Micología

Técnicas de diagnóstico molecular de las

enfermedades causadas por hongos

Actividad nal de Módulo 8

Elaborada por Marcela Matasari
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 Las técnicas de diagnóstico molecular tienen en com n la detecci n de secuencias diana
de nucle tidos espec cas de hongos, y que no est n presentes en las c lulas animales.
Existe una gran cantidad de posibles secuencias diana dentro del genoma, y una gran
variedad de t cnicas que permiten detectarlas.
Las secuencias diana en micosis incluyen tanto genes nucleares como mitocondriales, de
una o m ltiples copias. En general, la diana multicopia m s utilizada son los genes
ribos micos (18S, 5.8S y 28S). Estos genes contienen secuencias conservadas co-
munes a todos los hongos y tambi n, dominios variables y regiones espaciadoras internas
(ITS), altamente variables. Las secuencias conservadas se pueden utilizar para detectar
la infecci n f ngica, mientras que las variables se pueden emplear para la identi caci n
de las especies implicadas.
En cuanto a las t cnicas utilizadas, existe tambi n una gran variedad. A continuaci n
describimos las m s utilizadas:

• Las t cnicas de hibridaci n emplean sondas de ADN para detectar la presencia de un

organismo determinado. La sonda es una cadena simple de ADN sintetizada para que
sea complementaria a la secuencia que se quiere detectar y que va marcada para
poder identi carla despu s de la hibridaci n.

• La PCR, o reacci n en cadena de la polimerasa se ha impuesto a otras t cnicas de

diagn stico basadas en los cidos nucleicos, debido a su simplicidad, sensibilidad,
rapidez y especi cidad. La reacci n consiste en una ampli caci n de un fragmento de
genoma, mediante una pareja de oligonucle tidos espec cos de la secuencia diana.

• PCR anidada. Se incorpora una segunda pareja de cebadores para una segunda
ampli caci n en la que se utiliza como diana el producto ampli cado en la primera
PCR, lo cual aumenta mucho su sensibilidad.

• PCR m ltiple. Varias parejas de cebadores se utilizan en una misma PCR. Este
m todo ha sido ensayado en identi caci n de hongos lamentosos y diferentes
especies de Candida.

• RAPD-PCR: Produce una ampli caci n al azar de fragmentos de ADN utilizando

oligonucle tidos inespec cos.

• PCR-RFLP: (Restriction Fragment Length Polymorphism) digesti n con enzimas de

restricci n del producto de una ampli caci n por PCR.

• Real-time PCR o PCR a tiempo real: Con esta t cnica, la recolecci n y el an lisis de
datos se producen al mismo tiempo que la reacci n de ampli caci n de diana, de
manera que es posible recoger y analizar los datos al mismo tiempo.

• EIA: esta t cnica, utiliza la PCR para obtener una gran cantidad de fragmento diana y,
posteriormente, lo hibrida con una sonda complementaria y la detecta mediante
inmunoan lisis que proporciona una lectura colorim trica o uorescente automatizada.

• PCR y secuenciaci n del ADN. Este m todo aporta la m xima informaci n, puesto
que se obtiene la secuencia de nucle tidos detallada, de manera que puede
compararse con la secuencia de la cepa de referencia que se encuentra disponible en
los bancos de datos como el Gen Bank (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/ gen- bank/
index.html) o el EMBL (http: //www.ebi. ac.uk/).
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 Por ltimo se est n probando nuevas tecnolog as como los Microarrays o la Tecnolog a
Luminex xMAP que permiten la obtenci n de varias determinaciones diferentes al mismo
tiempo, y garantizan una mejora para el uso en diagn stico rutinario.

En general, todas estas t cnicas presentan una serie de ventajas frente a los m todos
tradicionales: una alta sensibilidad y especi cidad para la detecci n e identi caci n de
especies, una mayor objetividad, mayor sencillez t cnica que no exige experiencia en el
manejo de hongos, pero sobre todo proporcionan resultados en muy poco espacio de
tiempo.

A continuación vamos a explicar mas en detalles algunos de los métodos

mencionados.

