Laboratorio de Bioquímica – Universidad Santiago de Cali

AMINOÁCIDOS

José Manuel Chagüeza Sanchez (1006016922), Darío Jiménez Arango (1006435430),

Valeria Collazos Simales (1005894670)
Práctica No 3. Universidad Santiago de Cali
5/10/2022

RESUMEN

Se realizaron diferentes ensayos cualitativos (ninhidrina, Xantoproteica, prueba de

coagulación y prueba de Biuret) con el objetivo de la identificación de aminoácidos
presentes en muestras conocidas, debido a la especificidad de cada una de estas pruebas y a
las características estructurales de cada aminoácido se consiguió reconocerla presencia o
ausencia de ciertas estructuras en las muestras analizada, por lo tanto son buenos métodos
para el análisis, mientras que la cromatografia se utilizo para conocer la solubilidad de
diferentes aminoácidos incluyendo su separación.

PALABRAS CLAVE: Análisis e identificación de aminoácidos, Estructura de aminoácidos,

Pruebas Xantoproteica, Test de Biuret, cromatografia de aminoacidos.

SUMMARY

Different qualitative tests (ninhydrin, Xantoproteica, coagulation test and Biuret test) were
carried out with the aim of identifying amino acids present in known samples, due to the
specificity of each of these tests and the structural characteristics of each amino acid.
recognize the presence or absence of certain structures in the analyzed samples, therefore
they are good methods for analysis, while chromatography was used to determine the
solubility of different amino acids including their separation.

KEY WORDS: Analysis and identification of amino acids, Structure of amino acids,
Xanthoproteic Tests, Biuret Test, amino acid chromatography.

METODOLOGÍA Y RESULTADOS 1)
1 𝐿 𝑆𝑙𝑛 1 𝑔 𝐴𝑚𝑖𝑛𝑜á𝑐𝑖𝑑𝑜
100 𝑚𝐿 𝑆𝑙𝑛 · 1000 𝑚𝐿 𝑆𝑙𝑛
· 1 𝐿 𝑆𝑙𝑛
Inicialmente se realizó la preparación de
las soluciones de los aminoácidos a usar,
= 0, 10 𝑔 𝑑𝑒 𝑎𝑚𝑖𝑛𝑜á𝑐𝑖𝑑𝑜
cada solución debía presentar una
concentración de 1 g/L en 100 mL, para
En el caso de la solución que contenía tres
determinar la cantidad de soluto necesaria
aminoácidos (Alanina, leucina y ácido
para obtener dicha concentración se utilizó
aspártico), para obtener la concentración
la ecuación 1.
deseada se aplicó la ecuación 2, en la que
se partió la cantidad de soluto necesaria en
 Laboratorio de Bioquímica – Universidad Santiago de Cali

tres, lo que corresponde a los gramos a

utilizar de cada aminoácido
respectivamente.

2)
0, 1 𝑔 𝑑𝑒 𝐴𝑚𝑖𝑛𝑜á𝑐𝑖𝑑𝑜 ÷ 3 = 0, 03 𝑔 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑑
𝑎𝑚𝑖𝑛𝑜á𝑐𝑖𝑑𝑜 (𝐴𝑙𝑎𝑛𝑖𝑛𝑎, 𝑙𝑒𝑢𝑐𝑖𝑛𝑎 𝑦 á𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑎𝑠𝑝á

