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ESPECTROSCOPIA DE

FLUORESCENCIA
ANALISIS DE ALIMENTOS
NOMBRE: EDGAR LOOR CALLE

GENERALIDADES DE LA ESPECTROSCOPIA DE
FLUORESCENCIA
Laespectrometra de fluorescencia es un tipo de espectroscopia
electromagntica que analiza la fluorescencia de una muestra.
Utiliza un haz de luz, por lo general luz ultravioleta, que excita los
electrones de las molculas de ciertos compuestos y provoca que emitan luz
de una menor energa, generalmente luz visible (aunque no
necesariamente).
Los dispositivos que miden la fluorescencia se llaman fluormetros o
fluormetros.

TEORA
En la espectroscopia de fluorescencia, primero se excita la muestra mediante la absorcin
de un fotn de luz, desde su estado electrnico basal a uno de los distintos estados
vibracionales del estado electrnico excitado.
Las colisiones con otras molculas causan que la molcula excitada pierda energa
vibracional hasta que alcanza el estado vibracional ms bajo del estado electrnico
excitado.
La molcula desciende luego a uno de los distintos niveles de vibracin del estado
electrnico basal, emitiendo un fotn en el proceso.
Como las molculas pueden caer a cualquiera de los diferentes niveles de vibracin en el
estado basal, los fotones emitidos tendrn diferentes energas y, por lo tanto, frecuencias.
Mediante el anlisis de las diferentes frecuencias de luz emitida porespectrometra de
fluorescencia, junto con sus intensidades relativas, se puede determinar la estructura de
los diferentes niveles de vibracin.

INSTRUMENTOS
En la espectrometra de fluorescencia se utilizan dos tipos generales de instrumentos:
* Fluormetros de filtro. Utilizan filtros para aislar la luz incidente y la luz fluorescente.
* Espectrofluormetros. Usan monocromadores de retculo de difraccin para aislar la
luz incidente y la luz fluorescente.
Diversas fuentes de luz pueden ser utilizadas como fuentes de excitacin, incluyendo el
lser, fotodiodos y lmparas; arcos de xenn y lmparas de vapor de mercurio. Un lser
slo emite luz de alta irradiancia en un intervalo muy estrecho de longitudes de onda,
por lo general a 0,01 nm, lo que hace innecesario el monocromador de excitacin o el
filtro. La desventaja de este mtodo es que la longitud de onda de un lser no se puede
cambiar mucho. Una lmpara de vapor de mercurio es una lmpara lineal, lo que
significa que emite luz cerca del pico de longitudes de onda. Por el contrario, un arco de
xenn tiene un espectro de emisin continuo con intensidad casi constante en el rango
de 300-800 nm, y una irradiancia suficiente para las mediciones hasta justo por encima
de 200 nm.

INSTRUMENTOS
La fluorescencia se mide ms a menudo en un ngulo de 90 en relacin a la luz de
excitacin. Esta geometra se utiliza en lugar de colocar el sensor en la lnea de la
luz de excitacin en un ngulo de 180 a fin de evitar la interferencia de la luz de
excitacin transmitida.
El fluormetro ms verstil, con monocromadores dobles y una fuente de luz de
excitacin continua, puede registrar tanto un espectro de excitacin como un
espectro de fluorescencia.
Al medir los espectros de fluorescencia, la longitud de onda de la luz de excitacin
se mantiene constante, de preferencia en una longitud de onda de alta absorcin, y
el monocromador de emisin escanea el espectro. Para medir los espectros de
excitacin, la longitud de onda que pasa a travs del filtro o monocromador de
emisin se mantiene constante y el monocromador de excitacin va escaneando. El
espectro de excitacin generalmente es idntico al espectro de absorcin, ya que la
intensidad de la fluorescencia es proporcional a la absorcin.

ANLISIS DE LOS DATOS


A bajas concentraciones, la intensidad de fluorescencia es, por lo general, proporcional a la
concentracin del fluorforo.
Los distintos tipos de distorsiones se pueden clasificar en relacin al instrumento o a la muestra.
Las distorsiones derivadas del instrumento:
La intensidad de las fuentes de luz y las caractersticas de la longitud de onda varan con el tiempo
durante cada experimento. Por otra parte, ninguna lmpara tiene una intensidad constante en
todas las frecuencias. Para corregir esto, se puede aplicar un haz separador despus del filtro o
monocromador de excitacin, para dirigir una porcin de luz a un detector de referencia.
Rendimiento de transmisin de los monocromadores y los filtros:
Ya que tambin puede cambiar con el tiempo. La eficacia de la transmisin del monocromador
vara dependiendo de la longitud de onda. Esta es la razn por la que debe colocarse un detector
de referencia despus del filtro o monocromador de excitacin.

Distorsiones de la muestra:
Algunos aspectos de la muestra deben tenerse en cuenta tambin.
1. En primer lugar, la fotodescomposicin puede disminuir la intensidad de
fluorescencia con el tiempo.
2. La dispersin de la luz tambin debe tenerse en cuenta.
3. Los tipos ms importantes de dispersin en este contexto son la dispersin
de Rayleigh y la de Raman.
La luz dispersa por dispersin de Rayleigh tiene la misma longitud de onda que
la luz incidente, mientras que en la dispersin Raman la luz cambia a
longitudes de onda ms largas.
La dispersin de Raman es el resultado de un estado electrnico virtual
inducido por la luz de excitacin. A partir de este estado virtual, las molculas
pueden volver a un nivel vibracional distinto del estado basal.
En los espectros de fluorescencia siempre se observa una diferencia de nmero
de onda constante en relacin con la excitacin; por ejemplo, en el agua el pico
aparece a un nmero de onda 3600 cm-1 inferior a la luz de excitacin.

APLICACIONES

La espectrometra de fluorescencia se utiliza en anlisis bioqumicos, mdicos,


qumicos y de investigacin de compuestos orgnicos. Tambin se ha utilizado para
diferenciar los tumores malignos de piel de los benignos.
La fluorescencia tambin puede utilizarse para reorientar los fotones.

FLUORESCENCIA DEL TRIPTFANO


Este tipo de fluorescencia es una prueba importante que puede ser usada para estimar la
naturaleza del microambiente del triptfano (unaminocido).
Cuando se realizan experimentos con desnaturalizantes, surfactantes u otras molculas
anfiflicas, el microambiente del triptfano puede cambiar.
Por ejemplo, si unaprotenaque contiene un nico triptfano en su ncleo "hidrofbico" se
desnaturaliza con el aumento de temperatura, aparece un cambio de color en el espectro de
emisin del rojo. Esto se debe a la exposicin del triptfano a un medio ambiente acuoso en
contraposicin a una protena hidrofbica interior. En contraste, la adicin de un tensioactivo a
una protena que contiene triptfano, que se encuentra expuesto al solvente acuoso, causar un
cambio al espectro azul de emisin si el triptfano est incrustado en la vescula o micela de
surfactante. Las protenas que carecen de triptfano puede ser enlazadas a un fluorforo.
A 295 nm, el espectro de emisin del triptfano es dominante sobre la fluorescencia ms dbil
de la tirosina y fenilalanina.