminio Almina (cida, neutra bsica) Celulosa (Nativa o micro-cristalina) Poliamidas Estos adsorbentes deber tener las siguientes caractersticas: Tamao de Partcula Volumen de Poro Dimetro de Poro rea Superficial Homogeneidad Pureza

Hacer una lista de los eluyentes usados comnmente en cromatografa en columna y capa delgada en orden creciente de polaridad. En capa fina: ter de petrleo Tolueno Dietil-ter, t-butil-ter Diclorometano Acetato de etilo n-pentano, n-hexano Ciclohexano

Tetracloruro de carbono ter dietlico Cloroformo Acetona Iso-propanol Etanol Metanol cido actico

Como se prepara el capilar para aplicar la muestra en la cromatoplaca?

Se le aplica calor para as poder romperlo pero esto hace que n nos quede un orificio muy grande

Porque es necesario que la cmara de elusin este saturada con los vapores del eluyente? Porque as ser mas fcil el arrastre de los pigmentos

Explique cada uno de los siguientes trminos: Eluyente: Un eluyente es un solvente que se usa en tcnicas de cromatografa para extraer un compuesto que se quiere separar de otra fase. Eluato: la sustancia que se separa o sale de la columna despus de cada extraccin. Eluccion fraccionada: Aparato de elucin fraccionada electrofortico tiene una columna con una rotacin conjunta de sello en el que un delgado chorro de elucin bfer es dirigido a travs de la luz de la columna electrofortica en una direccin perpendicular a la de migracin electrofortica. El contenido de la columna se gira en relacin con el jet estacionario o se gira el jet con respecto a la columna. El sistema puede emplear electroforesis en solucin libre o en columnas empaquetadas.

Adsorcion: La adsorcin es un proceso donde un slido se utiliza para eliminar una sustancia soluble del agua. Es un proceso por el cual tomos, iones o molculas son atrapados o retenidos Elusin: se produce por el flujo de una fase mvil de gas inerte Adsorbente: es un slido que tiene la capacidad de retener sobre su superficie un componente presente en corrientes lquidas o gaseosas. Se caracterizan por una alta superficie especfica y por su inercia qumica frente al medio en el que se van a utilizar. Actividad del adsorbente: El nivel de actividad de la adsorcin depende de la concentracin de la sustancia en el agua, la temperatura y la polaridad de la sustancia. Una sustancia polar (= soluble en agua) no puede ser eliminada. Cmo se prepara la papilla para la cromatografa en capa fina? Se machaca con ayuda de un mortero y pistilo hasta llegar a una papilla

Cundo es conveniente activar una placa y como se activa? Antes de que se puedan usar las placas generalmente deben ser calentadas para retirar el agua que acta como una impureza y evita una buena separacin. La magnitud de calor depende del tipo de separacin que se requiere para compuestos hidrofilicos o polares, el secado al aire o con un secador de pelo son generalmente adecuados, para los compuestos hidrofobicos o no polares es necesario un calentamiento ms intenso. Las placas de oxido de aluminio y de gel de slice con adhesivo requieren ser secadas al aire durante aproximadamente 30 min. Y despus ser activadas en un horno a 100C alrededor de 30 min. Las placas de celulosa debern secarse al aire libre durante 30 min. y activarse al horno durante 10 min. A 105C.

Cmo se controla la salida de los componentes en una cromatografa en columna? Se controla con la llave de la bureta se va colocando los distintos pigmentos en tubos de ensaye.

Por qu es importante que la muestra a separar por cromatografa deba estar lo mas seca posible?

Las cantidades altas de flujo dan malas separaciones, el promedio es 3 a 4ml/min. en una columna de 40 cm. de altura.

Qu espesor debe tener la fase estacionaria en una C.C.D.? No tiene que ser espeso y No debe ser muy aguado, debe deslizarse solo por la placa.

Cmo debe de ser la polaridad del eluyente al empacar una columna? La polaridad del eluyente debe ser mayor

Cul es el orden de polaridad en que salen los compuestos de una cromatografa en columna? En la cromatografa de columna las molculas de una mezcla son separadas en base a la afinidad de las molculas por la fase estacionaria o por la fase mvil. Si una molcula A tiene ms afinidad por la fase estacionaria que la B, B bajar ms rpido que A. ter de petrleo. ter dietlico. Ciclohexano. Acetato de etilo. Tetracloruro de carbono.* Piridina. Benceno.* Etanol. Cloroformo.* Metanol. Diclorometano. Agua. cido actico.

*compuestos cancergenos.