Con las soluciones listas, se procedió a

realizar la separación de aminoácidos por
cromatografía de capa fina, para ello se
utilizó la solución de alanina, leucina,
ácido aspártico y la mezcla de los tres
aminoácidos, se trazaron líneas de 1 cm en
el borde superior e inferior de la placa a lo
largo de ella, y en esta última, con 1 cm de
distancia, fueron aplicadas cada una de las
soluciones, se dejaron secar y siendo
cuidadosos de no contaminar la placa
durante el proceso se colocó en el centro
de un beaker de 100 mL que contenía la
cantidad necesaria para no superar el
límite del borde inferior de la placa de
solvente para cromatografía, se dejó
desarrollar el cromatograma hasta llegar a
la línea superior y en este punto se extrajo
la placa, se dejó ventilar y posteriormente
se roció con ninhidrina dejándola secar en
la plancha, los resultados finales se pueden
observar en la (Figura 1).
Figura 1. Resultados de la cromatografía,
M (Mezcla de los aminoácidos) A
(Alanina) L (Leucina) y AS (Ácido
aspártico).
Posterior a la separación de aminoácidos
por cromatografía, se realizaron diferentes
pruebas para caracterizar los aminoácidos
anteriores y otros que fueron usados a lo
largo de la práctica.
Reacción con ninhidrina.
Para esta prueba se adicionaron 0,5 mL de
las soluciones con concentración 1 g/L de
prolina, ácido aspártico, leucina,
asparagina, metionina y tirosina en un tubo
de ensayo diferente, luego a cada una se le
adicionó 0,5 mL de ninhidrina con acetona
al 1 %, una vez adicionada la ninhidrina se
pusieron todos los tubos en un baño de
agua hirviendo, el cambio de coloración a
un azul - violeta nos indico la positividad
de la prueba, en el caso de la prolina, la
positividad nos la indico la aparicion de un
color amarillo. (Figura 2).
 Laboratorio de Bioquímica – Universidad Santiago de Cali
Figura 2. Resultados de la prueba con
ninhidrina.
Reacción Xantoproteica.
En esta caracterización, en distintos tubos
de ensayo se agregaron 0,5 mL de las
soluciones de glicina, tirosina, triptófano,
fenilalanina, y fenol, a cada una se le
adiciono 0,5 mL de ácido nítrico
concentrado y se dejaron enfriar, se
observo los cambios de color que
presentaban las soluciones a pH acido y
posteriormente se adicionaron 2 mL de
hidroxido de sodio para observar el
cambio de coloracion que presentaban las
soluciones en pH basico, los resultados
finales se detallan en la (Figura 3).
Figura 3. Resultados finales de la reacción
xantoproteica.
Prueba con nitroprusiato de sodio.
La caracterización de aminoácidos
mediante esta prueba se realizó
adicionando 0,5 mL de nitroprusiato de
sodio seguido de 0,5 mL de hidróxido de
amonio a cada uno de los tubos de ensayo
que contenían 2 mL de la solución de
glicina, cisteína, tirosina, triptófano,
fenilalanina, metionina, ácido aspártico y
arginina. La positividad de la prueba se
reflejó con la aparición de una coloración
rojiza - púrpura para la cisteína el único
aminoácido que arrojó dicho resultado, los
demás aminoácidos obtuvieron una
coloración amarilla (Resultado negativo).
Figura 4. Resultados de la prueba con
nitroprusiato de sodio.
Reacción con ácido glioxílico.
Para la última caracterización se utilizaron
las soluciones de glicina, tirosina,
triptófano, fenilalanina y metionina, a las
cuales se les adiciono 2 mL de ácido
acético glacial y 2 mL de ácido sulfúrico
concentrado, se observo la aparicion de un
color amarillo solamente para la solucion
de triptofano, las demas soluciones de
aminoacidos conservaron su color inicial.
Figura 5. Resultados de la prueba con
ácido glioxílico.
ANÁLISIS DE RESULTADOS
 Laboratorio de Bioquímica – Universidad Santiago de Cali

