PREPARACION DE MIX PCR:

VIRUS DENGUE Y SEROTIPOS

POBM301D-01
DENV-1-4 DEL CDC
ÁREA BIOLOGÍA MOLECULAR

SUB-AREA 3 PREPARACION DE MIX DE PCR

De utilidad para el diagnóstico y control epidemiológico de Dengue

1. OBJETIVO /
PROPÓSITO y serotipos DENV 1-4 CDC
Los resultados sirven para la detección y tipificación Dengue y sus
2. ALCANCE/ CAMPO
DE APLICACIÓN serotipos
Personal del laboratorio Bioquímico formado y calificado,
especialmente en técnicas de procedimientos de PCR en tiempo
3. RESPONSABLES
real.
Es una prueba de reacción en cadena de la polimerasa con
transcripción inversa (RT - PCR) en tiempo real con tecnología de
sonda fluorescente de PCR Monoplex y Multiplex y tecnología de
4. DEFINICIÓN
RT - PCR de un solo paso, para virus del dengue y sus serotipos.
en muestras de suero

5. DESARROLLO DEL
5.1. Fundamento:
PROCEDIMIENTO
El ensayo múltiplex CDC DENV-1-4 RT-PCR es una prueba de
ácido nucleico (NAT) para la detección y tipificación del virus del
dengue (DENV) en casos sospechosos y sintomáticos. Este
ensayo detecta los serotipos 1, 2, 3 o 4 del DENV a partir de suero
o plasma humano recolectado de pacientes humanos con signos y
síntomas compatibles con la infección por dengue. El ensayo está
diseñado para usarse como prueba de diagnóstico en pacientes.
El kit de ensayo múltiplex CDC DENV-1-4 rRT-PCR incluye:
Cebadores de oligonucleótidos y sondas de hidrólisis (Taqman®)
de doble marcaje para la detección cualitativa in vitro de los
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Bioq. Willma Miranda S. Bioq. María del Carmen Jorgin Bioq. Amalia Arancibia

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 serotipos 1, 2, 3 o 4 del virus del dengue a partir de suero o plasma
recolectado de pacientes humanos con signos y síntomas
compatibles con el dengue (leve o grave).
Mezcla de virus de control positivo, que consta de DENV-1 Haw,
DENV-2 NGC, DENV-3 H87 y DENV-4 H241 inactivados por calor.
El ensayo múltiplex de CDC DENV-1-4 rRT-PCR se puede ejecutar
en singleplex (cada serotipo de DENV se detecta en una reacción
separada) o en multiplex (los cuatro serotipos de DENV se
analizan en la misma reacción). Estos dos formatos proporcionan
la misma sensibilidad.
5.2. Bioseguridad:
Para la preparación de este Kit de PCR el personal debe usar la
siguiente indumentaria de bioseguridad:
-Guantes de nitrilo
-Mandil exclusivo para el área
-Barbijo KN95 o similar
-Gafas de protección
-Gorros
5.3. Muestra requerida:
Muestras:
 Suero.
5.4. Reactivos:
Listo para su preparación
RNasa P

COMPONENTES DENGUE
Agua libre de RNasa TOTAL
Buffer Invitrogen 2X
Primer RP-Forward
Primer RP- Reverse
Sonda
Enzima superscript RT/platinum III taq
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 DENGUE MULTIPLEX CDC

COMPONENTES
Agua libre de RNasa
Buffer Invitrogen 2X
Primer D1- Forward
Primer D1-Reverse
Primer D2- Forward
Primer D2-Reverse
Primer D3- Forward
Primer D3-Reverse
Primer D4- Forward
Primer D4-Reverse
Sonda (D1-4)
Enzima superscript RT/platinum III taq

5.5. Materiales:
 Micro cubetas, tiras de 8 o placas de pocillos de 0,1ul o
0,2ul
 Pipeta automática con capacidad de 10 ul
 Pipeta automática con capacidad de 200 ul
 Pipeta automática con capacidad de 1000 ul
 Tips con filtro de diferente volumen
 Gradillas para tubos ependorf de 1,5 ml o 2ml
 Ependorf libres de ARNasa, ADNasa

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  Minicooler.
5.6. EQUIPOS:
 Mini spin
 Vortex
 Cabina de PCR
5.7. Instrucciones detalladas:

Preparación de Master mix.

Tomar los diferentes reactivos llevar a la cabina de PCR

descongelar a temperatura ambiente. Realizar los cálculos
correspondientes según bitácora.

RNasa P

COMPONENTES CANTIDAD (Nº DE

TUBOS) ………
Agua libre de RNasa 5.5 ul
Buffer Invitrogen 2X 12.5 ul
Primer RP-Forward 0.5 ul
Primer RP- Reverse 0.5 ul
Sonda 0.5 ul
Enzima superscript RT/platinum III 0.5 ul
taq
TOTAL 20 ul

DENGUE TOTAL

COMPONENTES CANTIDAD (Nº DE

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 TUBOS) ………
Agua libre de RNasa 5.55 ul
Buffer Invitrogen 2X 12.5 ul
Primer forward 0.5 ul
Primer reverse 0.5 ul
Sonda 0.45 ul
Enzima superscript RT/platinum III 0.5 ul
taq
TOTAL 20 ul

DENGUE MULTIPLEX CDC

COMPONENTES CANTIDAD (Nº DE

TUBOS) ………
Agua libre de RNasa 2.2 ul
Buffer Invitrogen 2X 12.5 ul
Primer D1-forward 0.5 ul
Primer D1- reverse 0.5 ul
Primer D2-forward 0.25 ul
Primer D2- reverse 0.25 ul
Primer D3-forward 0.5 ul
Primer D3- reverse 0.5 ul
Primer D4-forward 0.25 ul
Primer D4- reverse 0.25 ul
Sonda (D1-4) 0.45 ul
Enzima superscript RT/platinum III 0.5 ul
taq
TOTAL 20 ul

• Trabajar bajo una cabina de PCR con todas las medidas de

bioseguridad
• Los primers, sondas, buffer, enzima deben descongelarse y
mantenerse en frío durante la preparación de la mix
• Las sondas fluorogénicas deben ser protegidas de la luz.
• Adicionar a los microtubos de 0,1; 0,2 o microplaca según
corresponda
• Cubrir con Parafilm y llevar a la subárea de Adición
• Eliminar los Tips, papel, tubos eppendorf a la bolsa de

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 residuos infecciosos.
• Desinfectar el interior de la cabina de PCR con etanol.
• Bajar la compuerta y llevar a UV por 15 minutos.
• Apagar la cabina de PCR.

- Registro de cálculo de registro

- Bitácora

6. y - Kardex Gasto de Reactivo (Código)

- Registro de Resultados

Manual de instrucciones
7. REFERENCIAS
Ver formulario:
8. ANEXOS Kardex Gasto de Reactivo
Ver Flujograma
Jefatura (Original)
9. LISTA DE
Responsable de Área (copia controlada).
DISTRIBUCIÓN
Operador técnico (copia controlada)

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