La PCR múltiple: ventajas y di cultades

La PCR es un método engañosamente simple, pero muy versátil, que tiene aplicación en
todas las áreas donde se haga uso de la biología molecular. Expresado de una manera
simple, todo lo que la PCR consigue es fabricar múltiples copias de una secuencia diana
de ADN mediante un proceso de ampli cación que llega a permitir la obtención de
microgramos de ADN a partir de cada molécula inicial. Cualquier segmento de ADN o de
ARN puede ser ampli cado siempre que se conozcan las secuencias anqueantes de la
región diana o, lo que es lo mismo, podemos ampli car cualquier porción de ácido
nucleico, conocido o no, siempre que quede comprendido entre dos secuencias conocidas
con las que podrán hibridar oligonucleótidos complementarios que actuarán como
cebadores para que la polimerasa pueda copiar las hebras molde. Por tanto, para que la
reacción tenga lugar, los componentes básicos e indispensables de la misma son: ADN
molde que se desea ampli car, ADN polimerasa, cebadores de secuencia especí ca,
nucleótidos para la síntesis de nuevo ADN y tampón de reacción que incluye las distintas
sales requeridas por la enzima.
La PCR es una reacción que ocurre en un único tubo tras mezclar en él los componentes
necesarios e incubarlos en un termociclador, aparato que permite variar la temperatura de
incubación a lo largo del tiempo de forma programada. Los protocolos básicos de PCR
constan de los siguientes pasos fundamentales:
1. Desnaturalización térmica del ADN que se va a usar como molde.
2. A una temperatura menor que la de desnaturalización, anillamiento de cebadores
sintéticos cuya secuencia les permite hibridar uno a cada lado de la secuencia diana.
3. Extensión por parte de la ADN polimerasa de los oligonucleótidos anillados que actúan
como cebadores.
4. Este proceso de tres pasos es entonces repetido un número determinado de veces
(25-35), duplicándose cada vez el número de moléculas de producto. Esta ampli cación
exponencial tiene como resultado un gran número de copias de la secuencia de ADN
anqueada por el par de oligonucleótidos. De esta manera, la reacción permite obtener
una gran sensibilidad al detectar muy bajas cantidades de ADN molde y especi cidad al
detectar únicamente la secuencia de ácido nucleico para la que han sido diseñados los
cebadores.
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 Sin embargo, en este proceso teórico que hemos descrito pueden in uir numerosos
factores que hagan que la reacción no sea realmente especí ca o que su e ciencia no
sea la adecuada, de manera que la ampli cación no ocurra en la progresión esperada y,
por tanto, no sea sensible. Entre los muchos factores que pueden in uir en el resultado
nal de la PCR, son destacables el diseño apropiado de los cebadores, la calidad y
concentración del ADN, la concentración de magnesio, el tipo y la cantidad de ADN
polimerasa y el programa de ampli cación.
En el caso de una PCR múltiple, lo que se persigue es ampli car simultáneamente en un
único tubo distintas secuencias especí cas, lo cual necesariamente implica que los
reactivos mezclados y el programa utilizado sean su cientes y adecuados para permitir la
detección de cada diana y no inhibir la de las demás. Con este n, algunos parámetros,
como la concentración de magnesio y de cebadores, y el tipo y la cantidad de ADN
polimerasa, pueden ajustarse experimentalmente. Para otros, en cambio, debe realizarse
un diseño exhaustivo previo. En el caso de los cebadores y el programa de temperaturas
utilizado, es necesario tener en cuenta varias premisas: a) escoger o diseñar
oligonucleótidos que no interaccionen entre sí, es decir, que no formen oligómeros; b) que
tengan temperaturas de anillamiento similares; c) que cada pareja ampli que una única
secuencia diana, y d) que generen amplicones de tamaño su cientemente diferente como
para poder ser separados y diferenciados tras la ampli cación. En cuanto a la calidad y
cantidad de ADN molde, por supuesto debemos intentar partir de la concentración menor
posible y con ausencia de sustancias inhibidoras que puedan interferir en la reacción.
Para ello, los protocolos de puri cación variarán en función del tipo de muestra clínica de
partida.

Secuenciación de ácidos nucleicos fúngicos

El progreso creciente en la tecnología y la disponibilidad de las secuencias del genoma

completo de muchos hongos facilitó la aplicación de métodos basados en las secuencias
del ADN en la investigación y el diagnóstico de diferentes microorganismos. La
identi cación se logra al comparar la secuencia del producto de ampli cación que se
obtiene a partir de muestras o cultivos con una base de datos de secuencias de especies
conocidas. Es un método especí co y rápido, por lo que se considera el candidato a
convertirse en el prueba de referencia para la identi cación de estos agentes.
La diana que se emplea con mayor frecuencia es la que codi ca el complejo de los ARN
ribosomales (genes 5,8S, 18S y 28S). Estos genes contienen secuencias conservadas
comunes a todos los hongos, dominios variables y regiones espaciadoras internas,
altamente variables. En dependencia del objetivo del método se pueden emplear para
detectar secuencias muy conservadas e inespecí cas o variables y muy especí cas.
a) Identi cación de levaduras
La diferenciación por el método molecular es indiscutible para especies idénticas desde el
punto de vista fenotípico. En los últimos años se reconocieron como patógenos humanos
a C. dubliniensis, C. orthopsilosis, C. metapsilosis, C. nivariensis, C. bracariensis y C.
auris; estas son fenotípicamente indistinguibles de C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata
y C. haemulonii, respectivamente. Así mismo, el género Trichosporon sufrió varias
reclasi caciones; en particular T. beigelii, se desplegó en al menos 18 especies. Estos y
otros hallazgos proporcionaron el desarrollo de la identi cación molecular mediante
secuenciación. Las dianas que se emplean con más frecuencia para identi car las
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 levaduras son la región D1/D2 del 28S ADNr y los espacios de transcripción internos 1 y 2
del ADNr, conocidos como ITS, del inglés internal transcribed spacer.
b) Identi cación de hongos lamentosos
Para los hongos lamentosos, la secuenciación de los ITS resuelve menos especies que
en el caso de las levaduras. Por ejemplo, para Aspergillus y Scedosporium se debe
emplear el gen de la beta-tubulina y para Fusarium el que codi ca para el factor de
elongación alfa.
Dentro de la secuenciación podemos encontrar diferentes métodos, entre los cuales
encontramos:
1. Secuenciación Sanger.
2. Secuencia paralela, masiva o de nueva generación (NGS).
3. Pirosecuencia.
4. Hibridación de sondas de ADN.
5. Polimor smo ampli cado aleatorio ADN (RAPD).
6. Polimor smo de Longitud de Fragmento de Restricción (RFLP).