La cromatografía por capa fina es un

método físico de separación que nos
permite identificar los distintos
componentes de mezclas complejas, en
nuestro caso, se usó para identificar
alanina, leucina y ácido aspártico en una
muestra, esta identificación se realizó
analizando la distancia recorrida de cada
aminoácido en el cromatograma, la
distancia que recorre cada componente
depende de su capilaridad, que á su vez
depende de la tensión superficial, la cual
va de la mano con la cohesión del fluido y
que le da la capacidad de subir o bajar por
un tubo capilar, pero el factor de más
importancia es la solubilidad que tiene
frente a la fase móvil, en nuestro caso
llamada solvente para cromatografía, por Figura 6. Comparación de la distancia
lo que la solubilidad es proporcional a la recorrida por cada aminoácido en la
distancia que recorre nuestro aminoácido. muestra, con la distancia recorrida de
Finalizada la cromatografía se obtuvieron manera individual.
3 puntos que corresponden a los tres
aminoácidos usados, su identificación se Por descuidos del personal de laboratorio
realizó a partir de la comparación de las hubo un mal posicionamiento de las
distancias que recorrió cada aminoácido sustancia usadas ya que en el espacio del
contenido en la muestra, con la distancia ácido aspártico (AS) fue donde se aplicó la
que cada aminoácido realizó de manera muestra que contenía los tres aminoácidos,
individual, de esta manera se obtuvo, por ende presenta 3 variaciones de
como aminoácido menos soluble en la fase recorrido y en donde iba la mezcla
móvil al ácido aspártico, como mencionada anteriormente (M) se aplicó la
medianamente soluble a la leucina y el que solución de ácido aspártico.
presentó mayor solubilidad de los tres a la
alanina. [1] En la caracterización de aminoácidos con
ninhidrina se obtuvieron compuestos de
una coloración azulada - púrpura para la
leucina, asparagina, metionina, tirosina y
el ácido aspártico, esto gracias a la
reacción que ocurre entre la ninhidrina y el
grupo amino libre que poseen estos
aminoácidos, dando como productos
amoniaco, el aldehído correspondiente al
aminoácido usado y hidrindantina, este
 Laboratorio de Bioquímica – Universidad Santiago de Cali
último producto se da de la reducción de la
ninhidrina.
Figura 7. Reducción de la ninhidrina.
La coloración propia de esta
caracterización (Azul - Violeta) se da por
la formación de un compuesto de acción
doble resultado de la reacción del
amoníaco formado, con la hidrindantina y
otra molécula de ninhidrina, que se lleva a
cabo en caliente, por eso el uso de un baño
de agua hirviendo.
Figura 8. Formación del complejo azul -
violeta.
En el caso de la prolina se obtuvo un
compuesto de coloración amarilla, esta
coloración diferente a las demás se debe al
grupo amino sustituido presente en este
aminoácido, característica que lo difiere de
los demás, pues se habla de una amina
secundaria que forma parte de un anillo de
pirrolidina. [2]
Figura 9. Formacion del complejo
amarillo - naranja.
En la reacción xantoproteica se obtuvieron
coloraciones amarillas para la solución de
triptófano y tirosina y una coloración
anaranjada para la solución de fenol, esto
se debe a que estos compuestos en su
estructura poseen un anillo aromático o
heterocíclico, cualidad que la reacción
xantoproteica puede identificar, ya que
estos anillos aromáticos reaccionan con el
ácido nítrico concentrado en medio
caliente produciendo compuestos nitrados
de color amarillo los cuales, en medio
basico, producen sus sales de un color
anaranjado respectivamente.
En las soluciones de triptófano y tirosina,
no se presentó un anaranjado como el de la
solución de fenol en medio básico, porque
las cantidades de hidróxido de sodio no
fueron medidas correctamente y tampoco
se realizó la medida del pH de cada
solución, por lo que es seguro de que no
hayamos alcanzado un medio alcalino
como se hizo con el fenol, lo que causó
que nuestras soluciones no viraran a una
coloración anaranjada.
 Laboratorio de Bioquímica – Universidad Santiago de Cali
Figura 10. Reacción que presenta el anillo
aromático del aminoácido en la prueba
xantoproteica.
Para el caso la fenilalanina no se
presentaron cambios de coloración a pesar
de tener un anillo aromático en su
estructura, esto se debe a que el núcleo
bencénico que contiene es difícil de ser
nitrado, por lo que la prueba puede ser
