IDENTIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS POR CROMATOGRAFÍA

Emilie Valentina Borja Pinto (1007151547), Juan Pablo Zabala Gordillo (1105362241), Julian Mauricio Tafurt Salazar
(1105363720)

emilie.borja00@usc.edu.co , juan.zabala01@usc.edu.co, julian.tafurt00@usc.edu.co

Facultad de Ciencias Básicas, Programa de Química Farmacéutica, Universidad Santiago de Cali

Fecha de última sección: 30 de agosto de 2023

Fecha de entrega: 13 de septiembre de 2023

RESUMEN
Palabras claves:

ABSTRACT

1. PROCEDIMIENTO amarillo a anaranjado como positivo,por lo cual,

algunos dieron resultado positivo.

Inicialmente, la separación de los aminoácidos, no

se realizó por medio de cromatografía de papel
como lo indicaba la guía, sino que, se realizó por La prueba de nitroprusiato de sodio se realizó
medio de una placa cromatográfica silica gel de añadiendo 2 ml de las diferentes soluciones de
aluminio. Se trazó la línea indicadora en el borde aminoácidos exceptuando la arginina, después se
inferior de la placa y se realizó una sola aplicación añadió 0,5 ml de nitroprusiato y 0,5 ml de hidróxido
de solución de alanina, ácido aspártico, mezcla de de amonio, indican un color rojo como positivo.
alanina, leucina y ácido aspártico y por último
leucina; al dejar secar las muestras añadidas con un Por último, en la reacción con ácido glioxílico se
capilar, se sumergió la placa en una solución de empleó 2 ml de las soluciones de aminoácidos y
12,8 ml de etanol, 1,6 ml de agua destilada y 1,6 ml luego 2 ml de ácido acético, seguido de 2 ml de
de amoniaco. Al terminar esto se le aplicó ácido sulfúrico lo que generó un color violeta para
ninhidrina a la placa cromatográfica y se rodeó con indicar la positividad de la prueba.
lápiz las manchas resultantes.
2. DATOS, CÁLCULOS RESULTADOS y
Posterior al proceso de cromatografía se realizaron ANÁLISIS
diferentes reacciones con dichos aminoácidos como
la reacción con ninhidrina, para la cual, en Muestra Distancia Distancia
diferentes tubos de ensayo se añadieron diferentes recorrida por recorrida o
soluciones de aminoácidos, excepto de arginina, los el soluto (cm) fase móvil
cuales todos dieron positivo, entre un color violeta o (cm)
marrón. Acto siguiente se realizó una prueba Alanina (A) 2,5 5,1
xantoproteica, adicionando 0,5 ml de las soluciones
y 0,5 ml ácido nítrico concentrado, posterior a eso Ácido 1,7 5,1
se le agrego 2 ml de NaOH indicando un color aspártico (B)
 Leucina (C) 4 5,1
Mezcla de 4,2 5,1
A+B+C
Tabla 1: Resultados de las medidas de
cromatograma después de haber sido revelado con
ninhidrina.
Se aplicó la fórmula de factor de retención (1) para
determinar los Rf de los aminoácidos en el
cromatograma.
𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜
𝑅𝑓 = 𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑙𝑎 𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑚ó𝑣𝑖𝑙
(1)
2,5 𝑐𝑚
𝑅𝑓𝑎𝑟𝑔𝑖𝑛𝑖𝑛𝑎 = 5,1 𝑐𝑚
= 0, 53 𝑐𝑚
1,7 𝑐𝑚
𝑅𝑓𝑎𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑎𝑠𝑝á𝑟𝑡𝑖𝑐𝑜 = 5,1 𝑐𝑚
= 0, 33 𝑐𝑚
𝑅𝑓𝑙𝑒𝑢𝑐𝑖𝑛𝑎 =
4 𝑐𝑚
= 0, 76 𝑐𝑚
5,1 𝑐𝑚
4,2 𝑐𝑚
𝑅𝑓𝑚𝑒𝑧𝑐𝑙𝑎 𝑑𝑒 𝐴 + 𝐵 + 𝐶 = 5,1 𝑐𝑚
= 0, 78 𝑐𝑚
La cromatografía es un procedimiento químico, que
permitió la separación de mezclas. Este proceso
contó con dos fases la cual una fue la fase
estacionara, en donde se usó una placa de silicagel
que fue donde se pusieron las muestras con un
capilar; en un principio estas muestras eran
