Material elaborado por la Fundación Scient - Autorizado para uso académico en

el curso Biología Molecular, UPTC, Grupo 2 L-1 y L-2

Laboratorio de Biología Molecular – Ingeniería agronómica - UPTC, 2021-II

Guía de Laboratorio: EXTRACCION DE ÁCIDOS NUCLEICOS

1. OBJETIVOS

 Reconocer los pasos básicos de los protocolos de extracción de DNA

 Realizar una extracción de DNA con materiales caseros
 Realizar una extracción a partir de células epiteliales de frotis bucal

2. INTRODUCCION

El DNA o ácido desoxirribonucleótido, es la biomolécula que almacena la información genética de

todos los organismos vivos en el planeta (Griffith 1928; Avery., MacLeod., McCarty 1944 y
Hershey., Chase 1952). Este, está formado por 4 diferentes nucleótidos (Adenina {A}, Guanina
{G}, Citocina {C} y Timina {T}). Estos nucleótidos forman una doble hélice, antiparalela y
complementaria (Watson, Crick 1953). En todos los organismos la proporción de A/T, G/C y de
purinas/pirimidinas es 1:1, mientras la proporción A-T/G-C varia de una especie a otra (Elson.,
Chargaff 1952; Chargaff., Lipshitz., Green 1952 y Rudner., Karkas., Chargaff 1968).

El DNA se perpetua debido al proceso de replicación (Meselson, Stahl 1958). Este proceso es
fundamental para la vida en la tierra. Cada vez que una célula se va a dividir (durante la
reproducción sexual o asexual, durante la formación o reparación de tejidos), el DNA deber ser
copiado con precisión para mantener intacta la información genética. Sin embargo, este proceso no
está exento de errores. Durante la replicación pueden ocurrir cambios en la secuencia, que si no
son reparados generarán mutaciones en las siguientes generaciones. Así mismo, reacciones
espontaneas en el DNA (despurinización, desaminación) o exposición a fuentes de radiación
también pueden originar mutaciones. Estas, al contrario de ser consideradas como algo que debe
evitarse a toda costa, son fundamentales para la diversidad de las especies que viven y han vivido
en el planeta. Por lo tanto, debe existir un balance entre la mutación y la reparación del DNA. Altas
tasas de mutación pueden causar la extinción de las especies, mientras una reparación de todos los
errores del DNA que puedan llegar a ocurrir evitaría la diversidad biológica.

Esta propiedad de cambio en el DNA es fundamental para la adaptación de los organismos a los
cambios ambientes donde se desarrollan o viven. Las mutaciones, son la materia prima de la
evolución y estas se acomunan a medida que el tiempo trascurre (Kimura, 1983). Estos cambios en
el DNA dejan una huella en los seres vivos que permiten conectar sus historias evolutivas siendo
posible identificar que organismos que están más cercanos evolutivamente y cuales más distantes.

Todo el conocimiento sobre el DNA y de los diferentes procesos celulares que se ha acumulado
hasta el día de hoy, han permitido el desarrollo de una revolución científica, donde ahora es posible
identificar especies con tan solo secuenciar un fragmento del DNA, insertar genes en organismo
heterólogos que permiten la producción de proteínas recombinantes, modificar especies para
generar resistencia o mejorar sus propiedades nutricionales. Las técnicas de secuenciación han
permitido explorar con mayor detalle la diversidad de las poblaciones y entender diferentes
procesos genéticos y evolutivos. Por ejemplo, estas técnicas y este conocimiento sobre el DNA y

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su “primo” el RNA, han sido fundamentales para comprender el origen de las pandemias que han
ocurrido en los últimos años y que actualmente nos afecta (Andersen, et al 2020).

Para poder llevar a cabo las diferentes técnicas o procedimientos, y develar los secretos del DNA
(o RNA) es fundamenta aislarlo a partir de diferentes fuentes. Existen una gran cantidad de
protocolos, kits comerciales y equipos que nos permiten extraer el DNA. Para este laboratorio,
revisaremos los pasos principales de los protocolos de extracción y realizaremos una extracción de
ácidos nucleicos con elementos caseros.

