Guía de Prácticas de Biología Escuela de Estomatología

PRÁCTICA No 11 EXTRACCIÓN DE ADN DE TEJIDOS VEGETALES Y

ANIMALES

I. INTRODUCCIÓN
Casi todas las células contienen ADN, pero la cantidad presente en algunos tejidos es pequeña y
por lo tanto no son buen material para su extracción. Además, algunos tejidos contienen
actividades altas de la enzima desoxirribonucleasa (Dnasa) la cual fragmenta el ADN. Una fuente
adecuada para la extracción de ADN debe, por lo tanto, contener cantidades altas de este material
y tener muy baja actividad de Dnasa. Así mismo, un buen protocolo a utilizar debe ser aquel que
además de representar un procedimiento simple, deba utilizar como fuente de ADN un material
barato y fácil de encontrar en cualquier época del año. Las arvejas secas y las hojas verdes son
empleadas como fuente vegetal. De fuente animal, el tejido linfoide es muy bueno; el timo es la
mejor fuente, pero el bazo puede usarse con buenos resultados; el hígado de mamífero es también
empleado por ser un tejido blando fácil de romper y de liberar su contenido celular. Los primeros
protocolos de extracción de ADN utilizaban hígado y timo como fuente de DNA. Con la
diseminación de la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob (“mal de la vaca loca”), por razones de
bioseguridad se invalidó el uso de órganos animales y fueron sustituidos por otras fuentes de
origen vegetal. Sin embargo, en las células vegetales la pectina precipita en etanol, al igual que el
ADN en solución salina.
Muchos estudios de Biología Molecular comienzan con la extracción de ácidos nucleicos. El
ADN se desnaturaliza fácilmente y debe trabajarse con cuidado para obtener un producto
estructuralmente semejante al encontrado en la célula. Debe evitarse la tensión mecánica y
condiciones físicas y químicas extremas. Existen kits comerciales que han modificado la rutina de
muchos laboratorios. En los kits, los solventes orgánicos son sustituidos por filtros que retienen el
ADN, en condiciones de alta concentración salina. La elución del ADN retenido en el filtro ocurrirá
en baja concentración salina.
Convencionalmente, para facilitar la extracción se debe desmenuzar el material al máximo y
añadir un detergente (para disolver las membranas celulares, desnaturalizar las proteínas y
disgregar los complejos de nucleoproteínas) en solución salina. La lisis celular libera las moléculas
de ADN y proteicas en una fase acuosa que es separada de los restos celulares por centrifugación.
Las proteínas son removidas de la fase acuosa por digestión enzimática con proteasas (opcional).
El ADN que permanecía en la fase acuosa es precipitado con etanol helado. Esto se debe a que el
ADN, que es soluble en alcohol, s e torna insoluble en presencia de sal (NaCl) porque el Na +
neutraliza la carga negativa de los grupos PO 43-, y precipita. El etanol formará una capa en la
superficie por ser menos denso que la solución. El ADN posteriormente podrá ser purificado y
suspendido en un buffer adecuado. Para una mejor separación del ADN podemos adicionar EDTA,
agente quelante que secuestra los iones Mg 2+ y Ca2+, necesarios para la actividad de las nucleasas,
con lo que se evita la degradación del ADN. Finalmente, se observarán agregados moleculares de
consistencia mucoide (mezcla de proporción variable de ácidos nucleicos, proteínas y pectina) en
la interfase entre la solución acuosa y el etanol.

II. COMPETENCIA
Comprende la importancia de la separación y purificación del ADN en estudios de Biología
Molecular, empleando con responsabilidad un procedimiento sencillo para la extracción de ADN a
partir de muestras vegetales y animales.
III. MATERIALES De la Cátedra:
Prof. E. Marino Olivares de la Cruz
Guía de Prácticas de Biología Escuela de Estomatología
Clase virtual docente.
Plataforma Blackboard.
Plataforma Trilce. Del alumno:
Programa Zoom. Arvejas secas u hojas frescas.
Zumo o extracto de piña o papaya, NaCl
(sal).
IV. PROCEDIMIENTO
Alcohol etílico comercial 96%.
Licuadora, vasos transparentes.
Varilla de vidrio. Guía de prácticas.
1. Colocar en la licuadora 50 g de arvejas secas (de preferencia),
u hojas frescas o hígado fresco, una pizca de sal gruesa y 200
ml de agua fría, y licuar durante 20 a 30 segundos.
(Seguir las normas de bioseguridad, si se opta por hígado
fresco como muestra)
2. Colar la “sopa de la muestra” obtenida anteriormente con ayuda de un colador de poro fino y
luego a través de gasa (3 a 4 dobleces). Descartar los restos de la muestra y la fracción
líquida filtrada depositarla en un vaso refrigerado (esto es importante).
3. Separar 3 cucharadas soperas rasas (algo de 30 mL) del filtrado y conservarlo dentro de un vaso
transparente en refrigeración. (1: Test de pectina)
4. Agregar al resto del filtrado 2 cucharadas soperas de detergente líquido y mezclar
suavemente con una varilla hasta que el filtrado tome un aspecto mucoide. Agregar una
cucharadita de té (algo de 5 mL) de zumo de piña o de papaya (puede ser látex lechoso del
fruto verde, o extracto de semillas) y mezclar una única vez. Dejar reposar de 5 a 10 minutos.
5. Separar en cada uno de otros 2 vasos (2 y 3) transparentes 30 mL del filtrado. Inclinar
levemente cada vaso y muy despacio agregarles un volumen equivalente de etanol 95% bien
frío.
(Esta etapa es crítica; se debe dejar escurrir el etanol por las paredes del vaso de manera que se
vaya situando sobre el líquido hasta formar una segunda capa por encima de la mezcla)
6. De la misma forma, adicionar etanol helado al filtrado del paso 3.
5. Esperar de 5 a 10 minutos sin mezclar las
capas y observar el ADN que precipita
en la interfase de las capas y llega
hasta la superficie. Pectina
8. Retirar el ADN con una varilla de vidrio o ADN
madera, o una aguja de crochet.
(De darse las condiciones, se puede tomar
una muestra de filamentos blanquecinos 1 2y3
con un estilete o con una varilla de vidrio Test de pectina Extracción de ADN
y colocarlos sobre un portaobjetos limpio.
Añadir una gota de azul de metileno y
colocar el cubreobjetos. Observar los
filamentos de ADN al microscopio con
objetivos de 10X y 40X.
 Interpretar lo observado en base a la
competencia de la práctica, en base a la
visualización de los filamentos de ADN y
comparándolo con un test de pectina.
Prof. E. Marino Olivares de la Cruz
V. RESULTADOS
Esquematice y/o incluya una fotografía del vaso 1 (Test de pectina) y cualquiera de los vasos 2 y
3 (Extracción de ADN).

(1) Test de pectina (2 o 3) Extracción de ADN

Interpretación:

 Test de pectina:
 (2 o 3) Extracción de pectina
VI. CONCLUSIONES

VII. CUESTIONARIO
1. ¿El ADN presenta carga, de ser así, positiva o negativa? ¿Cuál será el rol del Na+ en el proceso
de extracción del ADN?
2. ¿A qué se debe que el etanol forme una capa en la superficie de la mezcla filtrado-etanol?
3. ¿Por qué razón(es) se debe extraer ADN en frío?
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS