UNIVERSIDAD POLITÉCNICA SALESIANA

CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA DE LOS RECURSOS NATURALES

INFORME DE LABORATORIO N.- 3

CURSO: Sexto “A” FECHA: 01/02/2015 CALIFICACIÓN:……………

ASIGNATURA: Biología Molecular

INTEGRANTES: Amaguaña Joselyn, Fonseca Ricardo, Herrera Mónica, López Ruth, Sánchez
Cristofer, Villegas Abigail.

TEMA: EXTRACCIÓN DE ARN EN MATERIAL VEGETAL

OBJETIVO GENERAL: Extraer ARN de frutos de mora.

OBJETIVO ESPECÍFICO:
• Extraer ácido ribonucleico (ARN) mediante un kit profesional.
• Determinar los componentes que tiene un kit profesional para extracción de ARN.
• Conocer la función de los diferentes reactivos utilizados en la extracción del ARN.
• Identificar las etapas y fundamentos indispensables para la extracción de ARN
• Adquirir conocimiento básico para el manejo y cuidado de ARN extraído

MARCO TEÓRICO

En los organismos celulares el ARN es la molécula encargada de dirigir la síntesis de proteínas,

pues aunque el ADN es el que contiene la información que determina la estructura de estas, no
puede actuar solo y se vale del ARN para traducir esta información y producir las proteínas
necesarias para el desarrollo y actividades de la célula. La mayor dificultad en la extracción del
ARN es evitar la contaminación con RNAsas, enzimas muy estables que no requieren cofactores
para su función. Por lo tanto, se deben tratar las soluciones y los materiales con Dietil-
pirocarbonato (DEPC), el cual inactiva las ribonucleasas por modificación covalente (Chomczynski,
1987).

La mayoría de protocolos para extracción de ARN están basados en el método descrito por
Chomezynski y Sacchi, el cual se basa en el aislamiento de este ácido nucleico empleando fenol-
cloroformo e isotiocianato de guanidina. Durante el procedimiento debe realizarse una etapa de
homogenización de la muestra con los reactivos que contengan la solución fenol-isotiocianato,
donde este último se encarga de conservar la integridad del ARN, mientras rompe las células y
disuelve sus componentes, la adición posterior de cloroformo separa la solución en fase acuosa y
orgánica, donde la primera de estas contiene el ARN, esta fase acuosa es posteriormente tratada
con isopropanol para recuperar por precipitación el ARN (Almonacid, 2008).

Esta técnica permite obtener ARN a partir de pequeñas cantidades de tejido y células en cultivo o
suspensión de origen humano, vegetal, animal o bacteriano. Así mismo el ARN obtenido si se
realiza el procedimiento con precaución está libre de contaminación con ADN, proteínas y
finalmente puede ser utilizado en diferentes procedimientos como Northern blot, Dot blot,
Transcripción reversa, ensayos de protección de RNAsas PCR y clonaje molecular. Las RNAsas
(enzimas que rompen ARN) pueden ser introducidas accidentalmente durante el procedimiento de
manipulación del ARN para obtener la segunda cadena o cadena complementaria (Revista Nature,
2009).

RECURSOS UTILIZADOS

Materiales Reactivos Equipos

Vaso de precipitación con cloro para desechos Kit de extracción de ARN Vórtex
Tubos eppendor de 1.5 ml auto clavados Aspersor con etanol 70% Microcentrifuga
Caja de puntas para micropipetas pequeñas, Agua destilada Cámara de flujo
medianas y grandes.
Micro pipetas 0,5-10, 10- 100 ul Etanol absoluto Congeladora
Marcador para vidrio Mercaptoetanol
Carrusel para micro pipetas
Papel Aluminio