3. PROCEDIMIENTO

3.1. Dia 1: Durante esta parte de la sesión se presentarán los siguientes videos:

 Cómo extraer ADN de una banana

(https://www.youtube.com/watch?v=6OEVrzN0nDs)
 Extracción de ADN de frutas: Banana, fresa y kiwi con materiales fáciles en casa
(https://www.youtube.com/watch?v=u0obMJ3fth0&t=80s)
 Extracción de ADN con material de cocina
(https://www.youtube.com/watch?v=CFlmYdJWvhw)

Estos videos, darán pautas para la extracción del DNA con materiales caseros.

3.1.1. Procedimiento extracción DNA a partir de fruta con materiales caseros

Materiales
 Sal de mesa (2 cucharadas por grupo)
 Bicarbonato (opcional) (2 cucharadas por grupo)
 Tomate o banano o fresa (1/4 de la fruta de elección)
 Agua mineral (no agua del grifo, agua en bolsa, 100ml)
 Alcohol (antiséptico) frio (30 ml por grupo)
 Vasos transparentes (4 por grupo)
 Colador o servilleta de cocina (1 por grupo)
 Cucharas y tenedores (1 por grupo)
 Jabón líquido (preferiblemente de cocina, 4 cucharadas por grupo)
 Mortero

Preparación Buffers de lisis

 Buffer 1: En un frasco (vaso u otro recipiente) adicionar

 25ml de agua mineral
 1 cucharada de sal
 1 cucharada de bicarbonato (opcional)
Mezclar bien

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 Buffer 2: Es un frasco (vaso u otro recipiente) adicionar

 25ml de agua mineral
 1 cucharada de sal
 1 cucharada de bicarbonato (opcional)
 2-3 cucharadas de jabón líquido
Mezclar bien evitando que se forme espuma

Protocolo de extracción del DNA

1. A partir de la explicación realizada sobre la extracción de DNA al inicio de la sesión

proponga una hipótesis nula (H0) y una alterna (H1) de como funcionaran los dos Buffers
durante la extracción de DNA

H0 H1

2. Partir ¼ de tomate o banano (o una fresa completa) y con una cucharada de agua mineral
macerar la fruta hasta volverla papilla
3. Coloque 4 cucharadas del material biológico (papilla) en un nuevo recipiente y agregue
20ml del Buffer de lisis 1. Agite fuertemente por 3-5 min.
4. En un nuevo recipiente (vaso transparente), filtre la mezcla usando el colador y de ser
posible una servilleta de cocina. Filtre aproximadamente 5-10ml
5. A la solución filtrada (que llamaremos muestra) adiciónele suavemente y sobre las
paredes del vaso 3 volúmenes de alcohol bien frio (si uso 5ml de muestra, adicione 15ml
de alcohol)
6. De ser posible, deje el vaso en la nevera o un lugar bien frio hasta el otro día
7. Por inspección visual, revise la interfase entre la mezcla y el alcohol. Entre estas dos
debe visualizar una mota blanquecina. Registre los resultados utilizando fotografías.
8. Repita el mismo procedimiento ahora usando el Buffer de lisis 2

3.2. Día 2: Durante esta parte de la sesión se procederá a realizar la extracción del DNA
utilizando dos Buffer de lisis TE+ (Tris-EDTA-SDS) y TE- (Tris-EDTA).

Materiales
 Palitos de helado o Baja lenguas (1 por grupo)
 Embudos de vidrio (1 por grupo)
 Tubos cónicos (Falcon) de 15 mL (4 por grupo)
 Vasos plásticos (1 por grupo)
 Marcador permanente (1 por grupo)
 Vaso de precipitado (1 por grupo)
 Varillas de vidrio (2 por grupo)

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 Tubos Eppendorf de 1,5 ml (5 por grupo)

