UNE-EN 16618-2015. Análisis de Los Productos Alimenticios. Determinación de Acrilamida en Alimentos.

norma UNE-EN 16618
española
Noviembre 2015
TÍTULO Análisis de los productos alimenticios
Determinación de acrilamida en alimentos mediante cromato-

grafía en fase líquida acoplada con espectrometría de masas
(LC-ESI-MS-MS)
Food analysis. Determination de acrylamide in food by liquid chromatography tandem mass spectrometry
(LC-ESI-MS/MS).
Analyse des produits alimentaires. Dosage de l'acrylamide dans les produits alimentaires par chromato-
graphie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (CL-ESI-SM-SM).
CORRESPONDENCIA Esta norma es la versión oficial, en español, de la Norma Europea EN 16618:2015.
OBSERVACIONES
ANTECEDENTES Esta norma ha sido elaborada por el comité técnico AEN/CTN 34 Productos
alimentarios cuya Secretaría desempeña FIAB.
Editada e impresa por AENOR LAS OBSERVACIONES A ESTE DOCUMENTO HAN DE DIRIGIRSE A:
Depósito legal: M 35229:2015
26 Páginas
 AENOR 2015 Génova, 6 info@aenor.es Tel.: 902 102 201

Reproducción prohibida 28004 MADRID-España www.aenor.es Fax: 913 104 032
Este documento ha sido adquirido por UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER a través de la suscripción a AENORmás.
Para uso en red interna se requiere de autorización previa de AENOR.
S
NORMA EUROPEA
EUROPEAN STANDARD EN 16618
NORME EUROPÉENNE
EUROPÄISCHE NORM Abril 2015
ICS 67.050; 67.060; 67.080.20; 67.140.20
Versión en español
Análisis de los productos alimenticios

Determinación de acrilamida en alimentos mediante cromatografía en fase líquida
acoplada con espectrometría de masas (LC-ESI-MS-MS)
Food analysis. Determination de Analyse des produits alimentaires. Dosage Lebensmittelanalytik. Bestimmung von
acrylamide in food by liquid de l'acrylamide dans les produits Acrylamid in Lebensmitteln mit
chromatography tandem mass alimentaires par chromato-graphie en Flüssigchromatographie und Tandem-
spectrometry (LC-ESI-MS/MS). phase liquide couplée à la spectrométrie de Massenspektrometrie (LC-ESI-MS/MS).
masse en tandem (CL-ESI-SM-SM).
Esta norma europea ha sido aprobada por CEN el 2015-02-07.
Los miembros de CEN están sometidos al Reglamento Interior de CEN/CENELEC que define las condiciones dentro de
las cuales debe adoptarse, sin modificación, la norma europea como norma nacional. Las correspondientes listas
actualizadas y las referencias bibliográficas relativas a estas normas nacionales pueden obtenerse en el Centro de
Gestión de CEN, o a través de sus miembros.
Esta norma europea existe en tres versiones oficiales (alemán, francés e inglés). Una versión en otra lengua realizada
bajo la responsabilidad de un miembro de CEN en su idioma nacional, y notificada al Centro de Gestión, tiene el mismo
rango que aquéllas.
Los miembros de CEN son los organismos nacionales de normalización de los países siguientes: Alemania, Antigua
República Yugoslava de Macedonia, Austria, Bélgica, Bulgaria, Chipre, Croacia, Dinamarca, Eslovaquia, Eslovenia,
España, Estonia, Finlandia, Francia, Grecia, Hungría, Irlanda, Islandia, Italia, Letonia, Lituania, Luxemburgo, Malta,
Noruega, Países Bajos, Polonia, Portugal, Reino Unido, República Checa, Rumanía, Suecia, Suiza y Turquía.
CEN
COMITÉ EUROPEO DE NORMALIZACIÓN
European Committee for Standardization
Comité Européen de Normalisation
Europäisches Komitee für Normung
CENTRO DE GESTIÓN: Avenue Marnix, 17-1000 Bruxelles
 2015 CEN. Derechos de reproducción reservados a los Miembros de CEN.
EN 16618:2015 -4-
Índice
Prólogo...................................................................................................................................................... 5
1 Objeto y campo de aplicación ................................................................................................ 6
2 Normas para consulta ............................................................................................................ 6
3 Principio .................................................................................................................................. 6
4 Reactivos.................................................................................................................................. 6
5 Aparatos .................................................................................................................................. 9
6 Preparación de la muestra ................................................................................................... 10
7 Medición ................................................................................................................................ 13
8 Determinación de las concentraciones ................................................................................ 16
9 Precisión ................................................................................................................................ 18
10 Informe del análisis .............................................................................................................. 20
Anexo A (Informativo) Cromatogramas típicos ................................................................................ 21
Anexo B (Informativo) Datos de precisión ......................................................................................... 22
Bibliografía............................................................................................................................................. 26
-5- EN 16618:2015
Prólogo
Esta Norma EN 16618:2015 ha sido elaborada por el Comité Técnico CEN/TC 275 Análisis de los
productos alimenticios. Métodos horizontales, cuya Secretaría desempeña DIN.
Esta norma europea debe recibir el rango de norma nacional mediante la publicación de un texto idéntico
a ella o mediante ratificación antes de finales de octubre de 2015, y todas las normas nacionales
técnicamente divergentes deben anularse antes de finales de octubre de 2015.
Se llama la atención sobre la posibilidad de que algunos de los elementos de este documento estén sujetos
a derechos de patente. CEN y/o CENELEC no es(son) responsable(s) de la identificación de dichos
derechos de patente.
Esta norma europea ha sido elaborada bajo un Mandato dirigido a CEN por la Comisión Europea y por la
Asociación Europea de Libre Comercio.
ADVERTENCIA – El uso de esta norma europea puede implicar el uso de materiales, operaciones
y equipamiento peligrosos. Esta norma europea no tiene por objeto establecer todos los problemas
de seguridad asociados a su utilización. Es responsabilidad del usuario de esta norma europea
establecer las prácticas de seguridad e higiene adecuadas y determinar si existen limitaciones
reglamentarias aplicables antes de su utilización.
De acuerdo con el Reglamento Interior de CEN/CENELEC, están obligados a adoptar esta norma europea
los organismos de normalización de los siguientes países: Alemania, Antigua República Yugoslava de
Macedonia, Austria, Bélgica, Bulgaria, Chipre, Croacia, Dinamarca, Eslovaquia, Eslovenia, España,
Estonia, Finlandia, Francia, Grecia, Hungría, Irlanda, Islandia, Italia, Letonia, Lituania, Luxemburgo,
Malta, Noruega, Países Bajos, Polonia, Portugal, Reino Unido, República Checa, Rumanía, Suecia, Suiza
y Turquía.
EN 16618:2015 -6-
1 Objeto y campo de aplicación

Esta norma europea describe un método para la determinación de acrilamida en productos de panadería tales como el
pan, el pan tostado, el pan crujiente, las galletas de mantequilla y las galletas, así como en productos a base de patata,
como las patatas fritas, las patatas fritas crujientes y las tortas de patata, y en café tostado, mediante cromatografía
líquida en combinación con ionización por electrospray y espectrometría de masas en tándem (LC-ESI-MS/MS). Este
método se ha validado en un estudio interlaboratorios mediante el análisis de muestras contaminadas tanto de forma
natural como artificial a unos niveles comprendidos entre 14,3 μg/kg y 9 083 μg/kg. El estudio se desarrolló en el
Swedish National Food Administration y se validó mediante un estudio organizado por el Directorate General Joint
Research Centre (DG JRC), el Swedish National Food Administration y el Nordic Committee on Food Analysis
(NMKL), (véanse las referencias [1] y [2] de la bibliografía).
El límite de cuantificación (LOQ, limit of quantification) depende del tipo de instrumento utilizado y del
funcionamiento real del instrumento. La mayoría de los laboratorios que participaron en el estudio de validación fueron
capaces de determinar acrilamida en una muestra de galleta de mantequilla a un nivel de 14,3 μg/kg. Por lo tanto, la
validación mediante el estudio interlaboratorios mostró que cabe esperar que el LOQ se encuentre en un rango de
menos de 15 μg/kg a 30 μg/kg.
2 Normas para consulta