PROCEDIMIENTO

1. Realizar una maceración en morteros de la muestra con nitrógeno líquido, hasta obtener
una masa homogénea.
2. Agregar 250mg de la muestra macerada en un tubo Eppendorf de 1.5ml.
3. En un tubo falcon preparar la solución del Buffer de Lysis que debe contener 1% de 2-
mercaptoetanol por cada procedimiento de purificación, para el cual se adiciona 10μl de
2-mercaptoetanol por cada 1ml de Buffer de Lysis.
4. Se adiciona 1ml de Buffer de Lysis en el tubo Eppendorf que contiene la muestra
macerada.
5. Llevar la preparación al vórtex durante un minuto para realizar una homogenización.
6. Para sedimentar la muestra llevamos a la centrifuga por 2min a 12000 x g.
7. Pasar 1ml del sobrenadante a un tubo Eppendorf nuevo y colocar 500ml de etanol al 70%.
8. Llevar el tubo al vórtex durante un minuto para realizar una homogenización.
9. Pasar 700μl a un tubo de columna y llevar a la centrifuga por 15s a 12000 x g.
10. Descartar el líquido y se repite este procedimiento por duplicado.
11. Se adiciona 700μl de Wash Buffer I y llevar a la centrifuga por 15s a 12000 x g.
12. Descartar el líquido.
13. Se adiciona 500μl de Wash Buffer II y se lleva a la centrifuga por 15s a 12000 x g este
procedimiento se realiza por duplicado.
14. Descartar el líquido y se lleva el mismo tubo de columna a la centrifuga por 2min a 12000 x
g.
15. La columna se coloca en un tubo de recuperación.
16. Se adicionan 50μl de Agua libre de ARNasas y se lleva a la centrifuga por 2min a 12000 x g.
17. Adicionar 1μl del protector inhibidor de ARNasas (Roche).
 18. Conservar la muestra a -20ºC hasta realizar la transcripción, que debería ser realizada el
mismo día. Si no es así se puede congelar la muestra a -80 por un par de días.

RESULTADOS

En esta práctica de laboratorio se logró identificar la metodología necesaria para la extracción de

ARN, además se conoció la función de los reactivos utilizados para la extracción de ARN, como son
el dietil-pirocarbonato que inactiva las ribonucleasas, el fenol – isotiocianato que conserva la
integridad del ARN, el cloroformo que separa la fase acuosa de la orgánica y el isopropanol que
permite la recuperación por precipitación del ARN (Zabala J, 2009).

Al utilizar este protocolo para la extracción del ARN se logró obtener ARN purificado, la clave para
esto radica en evitar la degradación por la acción de las ribonucleasas; la mayoría de los
protocolos existentes se basan en la rápida inactivación de estas enzimas. Las metodologías para
la purificación del ARN sugieren realizar rutinariamente electroforesis para comprobar la calidad
de los ácidos nucleicos (Puerta B, 2011).

Figura 1. Maceración de la muestra con Figura 2. Se agregó 250 mg de la muestra

nitrógeno líquido. macerada en un tubo Eppendorf de 1.5ml
Fuente: El autor. Fuente: El autor.

Figura 3. Se adicionó 1ml de Buffer de Lysis Figura 4. Se llevó a la centrífuga por 2 min a
en el tubo Eppendorf que contiene la 12000 x g para sedimentar la muestra.
muestra Macerada. Fuente: El autor.
Fuente: El autor.
 Figura 5. Se descartó el líquido y se llevó el mismo tubo de columna a la
centrifuga por 2min a 12000 x g, y la columna se colocó en un tubo de
recuperación. Finalmente, se adicionó 1μl del protector inhibidor de
ARNasas (Roche), para su posterior conservación.
Fuente: El autor.

DISCUSIÓN

Las moras son fuente de sales minerales y vitaminas, constituyendo así un importante aporte
nutricional que podría incluirse en cualquier tipo de dieta. Las concentraciones varían
dependiendo de uno u otro género y especie. Las moras también contienen alta cantidad
de antocianos y carotenoides, asociados en diversos estudios a ciertas propiedades consideradas
beneficiosas para el organismo. (Liegeois, 2012)

Para la extracción de ARN se deben tomarse las máximas precauciones para evitar
contaminaciones con RNasas y la degradación del RNA (Zabala, 2005). Es importante trabajar en
un ambiente libre de RNasas, y debe tratarse todo el material para su eliminación. Deben usarse
guantes a lo largo de todo el proceso.