incoloras, y una segunda fase la cual era una fase
móvil donde se usó un solvente orgánico [1] como
lo fue el etanol que sirvió para disolver los
aminoácidos y favoreció la movilidad en la fase
estacionaria; por otro lado, el agua sirvió como
interacciones polares de los aminoácidos,
contribuyendo en su movilidad respectivamente [2]
y el amoniaco ayudo en la formación de amonio y
tener una mejor observación del aminoácido cuando
es aplicada la ninhidrina (la cual es muy usada para
para poder identificar aminoácidos), puesto que al
sacar las muestras del solvente para cromatografía
fueron rociadas con este, ya que la reacción de los
aminoácidos con ninhidrina se da por el grupo
α–NH2 [3], definiendo así los puntos de los
aminoácidos con un color rosado un poco fuerte.
Esta separación se dio por las diferentes
interacciones que pueden presentar cada uno de los
compuestos de la muestra como lo fue las
diferencias polares ya que cada aminoácido cuenta
con una estructura diferente y una polaridad
distinta, pudiendo así moverse a distintas
velocidades en la fase móvil, también la
composición de la fase móvil causó diferencias ya
que esta pudo predominar en la solubilidad de
algunos aminoácidos y su facultad para reaccionar
con la fase estacionaria, haciendo así que algunos
aminoácidos tuvieran una migración más corta[4].
Se realizó una prueba de ninhidrina, que es
cualitativa e identifica aminoácidos cuyo grupo
amino se encuentre libre, formando amoníaco y
anhídrido carbónico, y una reducción de la
ninhidrina a hidrindantina; la cual reacciona
nuevamente con amoniaco y con ninhidrina,
generando la coloración violeta [1]. Así se puede
evidenciar en la figura 1, que representa como la
ninhidrina descarboxila y retira el grupo amino del
aminoácido. La visualización del color azul-violeta
es posible gracias a que absorbe a 570 nm de
longitud de onda [2], característico de este color.
Una explicación más específica del proceso de
reacción inicia con que la ninhidrina se protona con
el aminoácido, lo que genera la creación un grupo
hidroxilo, cuya carga es removida por un ataque
nucleofílico realizado por el mismo grupo amino,
luego al reaccionar con otro aminoácido, la reacción
produce agua, al igual de que su carbono unido al
nitrógeno queda cargado negativamente por lo que
es necesaria la participación del aminoácido con
que reacciona para generar un doble enlace entre
ellos formando una imina primaria que a su vez
produce una reorganización de electrones que
traduce una descarboxilación, donde la adición de
agua genera una carga negativa en el nitrógeno, que
al reorganizar los electrones de la molécula, se
forma un grupo carbonilo, que le cede un hidrógeno
al grupo amino para generar el complejo que
reaccionara con otra molécula de ninhidrina [3]
Esta prueba es sensible así que determina
cantidades pequeñas de estos aminoácidos
representados en la intensidad del color. En la
prolina, la prueba dará una coloración amarilla ya
que el grupo amino está sustituido y tiene unido a él
un anillo de pirrolidina, de manera que hay un
grupo (NH) en vez de un (NH2) fundamento que se
puede explicar en la figura 2 Por tanto, no se realiza
la reacción y se puede identificar el color a 440 nm
de longitud de onda. Por otro lado, Se obtuvo un
resultado positivo para el ácido aspártico, leucina,
asparagina, metionina y tirosina

