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Protocolo de tinción con Sirius Red para colágeno

John A. Kiernan
Departamento de Anatomía y Biología
Celular,
Universidad de Western Ontario,
LONDRES, Canadá N6A 5C1
Descripción: Es una de las técnicas mejor comprendidas de la histoquímica del colágeno. A continuación
se exponen los detalles técnicos, seguidos de algunos comentarios y algunas referencias. Conviene
familiarizarse con la teoría, las ventajas y las limitaciones de este método antes de utilizarlo a gran escala.
Método del rojo Picro-sirius (según Puchtler et al., 1973; Junqueira et al., 1979). El paso 4 es una adición
que evita la pérdida de colorante que se produce si las secciones teñidas se lavan en agua.

Fijación: La fijación no es crítica, El método se utiliza más frecuentemente en secciones de parafina de

objetos fijados adecuadamente (al menos 24 horas pero idealmente 1 o 2 semanas) en una solución de
formaldehído neutro tamponado.

Soluciones y reactivos:

Solución A. Rojo micro-sirio

Sirius red F3B (C.I. 35782)------------------------------ 0,5 g

Solución acuosa saturada de ------------------------ácido pícrico500 ml
Añadir un poco de ácido pícrico sólido para asegurar la saturación (Esto es importante). NOTA: Esta
sugerencia es peligrosa. Añada sólo la solución líquida. - Deb Martinson
(Se conserva al menos 3 años y puede utilizarse muchas veces)
(Sirius Red está disponible en Sigma-Aldrich bajo el nombre de "Direct Red 80", Catálogo # 36-554-8)

Solución B. Agua acidificada

Añadir 5 ml de ácido acético (glacial) a 1

litro de agua (del grifo o destilada).

Procedimiento:

1. Desparafinar e hidratar secciones de parafina.

2. (Opcional, y no se suele hacer) Teñir los núcleos con hematoxilina de Weigert (como para el
método van Gieson, pero más fuerte, y luego lavar los portaobjetos durante 10 minutos en agua
corriente del grifo).
3. Tinción en rojo picro-sirio (Solución A) durante una hora (Esto da una tinción cercana al equilibrio,
que no aumenta con tiempos más largos. No deben utilizarse tiempos más cortos, aunque los colores
tengan buen aspecto).
4. Lavar en dos cambios de agua acidificada (Solución B).
5. Elimine físicamente la mayor parte del agua de los portaobjetos agitándolos enérgicamente o
(sólo en el caso de algunos portaobjetos) secándolos con papel de filtro húmedo.
5. Deshidratar en tres cambios de etanol al 100%.
6. Aclarar en xileno y montar en un medio resinoso.

Resultados:

En la microscopía de campo claro, el colágeno es rojo sobre un fondo amarillo pálido. (Los núcleos, si se
tiñen, son idealmente negros, pero a menudo pueden ser grises o marrones. El largo tiempo en rojo picro-
sirius causa una apreciable decoloración de los núcleos. Esto no es un problema con el van Gieson
tradicional o con el azul de picro-anilina, con sus tiempos de tinción de 1 minuto).

Cuando se examinan a través de polares cruzados, las fibras de colágeno más grandes son de color
amarillo o naranja brillante, y las más finas, incluidas las fibras reticulares, son de color verde. Según
Junqueira et al. (1979) la birrefringencia es altamente específica para el colágeno. Algunos materiales,
como el colágeno de tipo 4 de las membranas basales, los gránulos de queratohialina y algunos tipos
de moco, se tiñen de rojo pero no son birrefringentes. Es necesario girar el portaobjetos p a r a ver
todas las fibras, ya que en cualquier orientación la birrefringencia de algunas fibras se extinguirá. Este
pequeño inconveniente puede evitarse equipando el microscopio para su uso con luz polarizada
circularmente en lugar de plana (Whittaker et al., 1994; Whittaker, 1995), pero entonces no se obtiene
un fondo completamente negro. (Buscar imágenes)
Comentarios y referencias:

Aunque este método es técnicamente muy sencillo, es importante que la persona que lo realiza y (si es
otra persona) la que utiliza los portaobjetos teñidos, sepan lo que hace y cómo funciona. Incluso sin un
microscopio polarizador, el rojo picro-sirio muestra cosas como las fibras reticulares y las láminas
basales de los capilares cerebrales, que van Gieson pasa por alto y que pueden quedar oscurecidas por
las masas de otros detalles teñidos en los métodos de tricrómico (Mallory, Masson, Heidenhain, etc.).

Por lo que yo sé, la mayoría de los usuarios del rojo picrosirio realizan investigaciones que explotan el
realce por el rojo sirio de la birrefringencia de las fibras de colágeno, que se debe en gran parte a las
moléculas coalineadas de colágeno de tipo I. También se utiliza para teñir el amiloide. También se utiliza
para teñir el amiloide.

Si sólo utiliza luz polarizada, no importa si pierde el "fondo amarillo" de la tinción con ácido pícrico. Si
utiliza rojo picro-sirio como un van Gieson "mejor" y desea conservar el citoplasma amarillo, apresúrese
con la deshidratación, incluso más que con el método van Gieson original.

Hace unos 4 años, alguien (lo siento, he olvidado quién, así que no puedo gritar su nombre) publicó en
HistoNet una excelente bibliografía de métodos de tinción con rojo sirio F3B. Esto debe ser encontrable
en los Archivos (www.histosearch.com)

Nadie debería hacer (u ordenar que se haga) una tinción con rojo picro-sirio sin haber leído al menos uno
de los dos primeros puntos que se enumeran a continuación.

1. Junqueira LCU, Bignolas G, Brentani RR. Picrosirius staining plus polarization microscopy, a specific
method for collagen detection in tissue sections. Histochem J 1979; 11, 447-455
2. Puchtler H, Waldrop FS, Valentine LS. Polarization microscopic studies of connective tissue stained
with picro-sirius red FBA. Beitr Path 1973; 150, 174-187
3. Whittaker P. Microscopía de luz polarizada en investigación biomédica. Microscopía y Análisis 1995;
44, 15- 17
4. Whittaker P, Kloner RA, Boughner DR, Pickering JG. Quantitative assessment of myocardial collagen
with picrosirius red staining and circularly polarized light. Investigación básica en cardiología 1994; 89,
397-410
5. Kiernan. J.A., (1999) Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice, Ed. 3 Butterworth
Heinemann, Oxford, Reino Unido.

Por último, es importante adquirir el colorante adecuado. El rojo sirio F3B es el C.I. 35782 (Direct red
80). Hay otros "rojo sirio" que son bastante diferentes. Al menos uno que yo he utilizado mucho está
bien, pero no lleva ninguna designación C.I. en la etiqueta. Con este tipo de tinte (un tetra-azo tinte
directo de algodón) el proceso de fabricación genera necesariamente más de un producto coloreado, y
se añaden otros compuestos para precipitar el tinte y ajustar su intensidad de color. Pruebe su rojo sirio
en secciones de músculo, cerebro y riñón antes de utilizarlo para investigación o diagnóstico. En un
riñón normal, las membranas basales glomerulares deben ser rojas pero no birrefringentes. Cada fibra
muscular debería estar rodeada de colágeno rojo y birrefringente. Podría continuar, pero esto ya es
demasiado largo.