Intentar trabajar lo más rápido posible, con el fin de evitar la degradación del RNA durante la
manipulación. Con el fin de obtener los mejores rendimientos, se usó muestras frescas como
material de partida. Utilizamos nitrógeno líquido para mantener la muestra de ARN como
menciona (Luque, 2001), es importante utilizar RNA purificado recientemente. El almacenamiento
del RNA a -70 ºC evita su degradación. La extracción de ADN es una técnica que se debe realizar
con mucho cuidado ya que el ARN se desnaturaliza fácilmente. (Jiménez, 2003)

CONCLUSIONES

• El ARN de mora fue extraído con éxito gracias al kit profesional de bilogía molecular que
permitió el aislamiento del ARN de mora libre de cualquier contaminación de ADN.
Además, el protector inhibidor de RNasa ayudó a eliminar cualquier residuo extra, y tener
un ARN más puro. De esta manera se adquirió ARN concentrado de alta calidad.
• El Buffer de Lysis, sirvió como una solución para romperá la membrana celular y permitir la
salida del material intracelular de las células de mora preservando su estructura. Por otro
lado, el mercaptoetanol actuó como un antioxidante y estabilizador de enzimas. Además
los Wash Buffer eliminaron todos los rastros de proteínas y sales que pueda contener el
ARN, para de esta manera alcanzar una mayor cantidad de ARN purificado.
RECOMENDACIONES

• Como ya es de nuestro conocimiento, pero cabe recalcar es el uso de la vestimenta

adecuada, como son guantes, cofia, mascarillas y mandil, ya que siempre se trabaja con
reactivos químicos que pueden perjudicar nuestra salud, como es el caso del
mercaptoetanol que se lo considera como un veneno severo que causa irritación en vías
nasales, vómitos al ser ingerido, y absorción potencialmente fatal al entrar en contacto
con la piel.
• También se pude realizar todo el protocolo de la práctica en una cámara de flujo laminar,
que minimice la contaminación y nos permita adquirir resultados más óptimos. Lo ideal
sería trabajar en una cámara de flujo laminar solo para protocolos de ADN y otra solo para
los de ARN, para reducir las impurezas de nuestro material deseado.

CUESTIONARIO

1. QUE TIPO DE ARN EXTRAGIMOS?

La muestra utilizada fue la mora, siendo la mora un tejido vegetal el ARN extraido es de origen
vegetal; para la transcripción inversa específicamente el tipo de ARN que se necesita extraer es el
ARNm, ya que este lleva o posee la información sobre la secuencia de aminoácidos para la
formación de proteínas.

2. DIFERENCIAS ENTRE EXTRACCION DE : ARN, ADN Y PROTEINAS

MUESTRA DIFERENCIAS
• Para la extracción de ADN, se utilizan procesos un poco más simples,
claro está que siempre se trabaja utilizando protocolos en el cual la
contaminación tiene que ser demasiado baja o casi inexistente, pero
ADN en comparación con el ARN en el cual hay que tomar medidas con la
utilización de reactivos para evitar la contaminación y así su
degradación ya que el trabajo con ARN es mucho más delicado y
sensible
• Intentar trabajar lo más rápido posible, con el fin de evitar la
degradación del RNA durante la manipulación y así obtener una
muestra con un nivel de pureza óptimo para su estudio
• A la hora de trabajar con RNA, deben tomarse las máximas
ARN precauciones para evitar contaminaciones con RNasas y la
degradación del RNA. Es importante trabajar en un ambiente libre
de RNasas, y debe tratarse todo el material para su eliminación.
Deben usarse guantes a lo largo de todo el proceso.
• Se recomienda el uso de muestras frescas para la obtención del RNA
• La extracción de proteínas es un proceso mucho más simple que la
PROTEINAS
de ADN y ARN ya que en las células, las proteínas son las moléculas
 más abundantes
• en este tipo de extracción se siguen por lo general solo tres pasos
básicos que son, lisis para ruptura de membranas de la muestra,
separación de componentes moleculares y someter a la muestra a
tratamientos que permitan la separación de fracciones subcelulares,
estas basadas en propiedades tales como tamaño, carga, solubilidad,
precipitación; propiedades características de cada grupo de
proteínas; y por ultimo su extracción que y conservación

