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Técnicas

espectrofotométricas
La palabra espectrofotómetro se deriva Las técnicas espectroscópicas
de la palabra latina spectrum, que la utilizan la medida de los
significa imagen, y de la palabra griega efectos que produce la
interacción de las radiaciones
phos o photos, que significa luz. El
electromagnéticas con la
espectrofotómetro, construido mediante materia.
procesos avanzados de fabricación, es
uno de los principales instrumentos
diagnósticos y de investigación
desarrollados por el ser humano
Radiación electromagnética
 Es la propagación de ondas de energía eléctrica y magnética, moviéndose juntas a través del
espacio a la velocidad de la luz.
 Como características de la radiación electromagnética, dado que es bien conocida la naturaleza
ondulatoria y corpuscular de la materia, se define el espectro electromagnético como un conjunto
de ondas que se distinguen por la frecuencia y la amplitud de las ondas que lo componen.
 La amplitud depende la intensidad radiante y está relacionada con el campo eléctrico. La
frecuencia está relacionada con la energía asociada.
 Existe una fórmula que relaciona la energía (E) y frecuencia (Ϟ), vinculadas por medio de la
constante Planck (h):
 E=hxϞ
 La frecuencia (Ϟ) de una onda y su longitud de onda (λ) están inversamente relacionadas:
 Ϟ = c/λ
 Siendo c = velocidad de la luz; entonces, sustituyendo la frecuencia en la formula inicial se
obtiene:
 E = h x c/λ
 Es decir, la energía es inversamente proporcional a la longitud de onda.
Radiaciones electromagnéticas
Propiedades de la luz
¿ de qué color es la sandia?
 Esta pregunta no parece muy difícil. La mayoría de la gente sabe desde pequeña que
las sandias son verdes por fuera, rojas por dentro y tienen unas pequeñas pipitas
negras.
 Pero. ¿de qué color es una sandia antes de abrirla? Ahora si que es difícil la pregunta
. En el estado actual de nuestros conocimientos, debemos suponer que no tiene
ningún color. En efecto, el color no es una propiedad intrínseca de la materia, sino
que es una sensación óptica del observador ( por ello hay personas daltónicas y sobre
colores no puede haber discusiones), basada en la longitud de los colores reflejados
por el objeto (se ve el color que no es absorbido). Por ello no podemos ver el color
de una sandia cerrada, ya que para ver necesitamos luz
color

 Actualmente, el color, definido por la Real Academia de la lengua Española


como “sensación producida por los rayos luminosos que impresionan los
órganos visuales y que depende de la longitud de onda”
Espectrometría de absorción de energía

 Cuando una determinada radiación electromagnética incide (Io) sobre solución que contiene
un compuesto que absorbe energía de una determinada longitud de onda, la intensidad de luz
transmitida (It) es menor que la incidente, puesto que parte de ella ha quedado retenida
(absorbida) por esa sustancia de la solución.
 La absorbancia es un concepto algo abstracto, que define una relación entre las dos
intensidades, conocida como transmitancia (T) y que consiste en que es una proporción entre
las intensidades transmitidas e incidente.
 T = It/Io
 Espectroscopia de fluorescencia:
la fluorescencia y fosforescencia son dos fenómenos de desexitación radiante que se ha
utilizado con diferentes finalidades. La fluorescencia es un fenómeno que se produce en un
periodo de tiempo muy corto, mientras que la fosforescencia puede durar varias horas desde
su estimulación radiante.
 La energía de la luz emitida es menor que la de la absorbida y, por tanto, su longitud de
onda, mayor. La diferencia entre estas dos longitudes de onda se denomina desviación de
Stokes y, de forma general, los mejores resultados de las medidas de fluorescencia se
obtienen con compuestos que tengan grandes diferencias entre la longitud de onda de
excitación y de emisión
ESPECTROMETRIA DE DISPERSION
 Cuando un rayo de luz choca con una partícula en suspensión, una parte de la
luz se absorbe, otra se refleja y otra se dispersa. La dispersión de la luz por
una partícula depende de su tamaño, su índice de refracción respecto al del
líquido que la rodea y la longitud de onda de la luz.
TURBIDIMETRIA
 Se puede decir grosso modo que es una medida de la turbidez. Se mide la luz
trasmitida a través de una solución de partículas. A medida que existen partículas
en la solución, dispersan la luz en distintas direcciones según la longitud de onda y
el tamaño de la partícula, con lo que llega menos luz transmitida a medida que
aumenta el numero de partículas en la solución, por lo que se entiende que la luz
transmitida es inversamente proporcional al numero de partículas. En ciertas
condiciones la ley de Beer.
Nefelometría
 Es un técnica que mide la luz dispersada. Puesto que la dirección de dispersión
depende de la relación entre la longitud de onda y el tamaño de la partícula; se
han diseñado diferentes dispositivos para la detección a diferentes ángulos de la luz
dispersada, que suelen variar desde 10 a 90°de la dirección del haz de luz
incidente. Como lo que se mide es luz dispersada, a medida que aumenta el
numero de partículas, la luz dispersada aumenta, por lo que la luz dispersada es
directamente proporcional al numero de partículas. En determinadas condiciones
sigue la ley de Beer.
 REFRACTOMETRIA

 El fenómeno de la refracción está basado en el cambio de velocidad que


experimenta la radiación electromagnética al pasar de un medio a otro, como
consecuencia de su interacción con los átomos y moléculas del otro medio. Dicho
cambio de velocidad se manifiesta en una variación en la dirección de
propagación.
Espectroscopia de
luminiscencia:
la lumiometría se aplica,
principalmente, en los sistemas
La luminiscencia es la emisión de la
de detección de los
luz fruto de una reacción química.
inmunoanálisis con reactivos
Puede ser quimioluminiscencia,
marcados, por ejemplo los
cuando los electrodos pasan a un
enzimoinmunoanálisis que
estado excitado como consecuencia
utilizan fosfatasa alcalina como
de una reacción química y vuelven a
enzima marcadora en la
su estado basal emitiendo luz, o
detección por
bioluminiscencia, cuando la emisión
quimioluminiscencia.
de luz surge debido a una reacción
catalizada por una enzima.
 Espectroscopia de emisión atómica por llama: La espectroscopia de emisión por llama
se denomina también fotometría de llama. Se basa en la emisión de luz característica por los
átomos de muchos elementos metálicos cuando se les suministra energía con una llama. El
sodio produce luz amarilla (589 nm); el calcio rojo amarillenta (622 nm); el litio roja (760
nm); y el potasio violeta/66 nm). En condiciones controladas, la intensidad de la luz de la
longitud de onda característica producida por cada uno de los átomos es directamente
proporcional al número de átomos de la muestra
 Espectroscopia de absorción atómica:
 La espectroscopia de absorción atómica mide la luz de una determinada longitud de onda
absorbida por los átomos de un elemento. En su estado fundamental, los átomos en forma
de vapor absorben luz de longitudes de onda muy estrechas y pasan entonces a estados de
excitación. El elemento que quiere medirse se vaporiza por medio de una llama o un
método electrotérmico (horno de grafito). La fuente de energía radiante son las lámparas
de cátodo hueco, construidas con el mismo elemento que quiere medirse. Cuando se
excitan los átomos de la lámpara producen un vapor que emite un rayo de luz
monocromática de la misma longitud de onda que la que absorben los átomos de ese
elemento. Cuando la luz procedente de la lámpara de cátodo hueco atraviesa la llama,
parte de aquella es absorbida por los átomos vaporizados en su estado fundamental, lo
que ocasiona un descenso de intensidad del rayo de la lámpara.
Espectrometría de reflectancia
 Esta basada en el propio concepto de la reflectancia, es decir, del color que
presenta un elemento que absorbe un parte de la radiación, color derivado de
las longitudes de onda que no absorbe, como ya se ha dicho, de color y color
complementario.
 Si se considera un sistema de un determinado soporte que contiene una serie
de reactivos desecados, preparados para realizar un determinada reacción
colorimétrica, al disponer sobre este sistema una muestra problema liquida
(suero, orina, plasma, sangre), el sistema se rehidrata y puede
desencadenarse la reacción colorimétrica.
 Osmometría
 La osmometría se basa en una de las propiedades coligativas, la osmosis.
Existen una serie de membranas semipermeables que únicamente permiten el
paso de determinadas especies químicas (moléculas o iones) a través de ellas.
Se emplea un dispositivo en el que se separan dos disoluciones mediante una
membrana semipermeable; las disoluciones tendrán diferente concentración
en un soluto que no sea capaz de atravesar la membrana.
Técnicas electroquímicas
 se basan en la relación que existe entre la electricidad y los cambios químicos que se
producen en las sustancias y miden la corriente o el voltaje que genera la actividad de las
especies iónicas especificas en reacciones de oxidorreducción, en las que se produce un
intercambio de electrones. Este intercambio se produce en una disolución de las sustancias
químicas que participan, también es posible separar físicamente las dos semirreacciones,
oxidación y reducción, con la construcción de una célula electroquímica. En la que el
intercambio de electrones se efectúa a través de un circuito externo a las disoluciones que
intervienen.
 Principales técnicas electroquímicas
 Potenciometría
 Amperometría
 Voltametría
 Culombimetría
 Conductimetría
1. Técnicas potenciométricas