Espectrometría de masas en el diagnóstico fúngico

En la última década la espectrometría de masas MALDI-TOF (del inglés, Matrix-Assisted
Laser Desorption/ Ionization-Time-of-Flight) se introdujo en el campo de la microbiología
para la identi cación de diferentes agentes. Esta técnica permite la obtención de una
huella peptídica como resultado de la ionización suave de las proteínas ribosomales, lo
cual crea un espectro de masas que es especie especí co y permite crear bases de datos
con los patrones que presenta cada una.
Durante el proceso, el espectro del agente a identi car se compara automáticamente con
la base de datos de referencia y el resultado se emite a través de un puntaje de similitud
entre ambos. La identi cación puede hacerse directamente a partir de los aislados o de
sangre y orina. La técnica es de fácil implementación, con able, rápida y precisa para la
identi cación de especies fúngicas de importancia médica.
La comparación entre los métodos convencionales y el MALDI-TOF demuestra que este
permite identi car de forma correcta 27,5 % más aislados lamentosos hasta 50 veces
más rápido; esta ventaja se amplía aun más al emplearse directamente muestras de
hemocultivos, lo que permite seleccionar el tratamiento antifúngico apropiado de forma
oportuna. A pesar del importe relativamente elevado del equipo, el precio de la
identi cación por muestra está por debajo de 1,35 € lo que lo hace costo efectivo.

En Tabla 1 presentamos un breve resumen de las ventajas y las limitaciones que tienen
diferentes técnicas de diagnóstico molecular de las enfermedades causadas por hongos.
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 Tabla 1. Ventajas y limitaciones de diferentes técnicas de diagnóstico molecular-1
METODOLOGIA VENTAJAS LIMITACIONES

PCR Ampli ca cantidades diana bajas Requiere plantilla puri cada

Alta sensibilidad y especi cidad
Puede ser cuantitativo
Rápido (2-3 h)
Multiplexable (múltiples objetivos)
Diversas plataformas y metodologías
Instrumentación y ensayo económicos
Pruebas directamente a partir de muestras
Tamaño reducido del instrumento, portátil
Complejidad moderada
Se requiere una selección de objetivos
a priori
La prevención de la contaminación es
crucial
Experiencia técnica moderada

Secuenciacíon Máxima especi cidad Altos costos de capital (para

Ensayo económico instrumentos internos)
Capacidad panfúngica Alta complejidad
Resultado en ~8 h Requiere paso de ampli cación por
Puede detectar nuevas especies. PCR
Bases de datos públicas masivas La calidad de la plantilla es crucial
Numerosos proveedores de servicios para el ensayo
comerciales Puede ser necesaria la interpretación
de datos
Alta experiencia técnica
Ensayo Singleplex, pero muestra
múltiple

Secuencia del Máxima especi cidad Alto costo de capital

genoma completo Identidad, epidemiología,
farmacorresistencia
Prueba directa de muestras
Capacidad de multi o megaplex
Tolera muestras mezcladas o
contaminadas
Capacidad panfúngica
Equipo de apoyo adicional
Máxima complejidad
Máxima experiencia técnica
Carga analítica sustancial
Amplia preparación de muestras
Costo costoso por ensayo
Los datos masivos requieren
infraestructura
Tiempo de respuesta lento (días)

Hibridación Capacidad de multiplex a megaplex Puede ser de alta complejidad

Diversas plataformas Puede ser de varios pasos (PCR+
Capacidad de analitos mixtos hibridación +detección)
(identi cación y genes de resistencia a Costo de capital variable
fármacos, identi cación de múltiples Experiencia técnica moderada
microbios)
Numerosos sistemas aprobados por la
FDA
El resultado es +/–
Resultado <8 horas

Espectrometría de Resultados en minutos Altos costos de capital

Masas Preparación de muestras de fácil a Alta complejidad
moderada Requiere solo cultivo puro Singleplex
El resultado es +/– Bases de datos limitadas
La capacidad podría ser panfúngica (actualmente)
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