Los documentos indicados a continuación, en su totalidad o en parte, son normas para consulta indispensables para la
aplicación de este documento. Para las referencias con fecha, sólo se aplica la edición citada. Para las referencias sin
fecha se aplica la última edición (incluyendo cualquier modificación de ésta).
EN ISO 1042:1999, Material de vidrio para laboratorio. Matraces aforados con una línea de enrase (ISO 1042:1998).
EN ISO 3696:1995, Agua para uso en análisis de laboratorio. Especificación y métodos de ensayo (ISO 3696:1987).
3 Principio
Se extrae la acrilamida con agua y se añade acrilamida marcada isotópicamente. El extracto se centrifuga y el
sobrenadante se lava con dos columnas de extracción en fase sólida (SPE, solid phase extraction). La primera columna
de SPE contiene grupos C18 sobre una base de sílice así como intercambiadores aniónicos y catiónicos. Dado que la
acrilamida no queda retenida en la columna, simplemente se pasa el extracto y se recoge. El motivo de utilizar la
columna es retener la mayor cantidad posible de componentes de la matriz (compuestos apolares así como aniónicos y
catiónicos) sin retener a la acrilamida. Es decir, la primera columna de SPE se utiliza como un filtro químico.
La segunda columna de SPE contiene una fase a base de un polímero con capacidad relativamente alta de unión de
acrilamida. El extracto se carga en la columna, se lava la columna con agua y finalmente se eluye con una mezcla
consistente en 60 volúmenes de metanol y 40 volúmenes de agua. La finalidad de esta etapa, además de lavar más el
extracto, es concentrarlo y reducir el límite de cuantificación.
Tras la evaporación del metanol, el extracto se analiza mediante LC-MS/MS. Para ello, se utiliza una columna de HPLC
con fase estacionaria de carbono grafitizado ya que el factor de retención (k) es relativamente alto (k = 4) cuando no se
añade ningún disolvente orgánico a la fase móvil en comparación con otras columnas comerciales disponibles en el
mercado.
4 Reactivos
Salvo indicación en sentido contrario, se utilizan exclusivamente reactivos de grado analítico reconocido y agua que
cumpla los requisitos de grado 1 conforme a la Norma EN ISO 3696:1995. Los disolventes deben de ser de calidad
adecuada para HPLC.
-7- EN 16618:2015
4.1 Acrilamida (CAS 79-06-1), de una pureza no inferior a una fracción de masa del 99,9%.
La estructura química es:
Figura 1 – Acrilamida
AVISO – La acrilamida se ha clasificado por la Agencia Internacional para la Investigación sobre el Cáncer
(IARC) como un probable carcinógeno para los humanos. Se debe utilizar equipamiento de protección
individual como bata de laboratorio, guantes desechables y gafas de seguridad. Toda la manipulación de la
acrilamida y de los disolventes orgánicos debe realizarse dentro de una campana de gases con un flujo de
ventilación adecuado.
4.2 Acrilamida marcada con deuterio – acrilamida-2,3,3-D3 (CAS 122775-19-3).
La estructura química es:
Figura 2 – Acrilamida marcada con deuterio
Alternativamente, podría utilizarse acrilamida marcada con 13C (acrilamida-13C, CAS 287399-26-2).
4.3 Metanol (CAS 67-56-1).
4.4 Ácido acético glacial (CAS 64-19-7).
4.5 n-Hexano (CAS 110-54-3).
Alternativamente, podría utilizarse ciclohexano (CAS 110-82-7).
4.6 Eluyente para la columna 2 de SPE (5.2.3)

Se mezclan 60 volúmenes de metanol (4.3) con 40 volúmenes de agua.
4.7 Fase móvil para HPLC

Se mezcla 1 volumen de ácido acético glacial (4.4) con 1 000 volúmenes de agua.
4.8 Disoluciones concentradas de acrilamida y acrilamida-2,3,3-D3, concentración en masa  = 1 000 μg/ml.

Se pesan con una aproximación de 0,05 mg, unos 100 mg de acrilamida y acrilamida-2,3,3-D3, respectivamente, y se
llevan por separado a matraces aforados de 100 ml, se disuelven en agua y se diluyen hasta un volumen de 100 ml. Las
disoluciones pueden almacenarse a una temperatura de 4 ºC durante un tiempo mínimo de 3 meses.
EN 16618:2015 -8-
4.9 Disolución patrón interno nº 1,  = 10 μg/ml.

Se transfieren 1 000 μl de la disolución concentrada de acrilamida-2,3,3-D3 (4.8) a un matraz aforado de 100 ml y se
enrasa con agua.
4.10 Disolución patrón interno nº 2,  = 1 000 ng/ml.
Se transfieren 5 000 l de la disolución patrón interno nº 1 (4.9) a un matraz aforado de 50 ml y se enrasa con agua.
4.11 Disolución patrón de acrilamida nº 1,  = 100 μg/ml.

Se transfieren 5 000 μl de la disolución concentrada de acrilamida (4.8) a un matraz aforado de 50 ml y se enrasa con
agua.
4.12 Disolución patrón de acrilamida nº 2,  = 10 μg/ml.

Se transfieren 5 000 μl de la disolución patrón de acrilamida nº 1 (4.11) a un matraz aforado de 50 ml y se enrasa con
agua.
4.13 Disolución patrón de acrilamida nº 3,  = 100 ng/ml.

Se transfieren 1 000 μl de la disolución patrón de acrilamida nº 2 (4.12) a un matraz aforado de 100 ml y se enrasa con
agua.
4.14 Disoluciones de calibración para LC-MS

Se diluyen alícuotas de las disoluciones patrón (4.9), (4.11), (4.12) y (4.13) con agua para preparar disoluciones de
calibración de acrilamida de por ejemplo 0 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml, 250 ng/ml,
500 ng/ml, 1 000 ng/ml, 2 000 ng/ml, 5 000 ng/ml y 10 000 ng/ml respectivamente, todas ellas con 400 ng/ml de
acrilamida-2,3,3-D3. En la tabla 1 se ofrecen ejemplos sobre la preparación de las disoluciones de calibración. La
tabla 2 muestra la relación entre las concentraciones de las disoluciones de calibración y el contenido de acrilamida en
las muestras de alimentos. La calibración debe realizarse como mínimo con seis niveles de concentración distribuidos
adecuadamente a lo largo del rango de trabajo. Debería analizarse un número de disoluciones de calibración aún mayor
si el rango de concentraciones que debe cubrirse es más amplio (desde 0 μg/kg hasta 10 000 μg/kg).
Tabla 1 – Preparación de las disoluciones de calibración para LC-MS
Disolución de Matraz aforado Disolución patrón interno Disolución patrón de

calibración acrilamida
ng/ml ml μl μl
0 100 4 000 0
5 100 4 000 5 000 de (4.13)
10 100 4 000 10 000 de (4.13)
20 100 4 000 200 de (4.12)
50 100 4 000 500 de (4.12)
100 100 4 000 1 000 de (4.12)
250 100 4 000 2 500 de (4.12)
500 100 4 000 5 000 de (4.12)
1 000 100 4 000 1 000 de (4.11)
2 000 100 4 000 2 000 de (4.11)
5 000 100 4 000 5 000 de (4.11)
10 000 50 4 000 5 000 de (4.11)
-9- EN 16618:2015
Tabla 2 – Relación entre el contenido de acrilamida de las disoluciones de calibración

y el contenido en los alimentos
Disolución de calibración Productos de panadería y a base de patata Café tostado

ng/ml μg/kg μg/kg
10 10 50
5 Aparatos
El equipamiento y el material de vidrio habitual de un laboratorio y en particular, lo siguiente:
5.1 Sistema de LC-MS/MS
5.1.1 Aparato de HPLC, compuesto de:
5.1.1.1 Compartimento de columna termostatizado.
5.1.1.2 Sistema de inyección, que pueda inyectar 10 μl de muestra.
5.1.1.3 Bomba para la fase móvil, capaz de mantener el flujo de la fase móvil en 0,4 ml/min.
5.1.2 Columna de HPLC

La fase estacionaria de la columna es carbono grafitizado 1a) de un tamaño de partículas de 5 µm, con unas dimensiones
de 50 mm  2,1 mm, con una columna de protección1a), de un tamaño de partículas de 5 µm, con unas dimensiones de
10 mm  2 mm.
Pueden utilizarse columnas/fases estacionarias alternativas siempre que pueda demostrarse un funcionamiento similar
de la columna de carbono grafitizado.
5.1.3 Espectrómetro de masas

Un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo que funcione por electrospray positivo y con modo de monitorización
selectiva de reacción (SRM, selected reaction monitoring), programado para obtener una resolución hasta las unidades.
5.1.4 Sistema de adquisición de datos y de análisis

Un programa informático adecuado de recogida y evaluación de datos.
5.1.5 Válvula de desvío de flujo (opcional)

Válvula de HPLC instalada entre la columna de HPLC y el espectrómetro de masas para dirigir el efluente de la
columna de HPLC bien hacia los residuos o bien hacia el espectrómetro de masas, véase el apartado 7.1.1.
5.2 Sistema de extracción en fase sólida
5.2.1 Sistema de vacío con colector de múltiples vías para la extracción en fase sólida
1) a) La columna HypercarbTM, la columna Hypersil-Keystone® de Thermo, b) la columna ISOLUTE ® Multimode SPE y c) la columna
ISOLUTE ® ENV + SPE de Biotage® son ejemplos de productos comerciales adecuados disponibles en el mercado. Esta información se facilita
por su utilidad para los usuarios de esta norma europea sin que ello constituya una recomendación por parte de CEN hacia los productos
mencionados. Pueden utilizarse productos equivalentes siempre que pueda demostrarse que proporcionan los mismos resultados.
EN 16618:2015 - 10 -
5.2.2 Columna 1 de SPE

Columna SPE multimodal apolar, con propiedades apolares, de intercambiador aniónico fuerte y de intercambiador
catiónico fuerte1b), 1 000 mg/6 ml.
5.2.3 Columna 2 de SPE

Copolímero de poliestireno-divinilbenceno entrecruzados para la extracción de analitos polares a partir de muestras
acuosas1c), 500 mg/6 ml.
5.3 Balanza analítica, de una exactitud de 0,01 mg.
5.4 Granatario, de una exactitud de 0,01 g.
5.5 Micropipetas de precisión calibradas, de 200 μl a 1 000 μl y de 1 000 μl a 5 000 μl de capacidad.
5.6 Tubos de centrífuga, de 50 ml de capacidad, de polipropileno, desechables.
5.7 Agitador mecánico, por ejemplo un agitador de brazo articulado, que permita mezclar bien las diferentes fases,
que pueda sostener tubos de centrífuga de 50 ml.
5.8 Mezclador de vórtex.
5.9 Centrífuga refrigerada, capaz de alcanzar una fuerza centrífuga de 3 600 g con tubos de centrífuga de 50 ml.
5.10 Matraces aforados, de 50 ml, 100 ml, etc. de capacidad, conforme a la Norma EN ISO 1042:1999.
5.11 Viales de vidrio, de una capacidad de como mínimo 4 ml, adecuados para el equipo de evaporación.
5.12 Viales de vidrio de color ámbar para la carga automática de las muestras, adecuados para el inyector
automático de muestras del HPLC.
5.13 Equipamiento de evaporación, mediante vacío o por una corriente de un gas inerte.
La temperatura de evaporación no debe ser mayor de 40 ºC.
6 Preparación de la muestra
6.1 Generalidades
En algunas ocasiones se han encontrado restos de acrilamida en el material de laboratorio, por ejemplo en los filtros. Se
comprueba que el material de laboratorio no contiene cantidades apreciables de acrilamida y se incluyen muestras en
blanco del procedimiento como controles junto con cada serie de muestras.
Se ha comprobado que la acrilamida se produce como artefacto en algunos procesos analíticos para acrilamida, por
ejemplo durante la extracción o en el puerto de inyección de los instrumentos de GC. Incluso aunque no sea un
problema para el análisis mediante HPLC, se asegura que no se superan nunca los 40 ºC durante los procesos de
extracción o preparación.
- 11 - EN 16618:2015
Se ha demostrado que la acrilamida se extrae de forma eficaz de distintos tipos de alimentos mediante agitación en
agua, siempre que las partículas de las muestras sean suficientemente pequeñas. Se comprueba que las partículas son de
un tamaño < 1 mm antes de la extracción y se utiliza, en caso necesario, un dispositivo mecánico para la preparación de
una pasta homogénea2).
A veces los extractos de las muestras pueden ocasionar problemas, por ejemplo obstruyendo las columnas de SPE.
Puede reducirse la cantidad de extracto cargada en las columnas de SPE siempre que el tamaño de los picos tanto de
acrilamida como del patrón interno sean suficientemente grandes como para cumplir los criterios de cuantificación.
NOTA Se ofrece información complementaria sobre la preparación de la muestra y la separación cromatográfica de la acrilamida en las referencias
de Petersson et al. [3] y de Rosén et al. [1] de la bibliografía.
6.2 Extracción
6.2.1 Procedimiento de extracción para muestras de productos de panadería y productos a base de patata
Se pesa, con una aproximación de 0,01 g, una porción para análisis de 2,0 g y se lleva a un tubo de centrífuga de 50 ml
(5.6). Se añaden 40 ml de agua. Se añaden 400 μl de la disolución patrón interno nº 2, c = 1 000 ng/ml (4.10). Se agita
intensamente a mano durante un tiempo de 15 s a 30 s, a continuación durante un tiempo de 10 s a 15 s con un agitador
vórtex (5.8) y finalmente durante 60 min en un agitador mecánico (5.7) ajustado a su máxima capacidad de agitación
muestra-disolvente. Se centrifuga en una centrífuga refrigerada (5.9) a una temperatura de 10 ºC, a 3 600  g durante
20 min, se recogen 10 ml de la fase acuosa y se depositan en un tubo de ensayos limpio. Se evita transferir nada de la
capa de materia grasa que se formará y depositará en la parte superior en función del contenido de materia grasa de la
muestra.
Se presta atención en que se haya formado una pasta homogénea y que toda la muestra haya entrado en contacto con el
reactivo de extracción. Si por algún motivo el procedimiento descrito no resulta suficiente para conseguir una pasta
homogénea, debe aplicarse una fuerza mecánica superior, por ejemplo utilizando un dispositivo adecuado para la
preparación de una pasta homogénea.
6.2.2 Procedimiento de extracción para muestras de café

