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EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL ADN DE S. AUREUS CON KIT

OBJETIVO
Extraer y purificar el ADN de S. aureus con el uso de un kit comercial que se basa
en el uso de columnas.

FUNDAMENTO
La obtención de ADN se basa en dos procedimientos:
● La extracción del ADN, que consiste en la liberación del ADN de las
estructuras lipídicas y proteicas que lo contienen. El resultado es un lisado
celular.
● La purificación del ADN, que consiste en eliminar los restos e impurezas del
lisado para obtener ADN puro. Si no se realizara, los componentes del lisado
interferiría en las técnicas posteriores. La purificación se suele hacer en
columnas.
Estos dos procesos pueden estar comercializados en forma de kit, para aplicarlos
de manera directa.

PROTOCOLO
I. Activación de la unión del ADN a la columna
1. Añadimos 30 microlitros de tampón T a la columna e incubamos a temperatura
ambiente durante al menos 10 minutos.
II. Pretratamiento
1. En un Eppendorf mezclamos 100 microlitros de medio de cultivo bacteriano con
tampón Lyse BG. Resuspendemos una colonia bacteriana en 300 microlitros de
tampón Lyse BG. Centrifugamos y eliminamos el sobrenadante. Suspendemos el
sedimento en 300 microlitros de tampón Lyse BG.
2. Añadimos a la suspensión celular 50 microlitros de tampón BL y 2 microlitros de
ARNasa A y mezclamos por inversión o en un vórtex durante 3 segundos. *
3. Incubamos a 37 grados durante 15 minutos.
4. Añadimos 20 microlitros de Proteinasa K para resuspender el botón celular.
Mezclamos por inversión o en vórtex.
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5. Incubamos la muestra a 56 grados durante 30 min.

6. Añadimos 350 microlitros de tampón Sol. T. Mezclamos por inversión o agitación.
7. Incubamos a 56 grados por 5 min.
8. En un vortex agitamos la muestra por 15s.
III. Extracción y purificación del ADN
1. Centrifugamos durante 1 minuto a 12000 g.
2. Transferir el lisado completo a la columna, colocada sobre un tubo colector.
3. Centrifugar la columna durante 1 minuto a 11000 g.**
4. Quitar la columna, descartar el eluido y recolocarla en el tubo colector.
5. Añadir 500 microlitros de tampón Wash TX 1 y centrifugar durante 1 min a 11000
g.
6. Retirar la columna, descartar el eluido y recolocarla en el tubo.
7. Añadir 500 microlitros de tampón Wash TX 2 y centrifugar durante 1 min a 11000
g para eliminar restos del tampón Wash TX 2.
8. Retirar la columna y colocarla en un nuevo tubo colector. Añadir 50-150
microlitros de tampón de Elución para eluir el ADN adherido a la columna.***
9. Incubar la columna junto al tubo durante 2 minutos a temperatura ambiente.
10. Centrifugar durante 1 min a 11000 g.
11. Retirar la columna y cerrar el tubo colector. En su interior se halla el ADN
resuspendido y listo para las técnicas analíticas. Conservarlo a 2 u 8 grados ó a -20
grados Celsius.

OBSERVACIONES
*Para una eficiente lisis de algunas especies bacterianas, puede ser necesario otras
enzimas distintas a la lisozima. Usar la enzima apropiada junto al tampón BL.
**Puedes continuar centrifugando si no todo el lisado ha atravesado la columna.
***La adición del tampón de Elución directamente en el centro de la resina mejora
el procedimiento. Es importante no tocar con la micropipeta las paredes de la
columna para evitar contaminaciones.
***Para mejorar la eficiencia de la elución del ADN genómico, el tampón de Elución
se puede calentar a 80 grados Celsius.