débilmente positiva o negativa como es
nuestro caso. [3]
En la prueba con nitroprusiato de sodio se
obtuvo un resultado positivo sólo para la
cisteína, esto debido a que es el único
aminoácido de los usados en esta
caracterización que contenia un grupo
sulfhidrilo, este grupo reacciona con el
nitroprusiato de sodio en medio alcalino,
en nuestra caso proporcionado por los 0,5
mL de hidróxido de amonio, produciendo
un compuesto de color rojizo - purpura. [4]
[5]
Figura 11. Formación del complejo rojo -
púrpura.
Por último, en la prueba con ácido
glioxílico, se obtuvo solamente un cambio
de coloracion (Amarillo) para el
triptofano, este resultado no va acorde con
la teoria, pues la positividad de esta
reaccion se ve reflejada en una coloracion
violeta, que determina la presencia de un
grupo indol (Benceno unido a un anillo de
cinco atomos con un doble enlace y un
atomo de nitrogeno), en este caso propio
del triptofano, este error lo podemos
asociar al mal uso de los reactivos, que
conlleva a la contaminacion o a las malas
medidas de cantidad de los mismos,
tambien podemos asociar este mal
resultado a descuidos del personal de
trabajo, que pudo haber adicionado o
utilizado los reactivos de manera
incorrecta.
La reacción que debía proporcionar el
color particular (Rojo - púrpura) de esta
prueba se da entre el grupo indol, que
reacciona con el ácido glioxílico en
presencia de ácido sulfúrico concentrado
para formar un anillo rojo - púrpura en la
zona de interfase, producto de la
condensación del grupo carbonilo del
 Laboratorio de Bioquímica – Universidad Santiago de Cali
ácido glioxílico y al grupo indol de nuestro
aminoácido. [6] [7]
Figura 12. Formación del complejo rojo -
púrpura.
CONCLUSIONES
Todos los aminoácidos son fundamentales
para la vida, por lo cual es muy importante
conocerlos, se logró la identificación de
estos mediante diferentes pruebas, las
cuales tienen como fundamentos teóricos
reacciones químicas, causantes de un
cambio de color al formar complejos.
Cada prueba que se realizo busca
identificar algún componente del
aminoácido como es la prueba
xantoproteica, la cual en especifico
reconoce los aminoácidos con un grupo
bencénico (anillo aromático), mientras que
la prueba con nitroprusiato identifica
aminoácidos con un grupo sulfhidrilo,
estas pruebas son un buen método de
identificación de aminoácidos, llegando a
ser usadas en diferentes laboratorios,
siendo un ejemplo como en las pruebas de
detección de metabolitos.
La pruebas realizadas se consideran de
gran de caracterización, ya que necesita
poca cantidad de reactivos para que ocurra
dicha formación del complejo
correspondiente, siendo muy importante
recalcar, las buenas prácticas de
laboratorio para evitar alguna confusión o
mal manipulación del material del
laboratorio tal como equivocación de
reactivos (aminoácidos) y contaminación
de estos, causando así resultados negativos
o no respaldados por la teoría, como
ocurrió en la prueba con el ácido
glioxílico.
Así mismo el uso de la cromatografía
como método de separación de
aminoácidos, se considera muy confiable
pero, siendo importante una buena
manipulación a la hora de no contaminar la
placa, poner los aminoácidos en la línea
con suficiente espacio entre estos, ya que
estos se pueden tocar entre sí, lo que
termina en un gran mancha al realizar la
revelación, imposibilitando la toma de las
medidas del recorrido del aminoácido para
conocer su solubilidad.
BIBLIOGRAFÍA:
[1] Aguilar T. Coralia, Carrillo Fernando.
2014. Cromatografía de aminoácidos
(Hidrólisis de una proteína).
[2] Novo J. Jesus, Diaz A. Maria. 2017.
Separación de aminoácidos por
cromatografía en capa fina y detección
mediante reacción con ninhidrina.
 Laboratorio de Bioquímica – Universidad Santiago de Cali

[3] Gil Marielsa. 2019. Reacción

xantoproteica: fundamento, procedimiento,
uso.

[4] Burgos H. Luis, Carmona C. Cristian.

2015. Pruebas bioquímicas para la
detección de metabolitos producidos en los
errores innatos del metabolismo.

[5] Brady T. Clayton, Giesen D. Callen.

(2020) Cyanide - Nitroprusside
colorimetric assay: A rapid colorimetric
screen for urinary cystine.

[6] Alvarez S. Yesmith, Barrera M.

Yasbrein. 2016. Propiedades físicas y
químicas de los aminoácidos.

[7] Basnet Anup. 2020. Hopkins - Cole

test (Adamkiewicz – Hopkins test) -
Detection of tryptophan.