Se pesa, con una aproximación de 0,01 g, una porción para análisis de 2,0 g y se lleva a un tubo de centrífuga de 50 ml
(5.6). Se añaden 5 ml de n-hexano (o alternativamente, de ciclohexano). Se añaden 40 ml de agua. Se añaden 400 μl de
la disolución de patrón interno nº 2, c = 1 000 ng/ml (4.10). Se agita intensamente a mano durante un tiempo de 15 s a
30 s, a continuación durante un tiempo de 10 s a 15 s con un agitador vórtex (5.8) y finalmente durante 60 min en un
agitador mecánico (5.7) ajustado a su máxima capacidad de agitación muestra-disolvente. Se centrifuga en una
centrífuga refrigerada (5.9) a una temperatura de 10 ºC, a 3 600  g durante 20 min. Se comprueba que se ha producido
una correcta separación de fases entre el n-hexano (o el ciclohexano), la fase acuosa y la fase sólida. Se retira y desecha
la fase del disolvente orgánico (n-hexano o ciclohexano) y se transfieren 10 ml de la fase acuosa a un tubo de ensayos
limpio.
Se presta atención en que se haya formado una pasta homogénea y que toda la muestra haya entrado en contacto con el
reactivo de extracción. Si por algún motivo el procedimiento descrito no resulta suficiente para producir una pasta
homogénea, debe aplicarse una fuerza mecánica superior, por ejemplo utilizando un dispositivo adecuado para la
preparación de una pasta homogénea.
NOTA El ciclohexano es una alternativa adecuada para el n-hexano.
2) Ultra Turrax® y el mezclador Waring blender® son ejemplos de productos comerciales adecuados disponibles en el mercado. Esta información
se facilita por su utilidad para los usuarios de esta norma europea sin que ello constituya una recomendación por parte de CEN hacia los
productos mencionados. Pueden utilizarse productos equivalentes siempre que pueda demostrarse que proporcionan los mismos resultados.
EN 16618:2015 - 12 -
6.3 Lavado
6.3.1 Lavado para muestras de productos a base de patata y de panadería
Para todas las etapas, se ajusta el flujo de las columnas de SPE para que el líquido eluya gota a gota (unas 30 gotas por
minuto). Se verifica que la acrilamida ha eluido completamente de la columna 2 de SPE (5.2.3) registrando el perfil de
elución, al menos con cada lote nuevo de productos.
Se acopla la columna 1 de SPE (5.2.2) al colector de vacío de múltiples vías (5.2.1). Se equilibra la columna con 3 ml
de metanol y dos veces con 6 ml de agua. Se pasan 10 ml del extracto en agua (6.2.1) a través de la columna y se recoge
el eluido.
de metanol y 5 ml de agua. Se carga el extracto (aproximadamente 10 ml) procedente de la columna anterior y se
desecha el eluido. Se lava la columna una vez con 4 ml de agua y se desecha el disolvente de lavado. Se comprueba que
no queda nada de eluido en las válvulas o en los canales de flujo del colector de vacío, por ejemplo situando la columna
en otra posición (seca) del colector. El disolvente de lavado que queda en las válvulas podría contener sustancias
coextraídas que podrían interferir con el pico del patrón interno. Tras el lavado, la acrilamida se eluye con 2 ml de
metanol al 60% en agua (4.6). Se recoge el disolvente de elución junto con el disolvente residual de la columna
(aplicando un vacío suave o una presión suave) dentro de un vial de como mínimo 4 ml, compatible con el equipo de
evaporación (5.11).
Se evapora el metanol del extracto, siempre manteniendo una temperatura inferior a 40 ºC, lo cual puede realizarse
utilizando por ejemplo un evaporador de vórtex a vacío aproximadamente durante 30 min a 40 ºC, o mediante una
corriente suave de un gas inerte, calentando el vial de vidrio a una temperatura máxima de 40 ºC. El volumen no se
reduce por debajo de aproximadamente 500 μl. La muestra se transfiere a un vial de carga automática adecuado y se
realiza el análisis mediante LC-MS/MS.
6.3.2 Lavado para muestras de café

Para todas las etapas, se ajusta el flujo de las columnas de SPE para que el líquido eluya gota a gota (unas 30 gotas por
minuto). Se verifica que la acrilamida ha eluido completamente de la columna 2 de SPE (5.2.3) registrando el perfil de
elución, al menos con cada lote nuevo de productos.
de metanol y dos veces con 6 ml de agua. Se pasan 2 ml de la fase acuosa (6.2.2) a través de la columna, seguido de
3 ml de agua y se recoge el líquido de elución de forma conjunta, que por consiguiente supone en total unos 5 ml.
de metanol y 5 ml de agua. Se carga el extracto (aproximadamente 5 ml) procedente de la columna anterior y se desecha
el eluido. Se lava la columna una vez con 4 ml de agua y se desecha el disolvente de lavado. Se comprueba que no
queda nada de eluido en las válvulas o los canales de flujo del colector de vacío, por ejemplo situando la columna en
otra posición (seca) del colector. El disolvente de lavado que queda en las válvulas podría contener sustancias
coextraídas que podrían interferir con el pico del patrón interno. Tras el lavado, la acrilamida se eluye con 2 ml de
metanol al 60 % en agua (4.6). Se recoge el disolvente de elución junto con el disolvente residual de la columna
(aplicando un vacío suave o una presión suave) dentro de un vial de como mínimo 4 ml compatible con el equipo de
evaporación (5.11).
Se evapora el metanol del extracto, siempre manteniendo una temperatura inferior a 40 ºC, lo cual puede realizarse
utilizando por ejemplo un evaporador de vórtex a vacío aproximadamente durante 30 min a 40 ºC, o mediante una
corriente suave de un gas inerte, calentando el vial de vidrio a una temperatura máxima de 40 ºC. El volumen no se
reduce por debajo de aproximadamente 500 μl. La muestra se transfiere a un vial de carga automática adecuado y se
realiza el análisis mediante LC-MS/MS.
- 13 - EN 16618:2015
7 Medición
7.1 Determinación mediante LC-MS/MS