 Gradillas de microcentrífuga de espuma flotante (1)
 Gradillas de tubos Eppendorf (1)
 Gradillas de tubos Falcon de 15 ml (1)
 Pipetas Pasteur (2 por grupo)
 Micropipetas
 Puntas de micropipeta
Soluciones o reactivos
 Solución de NaCl al 1% (50 ml)
 Buffer de lisis I: TE con SDS (10 ml grupo)
 Buffer de lisis II: TE sin SDS (10 ml grupo)
 Proteinasa K (40 µL)
 NaCl 2,5 M (500 µL por grupo)
 Isopropanol (o Etanol) 100% frio (5 mL por grupo)
 Agua libre de nucleasas (o agua autoclavada y filtrada) (200 µL por grupo)
Equipos
 Centrífuga de microcentrífuga Depende del tamaño del laboratorio
 Baño de agua (ajustado a 56 ° C) Depende del tamaño del laboratorio
 Vortex

Preparación Buffers de lisis

 Buffer TE+

Cálculos para preparar 100 ml de TE+ 1X (10 mM Tris, 1 mM EDTA, y 0.5% SDS)

Tris HCl: 0.121 g

EDTA: 0.29 g
SDS: 0.5 g

Agregue los gramos correspondientes de cada reactivo y disuélvalos en 50 ml de agua destilada.

Ajuste el pH a 8.0. complete a volumen con agua destilada

 Buffer TE-

Cálculos para preparar 100 ml de TE+ 1X (10 mM Tris y 1 mM EDTA)

Tris HCl: 0.121 g

EDTA: 0.29 g

Agregue los gramos correspondientes de cada reactivo y disuélvalos en 50 ml de agua destilada.

Ajuste el pH a 8.0. complete a volumen con agua destilada

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Protocolo de extracción del DNA

Este protocolo y experimento ha sido modificado de la actividad “DNA Isolation and Restriction
Enzyme Analysis” (JoVE).

1. A partir de la explicación realizada sobre la extracción de DNA al inicio de la sesión

proponga una hipótesis nula (H0) y una alterna (H1) de como funcionaran los dos Buffers
durante la extracción de DNA.

H0 H1

2. Con el palito de paleta (o el Baja lengua) raspe cuidadosamente el interior de las mejillas
durante por 1 minuto (min).
3. En el tubo Falcon coloque el embudo. Posteriormente, tome 10 ml de la solución salina
y realice un enjuague por 2 min para recuperar las células epiteliales. Escupa
cuidadosamente la solución en el embudo.
4. Marque dos tubos Eppendorf de 1.5 ml; el primero con su nombre y la palabra “+SDS”,
el segundo con su nombre y la palabra “-SDS”.
5. Agregue 1 ml de la solución salina que tiene en el Falcon de 15 ml a cada uno de los
Eppendorf marcados previamente.
6. Centrifugue los Eppendorfs por 1 min a 13.000 revoluciones por minuto (rpm).
7. Retire los tubos y descarte el sobrenadante sin eliminar el pellet celular.
8. En los tubos Eppendorfs con el pellet agregue nuevamente 1 ml de la solución salina
que tiene en el Falcon de 15 ml. Repita los pasos 6 y 7 hasta centrifugar toda la solución
salina del Falcon.
9. Retire los tubos y descarte el sobrenadante sin eliminar el pellet celular. Agregue 1 ml
del Buffer TE+ al Eppendorf marcado con la palabra “+SDS”. Resuspenda, con Vortex.
10. Agregue 1 ml del Buffer TE- al Eppendorf marcado con la palabra “-SDS”. Resuspenda,
con Vortex.
11. Agregue 10 µL de proteinasa K a cada tubo e incube a 56 ºC durante 10 min.
12. Agregue 100 µL de NaCl 2,5 M a cada tubo y homogenice con Vortex.
13. Marque dos tubos Falcon de 15 ml, el primero con su nombre y la palabra “+SDS” y el
segundo con su nombre y la palabra “-SDS”
14. Coloque el contenido de los tubos Eppendorfs en los Falcons correspondientes.
15. Con la pipeta Pasteur adicione lentamente 10 ml Isopropanol o Etanol frio sobre las
paredes de cada Falcon. Espere a que el DNA se precipite. Si es posible deje los Falcons
a 4ºC toda la noche.

Realice registros fotográficos de los resultados obtenidos.