Después de realizó una prueba cualitativa, la cual es Figura 1 Reacción de aminoácido con ninhidrina.
la xantoproteica que identifica el grupo bencénico
que puedan tener los aminoácidos. Esto se realiza
por medio de la nitración del anillo bencénico en
una sustitución aromática electrofílica. La tirosina,
prueba positiva, posee un grupo OH en su anillo,
que funciona como activante, facilitando la
reactividad de la molécula para así poderse a unir al
Figura 2 Reacción de prolina con ninhidrina
ion nitronio generado a partir del ácido nítrico, el
cual genera dicho ion y también agua. Al unirse al
ion nitronio, esto genera una resonancia en el anillo
aromático, movilizando electrones dentro de él. [4]

La fenilalanina, no posee ningún grupo funcional

adherido al anillo aromático, así que no tiene un
Figura 3 Reacción xantoproteica de tirosina
mismo principio de activación que la tirosina, por
esto la reacción con ácido nítrico se da muy leve,
casi invisible. Esto se puede evidenciar en la figura
4.

Siguiendo con la tirosina, después de la resonancia

producida por la sustitución electrofílica, se genera
una desprotonación, la cual produce la formación de Figura 4 Reacción xantoproteica de fenilalanina
un NO2 en el mismo punto donde se dio la unión, a
este procedimiento se le conoce como la nitración;
acto seguido, la adición de un medio alcalino genera
una sal, la cual identifica el color final, que es
mucho más intenso que el del principio y en este
caso es naranja. Esto se puede evidenciar en la
figura 3 [4].

Para los demas aminoacidos, exceptuando el Figura 5 Reacción xantoproteica de triptófano

triptófano (que cumple la misma linealidad) en la
figura 5 , la tirosina y la fenilalanina, no arrojaron
un resultado positivo, debido a que estos
aminoácidos no contienen un grupo bencénico en su
estructura, además el fenol utilizado en la práctica
se encontraba contaminado por otra sustancia lo
cual justifica la coloración amarilla, después de
agregar hidróxido de sodio; sin embargo cabe
resaltar que esta prueba es negativa
3. CONCLUSIONES
- Se pudo determinar que la técnica de
cromatografía es un método el cual es muy
fácil y económico para la separación y
observación de aminoácidos, en donde la
muestra es arrastrada a lo largo de la fase
estacionaria, y el solvente reacciona de
formas diferentes con las soluciones
haciendo que cada una migre a una
velocidad distinta. Además se pudo calcular
 el factor de retención para cada muestra el aminoácidos por cromatografía en capa fina
cual nos indico el movimiento que tuvo cada y detección mediante reacción con
compuesto a lo largo de la placa. ninhidrina.
- Se lograron emplear ciertas pruebas https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-m
específicas para determinar la existencia ol/pdfs/11%20CROMATOGRAFOA%20D
tanto de aminoácidos con grupo amino libre E%20CAPA%20FINA%20DE%20AAs.pdf
y para otros los cuales contienen un grupo 2. Cromlab S.L. (s. f.) Ninhidrina para
bencénico. Se determinó en las prueba con detección espectrométrica de aminoácidos.
ninhidrina un resultado positivo para el http://www.cromlab.es/reac_der_aa_ninhydr
ácido aspártico, leucina, asparagina, in.htm
metionina y tirosina, algunos con con 3. Organic tube (2019). Prueba de ninhidrina-
coloración más intensa que otra; por otro identificación de aminoácidos-mecanismo
lado la reacción xantoproteica pudo completo.
determinar la positividad del triptófano, la https://www.youtube.com/watch?v=TrF36X
tirosina y la fenilalanina ante una reacción d_YjE
con ácido nítrico 4. Organic tube (2020). Reacción
xantoproteica para aminoácidos-
4. BIBLIOGRAFÍAS mecanismo completo.
https://www.youtube.com/watch?v=v5eFPH
1. Libretexts. (2022). 25.4: Análisis de XuD8o
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https://espanol.libretexts.org/Quimica/Qu%
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serio)/25%3A_Amino%C3%A1cidos%2C_
P%C3%A9ptidos_y_Prote%C3%ADnas/25.
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A1cidos
2. TÉCNICAS DE ANÁLISIS EN QUÍMICA
ORGÁNICA CROMATOGRAFÍA. (2019).
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https://fcf.unse.edu.ar/archivos/series-didacti
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3. TRABAJO PRÁCTICO N° 3.
PROTEÍNAS, PÉPTIDOS Y
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http://www.fcn.unp.edu.ar/sitio/farmacognos
ia/wp-content/uploads/2017/03/TP3-_PROT
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4. NUEVAS CONTRIBUCIONES DE LA
CROMATOGRAFÍA
ELECTROCINÉTICA CON DETECCIÓN
UV Y DE ESPECTROMETRÍA DE
MASAS EN EL CAMPO DE LAS
SEPARACIONES QUIRALES. (2007).
MARÍA CASTRO PUYANA.
https:////C:/Users/Usuario/Downloads/Tesis
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1. V. Jesus, Novo J, Diaz N, Ruiz B. (16 de

septiembre de 2006) Separación de