7.1.1 Condiciones de LC-MS/MS
Para el éxito del análisis es de la máxima importancia que el instrumento esté en perfecto estado y que todos los
parámetros experimentales estén optimizados.
Se utiliza la columna de HPLC (5.1.2) y la fase móvil (4.7) a una velocidad de flujo de 400 μl/min. La columna se
mantiene a temperatura ambiente (22 ºC ± 2 ºC). El volumen de inyección es de 10 μl. Pueden utilizarse otras columnas
cromatográficas siempre que se cumplan las condiciones adecuadas para cada sistema (véase 7.1.2).
Se utiliza ionización por electrospray, monitorización selectiva de reacción (SRM, selected reaction monitoring) y
resolución hasta las unidades. Se optimizan todos los parámetros a diferentes temperaturas, velocidades de flujo de los
gases, voltajes y posición de sonda para la detección de acrilamida a la velocidad de flujo de la fase móvil. Se optimiza
la energía de colisión de forma individual para cada una de las siguientes transiciones: m/z 72 > 55, 72 > 54, 72 > 44 y
75 > 58. Se utilizan unos parámetros óptimos de tiempo de permanencia y de retardo intercanal para alcanzar la máxima
sensibilidad, evitando todo tipo de comunicación cruzada y obteniendo cromatogramas con un mínimo de 15 puntos de
datos por canal a lo largo del pico. La acrilamida y el patrón interno se detectan con las transiciones m/z 72 > 55 y
75 > 58 para la cuantificación y m/z 72 > 55, 72 > 54 y 72 > 44 para la confirmación de la identidad de la acrilamida.
En función del tipo de instrumento de LC-MS/MS utilizado, también existen otras transiciones para la determinación
cualitativa de los picos.
NOTA Definición de monitorización selectiva de reacción: adquisición de datos de los iones específicos de uno o más productos específicos
correspondientes a los iones precursores m/z seleccionados, registrados mediante dos o más etapas de espectrometría de masas.
Las condiciones experimentales indicadas a continuación se aplicaron con éxito 3):
3) Se utilizó un Quattro Ultima PT de Micromass ® para las medidas. Este es un ejemplo de producto comercial adecuado disponible en el mercado.
Esta información se facilita por su utilidad para los usuarios de esta norma europea sin que ello constituya una recomendación por parte de CEN
hacia el producto mencionado. Pueden utilizarse productos equivalentes siempre que pueda demostrarse que proporcionan los mismos resultados.
EN 16618:2015 - 14 -
Tabla 3 – Condiciones de LC-MS/MS
Parámetros de HPLC
Columna de HPLC Columna HypercarbTM (50 mm  2,1 mm), con pre-columna HypercarbTM
(10 mm  2,1 mm)
Temperatura de columna Temperatura ambiente (22 ºC ± 2 ºC)
Volumen de inyección 10 μl
Fase móvil 0,1% de ácido acético en agua
Velocidad de flujo de la fase móvil 400 μl/min
Tiempo total de carrera 8 min
Parámetros de MS
Gas de desolvatación N2, 600 l/h
Temperatura de desolvatacion 400 ºC
Gas de nebulización N2, completamente abierto
Gas del cono N2, 200 l/h
Gas de colisión Argon, 2,3 × 10−3 mbar
Temperatura de la fuente de iones 125 ºC
Voltaje capilar 2 kV
Voltaje en el cono 20 V
Voltaje del hexapolo 10 V
Energías de colisión:
72 > 55 y 75 > 58 9 eV
72 > 44 20 eV
72 > 54 16 eV
Tiempo de permanencia 0,15 s
Retardo entre canales 0,03 s
Preferiblemente el extracto de cada muestra se inyecta dos veces. En el caso de las muestras se aplica un tiempo de
carrera de 8 min para dejar que eluyan los componentes de la matriz de la columna. En caso necesario, se lava la
columna con un 80% de acetonitrilo en agua, como se describe en el apartado 7.1.3 entre cada serie de muestras, o
después de la finalización de una serie.
Se recomienda el empleo de una válvula de desvío de flujo (opcional) para mejorar la estabilidad del instrumento y
aumentar los tiempos entre actuaciones de mantenimiento. Mediante la aplicación de la válvula de desvío, el efluente de
la columna cromatográfica sólo se dirige hacia el espectrómetro de masas entre el tiempo de retención esperado para la
acrilamida menos 0,5 min y el tiempo de retención esperado para la acrilamida más 1,5 min, y solamente se registran las
señales entre esos dos momentos.
7.1.2 Estado del sistema

La respuesta del sistema de LC-MS puede cambiar de día en día o a lo largo de períodos de tiempo prolongados.
Igualmente, la columna de HPLC puede estropearse después de haberse usado varias veces, o solamente una, en función
del número de inyecciones y del tipo de muestras analizadas. Por consiguiente, debería verificarse el sistema antes de
cada serie de análisis, de la forma siguiente.
- 15 - EN 16618:2015
La columna y el espectrómetro de masas se equilibran con fase móvil, por ejemplo durante 30 min. Se inyecta una de
las disoluciones patrón como mínimo tres veces para comprobar la respuesta del equipo de LC-MS así como el tiempo
de retención, la forma de los picos y la anchura de los picos de acrilamida y de los patrones internos. La respuesta
debería ser similar a la conseguida tras la optimización. De no ser así, se necesita limpiar la zona de conexión y/o volver
a optimizarse el espectrómetro de masas. El tiempo de retención de la acrilamida en la columna de Hypercarb TM (5.1.2)
debería ser superior a 1,7 min (a una velocidad de flujo de 0,4 ml/min) y la anchura del pico en la semi-altura debería
ser inferior a 0,2 min. El factor de retención (k) debería ser superior a 3,5. Incluso en las columnas nuevas se observa la
aparición de colas pero la distancia desde el máximo del pico hasta el borde de la cola del pico (medido a una altura del
10 %) no debería ser superior a dos veces la distancia desde el máximo del pico hasta el extremo inicial del pico. Para
una mejor explicación, el anexo A se muestra un cromatograma típico para productos derivados de la patata.
Las columnas que no cumplan estos requisitos podrían regenerarse mediante un lavado (véase 7.1.3). Si la regeneración
no funciona, debería reemplazarse la columna.
Se inyecta agua pura para controlar la posible contaminación del sistema. No deberían detectarse trazas de acrilamida.
7.1.3 Regeneración de la columna de HPLC

Si el funcionamiento de la columna de HPLC (5.1.2) es significativamente inferior a las expectativas o a las necesidades
(véase 7.1.2), se puede recuperar mediante la regeneración de la columna. La regeneración de las columnas debe
realizarse siguiendo las recomendaciones del proveedor de las columnas.
Se recomiendan los siguientes procedimientos para la columnas de carbono grafitizado.
Las columnas se pueden lavar con 80% de acetonitrilo en agua a una velocidad de flujo de 0,4 ml/min durante 30 min,
en línea con el equipo de LC-MS. Este lavado se puede hacer de forma rutinaria después de cada día de trabajo o
incluso entre cada serie de inyecciones. Se asegura que se deja un tiempo suficiente para el equilibrado de la fase móvil.
En los casos más severos, puede realizarse el siguiente procedimiento de lavado, preferiblemente con la columna fuera
de línea respecto al LC-MS. Se retira la columna de protección. Se cambia la dirección del flujo y se lava la columna a
temperatura ambiente a una velocidad de flujo de 0,2 ml/min, sucesivamente con:
a) dos h con una mezcla de 50% tetrahidrofurano (THF), 10% amoniaco y 40% agua. Téngase en cuenta que algunos
polímeros utilizados en los tubos capilares para HPLC no son resistentes al THF;
b) 30 min con metanol puro;
c) 30 min con la fase móvil, para su equilibrado.
7.2 Composición de las series (secuencia)

– Se analizan como mínimo seis patrones de calibración, comenzando por el de menor concentración, al principio de
cada serie. El factor de respuesta medio resultante se utiliza para cuantificar dicha serie de muestras. Pueden
incluirse patrones de calibración adicionales en la secuencia siempre que se considere necesario.
– Se analizan extractos de las muestras para análisis en orden aleatorio.
– Se analiza como mínimo una muestra en blanco del procedimiento con cada serie de muestras.
– Se analiza una muestra para la determinación de la tasa de recuperación dentro de cada serie de muestras
(véase 7.4).
– Al final de cada serie se debería analizar un patrón de concentración intermedia para comprobar posibles
desviaciones del instrumento. Unos valores de ± 5% de la concentración original se consideran aceptables.
EN 16618:2015 - 16 -
Puede inyectarse metanol puro siempre que se considere necesario para evaluar la contaminación por arrastre.
NOTA Una muestra en blanco del procedimiento es una muestra en blanco compuesta por todos los reactivos que se prevé utilizar para la
preparación de la porción para análisis y procesada en todos los aspectos igual que las muestras. Este tipo de blanco controla la pureza de los
reactivos pero también identifica otras posibles fuentes de contaminación como el material de vidrio o el propio instrumental analítico (en
esta norma europea, la muestra en blanco del procedimiento consiste sólo en 40 ml de agua a la que se añaden 400 μl de la disolución del
patrón interno). Se la somete al procedimiento completo de extracción y de lavado y sirve para determinar los niveles basales de acrilamida.
7.3 Identificación y cálculo de los resultados