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16. Con una varilla de vidrio, o con la micropipeta, recoja el DNA del tubo marcado con
“+SDS” colóquelo en un nuevo Eppendorf marcado con su nombre. Centrifugue por 1
min a 13.000 rpm.
17. Descarte el sobrenadante y déjelo secar completamente.
18. Adiciones 100 μl de agua libre de nucleasas y déjelo rehidratar a 65ºC por 1 hora.
Alternativamente, déjelo a 4ºC toda la noche.

4. Presentación de informe

Por grupo de trabajo o de manera individual, y usando los resultados del método casero y del
método usando los Buffers TE (recuerde tomar fotografías de los resultados), realice un informe
tipo artículo científico, el cual debe contener:

 Titulo
 Resumen
 Palabras clave
 Introducción
 Materiales y métodos
 Resultados y Discusión
 Conclusiones
 Referencias

4.1. Cuestionario

Al final del informe incluya como anexo las respuestas a las siguientes preguntas

4.2. ¿Qué es el Sodium Dodecyl Sulfate o SDS, para que sirve durante los protocolos de
extracciones de DNA y que similitud tendría con el jabón?

4.3. En el video, Extracción de ADN de frutas: Banana, fresa y kiwi con materiales fáciles
en casa (https://www.youtube.com/watch?v=u0obMJ3fth0&t=80s), la explicación
realizada entre el minuto 2:37 a 3:09 sobre el efecto del jabón podría ser parcialmente
correcta. Sin embargo, el jabón tiene otra función durante la extracción. ¿Cuál es?

4.4. En el video, Extracción de ADN de frutas: Banana, fresa y kiwi con materiales fáciles
en casa (https://www.youtube.com/watch?v=u0obMJ3fth0&t=80s), el comentario
realizado entre el minuto 10:40 a 10:53 tiene un error. ¿Cuál cree es ese error?

5. REFERENCIAS

Andersen, K. G., Rambaut, A., Lipkin, W. I., Holmes, E. C., & Garry, R. F. (2020). The
proximal origin of SARS-CoV-2. Nature medicine, 26(4), 450–452.
https://doi.org/10.1038/s41591-020-0820-9

Avery, O. T., Macleod, C. M., & McCarty, M. (1944). Studies on the chemical nature of the
substance inducing transformation of pneumococcal types: induction of transformation

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by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus type III. The Journal of
experimental medicine, 79(2), 137–158. https://doi.org/10.1084/jem.79.2.137

Chargaff, E., Lipshitz, R., & Green, C. (1952). Composition of the desoxypentose nucleic acids
of four genera of sea-urchin. The Journal of biological chemistry, 195(1), 155–160.

Elson D, Chargaff E (1952). On the deoxyribonucleic acid content of sea urchin gametes.
Experientia. 8 (4): 143–145.

Griffith F. (1928). The Significance of Pneumococcal Types. The Journal of hygiene, 27(2),
113–159. https://doi.org/10.1017/s0022172400031879

Hershey, A. D., & Chase, M. (1952). Independent functions of viral protein and nucleic acid
in growth of bacteriophage. The Journal of general physiology, 36(1), 39–56.
https://doi.org/10.1085/jgp.36.1.39

JoVE. DNA Isolation and Restriction Enzyme Analysis. In Science Education, Introductory
Biology. https://www.jove.com/science-education/10575/dna-isolation-and-restriction-
enzyme-analysis

Kimura, M. (1983). The Neutral Theory of Molecular Evolution. Cambridge: Cambridge

University Press. p. xi.

Meselson, M., & Stahl, F. W. (1958). THE REPLICATION OF DNA IN ESCHERICHIA COLI.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 44(7),
671–682. https://doi.org/10.1073/pnas.44.7.671

Rudner, R., Karkas, J. D., & Chargaff, E. (1968). Separation of B. subtilis DNA into
complementary strands. 3. Direct analysis. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America, 60(3), 921–922.
https://doi.org/10.1073/pnas.60.3.921

Watson, J. D., & Crick, F. H. (1953). Molecular structure of nucleic acids; a structure for
deoxyribose nucleic acid. Nature, 171(4356), 737–738. https://doi.org/10.1038/171737a0

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