3. EL MERCAPTOETANOL QUE GENERA EN EL PROCESO?

Es mercaptoetanol o β-mercaptoetanol es un antioxidante utilizado por su capacidad para romper

enlaces disulfuro, por ejemplo en la desnaturalización de proteínas y de ribonucleasa (RNAsas)
En la extracción de ARN, el mercaptoetanol genera en el proceso la desnaturalización o ruptura de
RNAsas, enzimas que catalizan la hidrolisis del ARN en componentes más pequeños, es decir
propician la ruptura del ARN; por lo que es necesario que la muestra se encuentre libre de estas
enzimas

4. COMO SE PUEDE ANALIZAR LA EXPRESIÓN GÉNICA?

Los métodos Analíticos utilizados en la expresión génica se pueden utilizar para examinar niveles
de la expresión del mRNA o la expresión diferenciada del mRNA

• Técnicas que son inferiores a mediados de-plex

▪ Gen del Reportero

Un gen contiene dos segmentos funcionales. Uno es una serie de codificación de la DNA, que
contiene las instrucciones para hacer una proteína. La otra es una serie de la DNA llamada un
promotor, que se conecta a esta región de la codificación y regula la transcripción del gen,
activando o suprimiendo su expresión.

Un análisis del gen del reportero se utiliza para determinar el potencial regulador de una serie de
la DNA que sea desconocida. Esto implica una serie del promotor que es conectada a un gen
perceptible del reportero tal como luciferase, β-galactosidasa o β-glucuronidase. Los Ejemplos de
los métodos usados para determinar la proteína expresada del gen del reportero son
fluorescencia, absorción y luminiscencia.

▪ El borrar Septentrional

Esto es una técnica usada para detectar las moléculas específicas del ARN presentes dentro de una
mezcla del ARN. El borrar Septentrional se emplea en el análisis de una muestra del ARN de un
tipo o de un tejido de la célula para determinar la expresión del ARN de ciertos genes.

▪ El borrar Occidental
El borrar Occidental es una técnica para detectar las moléculas de proteína específicas dentro de
una mezcla de la proteína. Esta mezcla pudo incluir todas las proteínas que se asocian a un cierto
tipo o tejido de la célula. La técnica puede ayudar a determinar la talla de una proteína, y cuánto
de él se expresa.

▪ Hibridación in situ Fluorescente (FISH)

Ésta es una técnica citogenética que se puede utilizar para determinar y para localizar series
específicas del gen. Los PESCADOS pueden ser utilizados para visualizar aberraciones del número
de copia tales como la cancelacíon, el desplazamiento o la amplificación de cromosomas. La
técnica se utiliza en diagnosis prenatal y también proporciona a una herramienta útil en la
diagnosis y el pronóstico previsto de diversos sarcomas. La técnica también se utiliza en
dermatología para ayudar a evaluar espolones anormales.

▪ Reacción en cadena Reversa de polimerasa de la transcripción (RT-PCR)

Ésta es la técnica más sensible disponible para detectar y cuantificar el mRNA. Usando RT-PCR, los
tamaños de muestra extremadamente pequeños se pueden utilizar en la cuantificación del mRNA
y la técnica puede de hecho hacer esto usando apenas una célula.

• Técnicas que son un plex más alto

▪ Análisis Serial de la Expresión Génica (SABIO)

El SABIO es una técnica usada para crear una biblioteca de las etiquetas cortas de la serie que se
pueden cada uno utilizar para detectar una transcripción. El nivel de la expresión de la
transcripción puede ser determinado evaluando cuántas veces se detecta cada etiqueta. Esta
tecnología activa análisis completo de la expresión a través del genoma.

▪ Microarray de la DNA

También sabido como de biochip o de viruta de la DNA, un microarray de la DNA es una superficie
sólida a la cual una colección de manchas microscópicas de la DNA se asocia. Los microarrays se
utilizan para determinar niveles de la expresión a través de un gran número de genes o para
realizar genotyping a través de diversas regiones de un genoma.

▪ ARN Seq

Esto refiere a los métodos usados para medir la serie de las moléculas del ARN. Los Ejemplos
incluyen la secuencia de la escopeta de las moléculas del cDNA detectadas del ARN con la
transcripción reversa y tecnologías usadas para ordenar las moléculas del ARN de una muestra
biológica de modo que la serie y la abundancia primarias de cada molécula del ARN puedan ser
resueltas.

▪ Tejar matrices
Un arsenal del embaldosado es un tipo de viruta del microarray, con las metas etiqueta de la DNA
o del ARN cruzadas por hibridación a las antenas asociadas a una superficie sólida. Sin Embargo,
las antenas usadas difieren a ésas usadas con microarrays tradicionales. Bastante que las series
sabidas o los genes previstos que son sondados, tejando matrices sonde para las series sabidas
para estar presente en una región contigious. Esto puede proporcionar a la información sobre las
regiones se ordenan que pero para cuáles son en gran parte desconocidas las funciones locales.

BIBLIOGRAFIA

• ANÁLISIS DE EXPRESIÓN GÉNICA MEDIANTE PCR A TIEMPO REAL O Q-PCR. Consultado el

30 de enero del 2015 de
http://www.ehu.eus/SGIker/es/expresion_genica/documentos/analisis_de_expresion.pdf
• Almonacid, C Pinilla G. Introducción al análisis Bioquímico y a sus métodos de separación.
Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca. 2008
• Biologiamolecularinteractiva. Practica número 3 – Extracción de ARN. Consultado el 30 de
enero del 2015 de
https://biologiamolecularinteractiva.files.wordpress.com/2013/01/practica-no-3-
extraccion-de-arn.pdf
• Chomczynski P. and Sacchi. 1987. Anal Biochem. 162:156 - Chomczynski P. and Sacchi.
• Gonzales Pamela. Lugo Ana .Et all. Extracción de ADN, ARN y proteínas en el pasado y en el
presente. . Consultado el 30 de enero del 2015 de
http://es.slideshare.net/jhojanjralop/extraccion-de-adn-arn-y-proteinas
• Jiménez, G.L.F. Y Merchant, L.H. (2003). Biología celular y molecular. Person Educación.
México.
• Luque, J., y Herráez, Á. (2001). Texto ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería
Genética. Ed. Harcourt, Madrid.
• Liegeois, V. (2012). Los Zumos de Frutas y Hortalizas, una Alternativa para Comer Sano.
Parkstone International, Mexico.
• Microbial. La extracción y purificación del ADN para el análisis por PCR. Mitos y realidades.
. Consultado el 30 de enero del 2015 de http://www.microbial-
systems.com/web/docs/Newsletter_Microbial_03.pdf
• NewsMedical. Técnicas de la Expresión Génica. Consultado el 30 de enero del 2015 de
http://www.news-medical.net/health/Gene-Expression-Techniques-%28Spanish%29.aspx
• Revista Nature Protocolos Años 2009-2013
• Sgiker. Servicio general de Genómica-Unidad de Expresión Génica-Requisitos de las
muestras. Consultado el 30 de enero del 2015 de
http://www.ehu.eus/SGIker/es/expresion_genica/muestras.php#extraccion_RNA
• Universidad Nacional de Quilmes. Extracción y cuantificación de Proteínas. Consultado el
30 de enero del 2015 de https://ibcmunq.files.wordpress.com/2010/03/tp2.pdf
• Velasco Reinaldo. Marcadores Moleculares y la extracción de ADN. Consultado el 30 de
enero del 2015 de http://www.unicauca.edu.co/biotecnologia/ediciones/vol3/Art32.pdf
• Zabala, J. (2005). Conceptos básicos de biología molecular. Ed. UADY, Mexico.