La identidad de los picos se confirma por comparación de las relaciones entre las áreas de los picos de las transiciones
m/z 72 > 54 / 72 > 55 y 72 > 44 / 72 > 55 en los extractos de las muestras y en las disoluciones patrón. Las proporciones
no deberían diferir en más de ± 20% de las obtenidas con las disoluciones patrón.
La transición 72 > 27 también podría utilizarse para la identificación de los picos. Sin embargo, la presencia, visibilidad
y abundancia de esta transición depende del tipo de espectrómetro de masas utilizado.
7.4 Tasa de recuperación

Se determina la tasa de recuperación en cada serie de muestras utilizando materiales de referencia certificados u otros
métodos aprobados por las directrices internacionales como por ejemplo la contaminación artificial, (véanse las
referencia [4] y [5] de la bibliografía). Las tasas de recuperación se utilizan solamente a título informativo. No se
aplican factores de recuperación para la corrección de los resultados.
NOTA Se dispone de los siguientes materiales de referencia certificados (sin suponer un listado exhaustivo): ERM® BD273, acrilamida en pan
tostado, disponible en el Institute for Reference Materials and Measurements (IRMM); Geel, Bélgica (http://irmm.jrc.ec.europa.eu) y ERM®
BD272, acrilamida en pan crujiente, disponible en el Federal Institute for Materials Research and Testing (BAM); Berlín, Alemania
(www.bam.de).
8 Determinación de las concentraciones

Se aplica la calibración mediante normalización interna patrón interno para la determinación de la acrilamida. Este tipo
de calibración requiere la determinación de los factores de respuesta f definidos mediante la fórmula (1):
ASA  c[d 3] A
fi  (1)
A[d 3] A  cSA
donde
fi es el factor de respuesta de la acrilamida y de la acrilamida-2,3,3-D3 determinado mediante el análisis del

patrón de calibración i.
ASA es el área del pico de acrilamida no marcada, determinada como traza de masa m/z 72 > 55 en SRM en el
patrón de calibración;
A[d3]A es el área de acrilamida-2,3,3-D3 marcada, determinada como traza de masa 75 > 58 en SRM;
c[d3]A es la concentración de acrilamida-2,3,3-D3 en la disolución de calibración;
cSA es la concentración de acrilamida de la disolución de calibración.
- 17 - EN 16618:2015
i n
f 
i1 fi (2)
n
donde
es el promedio de los n factores de respuesta de la acrilamida y la acrilamida-2,3,3-D3 determinado a partir de

f
las n disoluciones de calibración.
Debe prestarse atención a la linealidad de la respuesta del instrumento, que podría ser diferente entre distintos
instrumentos. Si se supera el rango lineal del instrumento deben tomarse medidas adecuadas como la restricción de la
calibración a un menor rango de concentraciones y la correspondiente dilución de las muestras que presenten altos
niveles de acrilamida.
Para cada muestra se calcula el promedio de cantidad de acrilamida extraída a partir de la muestra (X A) en las N réplicas
de inyecciones realizadas con dicha muestra, utilizando la fórmula (3):
N AA  X [d 3] A

1
XA   (3)
N 1
A[d 3] A  f
donde
XA es la cantidad de acrilamida (en nanogramos) que se ha extraído de la muestra;
AA es el área del pico de acrilamida no marcada correspondiente a la traza de masa 72 > 55 en SRM de la
muestra;
A[d3]A es el área del pico de acrilamida-2,3,3-D3 correspondiente a la traza de masa 72 > 58 en SRM de la muestra;
X[d3]A es la cantidad absoluta (en nanogramos) del patrón interno (acrilamida-2,3,3-D3) añadido a la muestra;
f es el promedio de los n factores de respuesta de la acrilamida y la acrilamida-2,3,3-D3 determinados a partir

de los n patrones de calibración.
Se calcula la fracción en masa de acrilamida de la muestra, cS, en microgramos por kilogramo, utilizando la fórmula (4):
XA
cS  (4)
WS
donde
XA es la cantidad absoluta de acrilamida extraída de la muestra, en nanogramos;
WS es la masa de la muestra, en gramos;
Los resultados se deben expresar con tres cifras significativas. Las unidades en las que se expresan son μg/kg.
EN 16618:2015 - 18 -
9 Precisión
9.1 Generalidades
Los detalles del análisis interlaboratorios referidos a la precisión del método se resumen en el anexo B. Los valores
obtenidos a partir del análisis interlaboratorios pueden no resultar aplicables a rangos de concentraciones de analitos o
matrices diferentes de las indicadas en el anexo B.
9.2 Repetibilidad
La diferencia absoluta entre los resultados de dos análisis individuales obtenidos sobre un material de análisis idéntico,
realizados dentro del intervalo de tiempo más corto posible por un solo analista y utilizando los mismos aparatos, no
será superior al límite de repetibilidad r en más de un 5% de los casos.
Los valores para galletas de mantequilla son:
x = 14,3 μg/kg r = 3,4 μg/kg

x = 95,7 μg/kg r = 20,9 μg/kg
Los valores para pan tostado son:
x = 37,9 μg/kg r = 5,9 μg/kg
Los valores para pan crujiente son:
x = 980 μg/kg r = 86 μg/kg
Los valores para galletas saladas son:
x = 249 μg/kg r = 25,5 μg/kg
Los valores para patatas fritas son:
x = 324 μg/kg r = 54,6 μg/kg

x = 628 μg/kg r = 157 μg/kg
x = 2 512 μg/kg r = 418 μg/kg
x = 4 051 μg/kg r = 485 μg/kg
x = 9 083 μg/kg r = 1 260 μg/kg
Los valores para puré de patata (enriquecido) son:
x = 500 μg/kg r = 76,0 μg/kg
- 19 - EN 16618:2015
Los valores para café tostado son:
x = 160 μg/kg r = 15,4 μg/kg

x = 263 μg/kg r = 13,7 μg/kg
x = 585 μg/kg r = 15,7 μg/kg
9.3 Reproducibilidad
La diferencia absoluta entre los resultados de dos análisis individuales obtenidos sobre un material de análisis idéntico
en dos laboratorios diferentes no será superior al límite de reproducibilidad R en más de un 5% de los casos.
Los valores para galletas de mantequilla son:
x = 14,3 μg/kg R = 5,6 μg/kg

x = 95,7 μg/kg R = 31,6 μg/kg
Los valores para pan tostado son:
x = 37,9 μg/kg R = 9,0 μg/kg
Los valores para pan crujiente son:
x = 980 μg/kg R = 148 μg/kg
Los valores para galletas saladas son:
x = 249 μg/kg R = 72,6 μg/kg
Los valores para patatas fritas son:
x = 324 μg/kg R = 115 μg/kg

x = 628 μg/kg R = 232 μg/kg
x = 2 512 μg/kg R = 826 μg/kg
x = 4 051 μg/kg R = 1 010 μg/kg
x = 9 083 μg/kg R = 2 312 μg/kg
Los valores para puré de patata (enriquecido) son:
x = 500 μg/kg R = 123 μg/kg
EN 16618:2015 - 20 -
Los valores para café tostado son:
x = 160 μg/kg R = 51,5 μg/kg

x = 263 μg/kg R = 74,5 μg/kg
x = 585 μg/kg R = 157,6 μg/kg
La relación entre R y x se puede aproximar de forma suficiente mediante la fórmula:
R(μg/kg) = 0,258  x (μg/kg)
donde el coeficiente de determinación (R2 = 0,99) representa que la desviación estándar de la reproducibilidad es
constante a lo largo de todo el rango de trabajo.
10 Informe del análisis