 Las técnicas potenciométricas se basan en la medida del potencial eléctrico entre los dos
electrodos de una célula electroquímica. Si se conoce la concentración del componente de
una de sus semicelulas, que sirven de referencia (generalmente el cátodo), por medio de
la medida del potencial eléctrico se puede calcular la concentración del componente de
la otra semicélula.

Una es
un dispositivo
Capaz de obtener energía
eléctrica a partir
De reacciones químicas.
2. Amperometria

 Es una técnica que se basa en la medición de las variaciones de corriente eléctrica


(intensidad de corriente) que pasa entre dos electrodos de una célula electroquímica
sumergidos en una solución electrolítica cuando entre ellos se aplican un potencial
constante. Esta técnica se utiliza para medir la presión parcial de oxigeno (pO2) en sangre,
mediante el electros de Clark o electrodo de presión de oxígeno
3. Voltametría

 Es una técnica electroquímica en la que mide la corriente de la célula electroquímica


cuando se aplica una diferencia de potencial variable entre el electrodo de medida y el de
referencia lo largo del tiempo.
 Es una técnica muy sensible y permite analizar simultáneamente varios elementos, como
en el caso de la Voltametría anódica de redisolución. La polarografia es una técnica
voltamétrica que utiliza como electrodo de trabajo un electrodo de goteo de mercurio
(Hg), tal como describió Heyrosvsky en 1922.
4. Culombimetría

 Es una técnica electroquímica que se basa en la medición de la carga que pasa entre los dos
electrodos de una célula electroquímica sumergidos en una solución electrolítica. La principal
de esta técnica en los laboratorios clínicos es la medición de la concentración de ion cloruro
(Cl-) en suero, aunque actualmente es una técnica que prácticamente no se utiliza.

Mide la cantidad de electricidad


5. Conductimetría

 Es una técnica basada en la relación lineal que existe entre la concentración de un ion
en solución y la conductividad eléctrica de esa solución y mide el flujo de corriente
entre dos electrodos despolarizados entre los que se han establecido un potencial
eléctrico conocido. Este método para contar electrónicamente las células sanguíneas en
suspensión (método coulter), que se apoya en la conductividad de las células
sanguíneas es menor que la disolución salina en la que están suspendidas.
gracias