El informe del análisis debe incluir los siguientes datos:
a) toda la información necesaria para la identificación de la muestra (tipo de muestra, origen y designación de la
muestra);
b) una referencia a esta norma europea;
c) la fecha y el tipo de procedimiento de toma de muestras utilizado (si se conoce);
d) la fecha de recepción;
e) la fecha del análisis;
f) los resultados obtenidos en el análisis y las unidades en los que se han expresado;
g) todas las operaciones no descritas en el método o consideradas opcionales que pudieran haber influido sobre los
resultados.
- 21 - EN 16618:2015
Anexo A (Informativo)
Cromatogramas típicos
Leyenda
a) Acrilamida (transición 75 > 55; tiempo de retención = 1,77 min)
t Tiempo, en min
Y Unidades de abundancia
1 Acrilamida
b) Acrilamida-2,3,3-D3 (transición 75 > 58; tiempo de retención = 1,75 min)
t Tiempo, en min
Y Unidades de abundancia
2 Acrilamida-2,3,3-D3
Figura A.1 – Cromatograma típico de una muestra de patatas fritas que contiene acrilamida
Condiciones experimentales:
Volumen de inyección: 10 μl
Columna: HypercarbTM, 5 μm, de unas dimensiones de 50 mm  2,1 mm, con columna de
protección de 5 μm, de unas dimensiones de 10 mm  2 mm (Hypersil-Keystone® de
Thermo)
Velocidad de flujo: 400 μl/min
Fase móvil: Mezcla de 1 volumen de ácido acético y 1 000 volúmenes de agua
EN 16618:2015 - 22 -
Anexo B (Informativo)
Datos de precisión
Se obtuvieron los siguientes datos en un análisis interlaboratorios realizado conforme a la Norma ISO 5725-2 [8] y las
Directrices de AOAC [9] sobre el desarrollo de procedimientos de los estudios en colaboración para la validación de las
características de un método de análisis.
Los valores asignados se calcularon a partir de los resultados de los participantes tras la retirada de los discrepantes, con
la excepción del puré de patata en polvo contaminado artificialmente y el material de referencia candidato en cuyos
casos se utilizaron respectivamente el valor de la contaminación artificial y el valor preliminar certificado.
Tabla B.1 – Datos de precisión para la acrilamida en galletas de mantequilla, pan tostado y galletas saladas
Galletas de Galletas de Galletas

Muestra Pan tostado
mantequilla mantequilla saladas
Origen RS a RS a RS a RS a
Año del análisis interlaboratorios 2007 2007 2007 2007
Número de laboratorios 16 16 16 16
Número de laboratorios en los que se considera falta de
4 1 1 1
cumplimiento
Número de laboratorios mantenidos tras eliminar a los
10 12 13 12
discrepantes
Número de discrepantes (laboratorios) 2 3 2 3
Número de resultados aceptados 10 12 13 12
Valor medio, x , μg/kg 14,3 37,9 95,7 249
Desviación estándar de la repetibilidad sr, μg/kg 1,2 2,1 7,5 9,1
Desviación estándar relativa de la repetibilidad, RSDr, % 8,4 5,5 7,8 3,7
Límite de la repetibilidad r [r = 2,8  sr], μg/kg 3,4 5,9 20,9 25,5
Desviación estándar de la reproducibilidad sR, μg/kg 2,0 3,2 11,3 25,9
Desviación estándar relativa de la reproducibilidad,
14,1 8,5 11,8 10,4
RSDR, %
Límite de la reproducibilidad R [R = 2,8  sR], μg/kg 5,6 9,0 31,6 72,6
Tasa de recuperación, % -b -b -b -b
Valor de HorRat conforme a la referencia [6] de la
0,5 0,3 0,5 0,5
bibliografía
0,6 0,4 0,6 0,5
bibliografía
a
RS = procedente de un minorista.
b
No determinado dado que la tasa de recuperación viene corregida por la acrilamida marcada isotópicamente.
- 23 - EN 16618:2015
Tabla B.2 – Datos de precisión para la acrilamida en patatas fritas crujientes,

puré de patata en polvo y pan crujiente
Patatas
Patatas fritas Puré de patata en Pan
Muestra fritas
crujientes polvo enriquecido crujiente
crujientes
Origen ERM®-
SP a RS a RS a
BD272
Año del análisis interlaboratorios 2007 2007 2007 2007
Número de laboratorios 16 16 16 16
Número de laboratorios en los que se considera falta
1 0 0 0
de cumplimiento
Número de laboratorios mantenidos tras eliminar a
14 16 14 13
los discrepantes
Número de discrepantes (laboratorios) 1 0 2 3
Número de resultados aceptados 14 16 14 13
Valor medio, x , μg/kg 324 500 628 980
Desviación estándar de la repetibilidad sr, μg/kg 19,5 27,1 55,9 30,7
Desviación estándar relativa de la repetibilidad,
6,0 5,4 8,9 3,1
RSDr, %
Límite de la repetibilidad r [r = 2,8  sr], μg/kg 54,6 76,0 157 86,0
Desviación estándar de la reproducibilidad sR, μg/kg 41,0 43,9 82,7 52,9
Desviación estándar relativa de la reproducibilidad,
12,7 8,8 13,2 5,4
RSDR, %
Límite de la reproducibilidad R [R = 2,8  sR], μg/kg 115 123 232 148
b b b
Tasa de recuperación, % - - - -b
0,7 0,5 0,8 0,3
bibliografía
0,7 0,5 0,8 0,3
bibliografía
a
SP = preparado específicamente para este estudio, RS = procedente de un minorista.
b
EN 16618:2015 - 24 -
Tabla B.3 – Datos de precisión para la acrilamida en patatas fritas
Patatas fritas Patatas fritas Patatas fritas

Muestra
crujientes crujientes crujientes
Origen SP a RS a SP a
Año del análisis interlaboratorios 2007 2007 2007
Número de laboratorios 16 16 16
Número de laboratorios en los que se considera falta de 1 1 0
cumplimiento
Número de laboratorios mantenidos tras eliminar a los discrepantes 15 15 14
Número de discrepantes (laboratorios) 0 0 2
Número de resultados aceptados 15 15 14
Valor medio, x , μg/kg 2 512 4 051 9 083
Desviación estándar de la repetibilidad sr, μg/kg 149 173 450
Desviación estándar relativa de la repetibilidad, RSDr, % 5,9 4,3 5,0
Límite de la repetibilidad r [r = 2,8  sr], μg/kg 418 485 1 260
Desviación estándar de la reproducibilidad sR, μg/kg 295 361 826
Desviación estándar relativa de la reproducibilidad, RSDR, % 11,7 8,9 9,1
Límite de la reproducibilidad R [R = 2,8  sR], μg/kg 826 1 010 2 312
Tasa de recuperación, % -b -b -b
Valor de HorRat conforme a la referencia [6] de la bibliografía 0,8 0,7 0,8
a
b
- 25 - EN 16618:2015
Tabla B.4 – Datos de precisión para la acrilamida en café tostado
Muestra Café tostado Café tostado Café tostado

a a
Origen RS SP SP a
Año del análisis interlaboratorios 2007 2007 2007
Número de laboratorios 9 9 8
Número de laboratorios en los que se considera falta de cumplimiento 1 1 1
Número de laboratorios mantenidos tras eliminar a los discrepantes 7 7 7
Número de discrepantes (laboratorios) 1 1 0
Número de resultados aceptados 7 7 7
Valor medio, x , μg/kg 160 263 585
Desviación estándar de la repetibilidad sr, μg/kg 5,5 4,9 5,6
Desviación estándar relativa de la repetibilidad, RSDr, % 3,5 1,9 1,0
Límite de la repetibilidad r [r = 2,8  sr], μg/kg 15,4 13,7 15,7
Desviación estándar de la reproducibilidad sR, μg/kg 18,4 26,6 56,3
Desviación estándar relativa de la reproducibilidad, RSDR, % 11,5 10,1 9,6
Límite de la reproducibilidad R [R = 2,8  sR], μg/kg 51,5 74,5 157,6
Tasa de recuperación, % -b -b -b
a
b
EN 16618:2015 - 26 -
Bibliografía
[1] ROSÉN J., NYMAN A., HELLENÄS K.E. Retention studies of acrylamide for the design of a robust liquid
chromatograph-tandem mass spectrometry method for food analysis. J. Chromatogr. A. 2007, 1172 pp. 19–24.
[2] WENZL T., SZILAGYI S., ROSÉN J., KARASEK L. Validation by collaborative trial of an isotope dilution liquid
chromatographic tandem mass spectrometric method to determine the content of acrylamide in roasted coffee.
Food Addit. Contam. 2009, 26 pp. 1146–1152.
[3] PETERSSON E.V., ROSÉN J., TURNER CH., DANIELSSON R., HELLENÄS K.E. Critical factors and pitfalls affecting
the extraction of acrylamide from food: An optimisation study. Anal. Chim. Acta. 2006, 557 pp. 287–295.
[4] Eurachem Guide, (1998). The Fitness for Purpose of Analytical Methods – A Laboratory Guide to Method
Validation and Related Topics.
[5] IUPAC/ISO/AOAC International/EURACHEM, (1998), Harmonised Guidelines for the Use of Recovery
Information in Analytical Measurement.
[6] HORWITZ W., ALBERT R. The Horwitz Ratio (HorRat): A Useful Index of Method Performance with Respect to
Precision. J. AOAC Int. 2006, 89 pp. 1095–1109.
[7] THOMPSON M. Recent Trends in Inter-Laboratory Precision at ppb and sub-ppb Concentrations in Relation to
Fitness for Purpose Criteria in Proficiency Testing. Analyst (Lond.), 125 pp. 385–386.
[8] ISO 5725-2:1994, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results. Part 2: Basic method
for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method.
[9] AOAC International Guidelines for Collaborative Study Procedure to Validate Characteristics of a Method of
Analysis 1995, J. AOAC Int., vol. 78, 143A-160A; also reprinted in Official Methods of Analysis of AOAC
International 2000, 17th Ed. and 2005, 18th Ed. Original publication: H ORWITZ W. Protocol for the Design,
Conduct, and Interpretation of Method Performance Studies. Pure Appl. Chem. 1995, 67 (2) pp. 331–343.
Génova, 6 info@aenor.es Tel.: 902 102 201
28004 MADRID-España www.aenor.es Fax: 913 104 032

UNE-EN 16618-2015. Análisis de Los Productos Alimenticios. Determinación de Acrilamida en Alimentos.

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

UNE-EN 16618-2015. Análisis de Los Productos Alimenticios. Determinación de Acrilamida en Alimentos.

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

norma UNE-EN 16618

TÍTULO Análisis de los productos alimenticios

Determinación de acrilamida en alimentos mediante cromato-

CORRESPONDENCIA Esta norma es la versión oficial, en español, de la Norma Europea EN 16618:2015.

 AENOR 2015 Génova, 6 info@aenor.es Tel.: 902 102 201

ICS 67.050; 67.060; 67.080.20; 67.140.20

Análisis de los productos alimenticios

Esta norma europea ha sido aprobada por CEN el 2015-02-07.

 2015 CEN. Derechos de reproducción reservados a los Miembros de CEN.

1 Objeto y campo de aplicación ................................................................................................ 6

2 Normas para consulta ............................................................................................................ 6

6 Preparación de la muestra ................................................................................................... 10

8 Determinación de las concentraciones ................................................................................ 16

10 Informe del análisis .............................................................................................................. 20

Anexo A (Informativo) Cromatogramas típicos ................................................................................ 21

Anexo B (Informativo) Datos de precisión ......................................................................................... 22

1 Objeto y campo de aplicación

2 Normas para consulta

La estructura química es:

4.2 Acrilamida marcada con deuterio – acrilamida-2,3,3-D3 (CAS 122775-19-3).

La estructura química es:

Figura 2 – Acrilamida marcada con deuterio

4.3 Metanol (CAS 67-56-1).

4.4 Ácido acético glacial (CAS 64-19-7).

4.5 n-Hexano (CAS 110-54-3).

Alternativamente, podría utilizarse ciclohexano (CAS 110-82-7).

4.6 Eluyente para la columna 2 de SPE (5.2.3)

4.7 Fase móvil para HPLC

4.8 Disoluciones concentradas de acrilamida y acrilamida-2,3,3-D3, concentración en masa  = 1 000 μg/ml.

4.9 Disolución patrón interno nº 1,  = 10 μg/ml.

4.10 Disolución patrón interno nº 2,  = 1 000 ng/ml.

4.11 Disolución patrón de acrilamida nº 1,  = 100 μg/ml.

4.12 Disolución patrón de acrilamida nº 2,  = 10 μg/ml.

4.13 Disolución patrón de acrilamida nº 3,  = 100 ng/ml.

4.14 Disoluciones de calibración para LC-MS

Tabla 1 – Preparación de las disoluciones de calibración para LC-MS

Disolución de Matraz aforado Disolución patrón interno Disolución patrón de

Tabla 2 – Relación entre el contenido de acrilamida de las disoluciones de calibración

Disolución de calibración Productos de panadería y a base de patata Café tostado

5.1 Sistema de LC-MS/MS

5.1.1 Aparato de HPLC, compuesto de:

5.1.1.1 Compartimento de columna termostatizado.

5.1.1.2 Sistema de inyección, que pueda inyectar 10 μl de muestra.

5.1.2 Columna de HPLC

5.1.3 Espectrómetro de masas

5.1.4 Sistema de adquisición de datos y de análisis

5.1.5 Válvula de desvío de flujo (opcional)

5.2 Sistema de extracción en fase sólida

5.2.2 Columna 1 de SPE

5.2.3 Columna 2 de SPE

5.3 Balanza analítica, de una exactitud de 0,01 mg.

5.4 Granatario, de una exactitud de 0,01 g.

5.5 Micropipetas de precisión calibradas, de 200 μl a 1 000 μl y de 1 000 μl a 5 000 μl de capacidad.

5.6 Tubos de centrífuga, de 50 ml de capacidad, de polipropileno, desechables.

5.8 Mezclador de vórtex.

La temperatura de evaporación no debe ser mayor de 40 ºC.

6.2.2 Procedimiento de extracción para muestras de café

NOTA El ciclohexano es una alternativa adecuada para el n-hexano.

6.3.2 Lavado para muestras de café

7.1 Determinación mediante LC-MS/MS

Las condiciones experimentales indicadas a continuación se aplicaron con éxito 3):

Tabla 3 – Condiciones de LC-MS/MS

7.1.2 Estado del sistema