Resumen: 1b

Histología: “Técnicas histológicas”

Temario:
1- Fundamentos de la técnica histológica
2- Técnicas histológicas para la MO
a. Obtención d. Inclusión h. Desparafinación e hidratación k. Montaje
b. Fijación e. Corte i. Coloración
c. Deshidratación f. j. Deshidratación
3- Procesamiento para muestras
4- Técnicas citoquímicas e histoquímicas
a. Metacromasia d. Sudán
b. Coloración Schiff e. Tricrómicos de Masson y Van Gieson
c. Feulgen f. Técnicas enzimáticas
5- Técnicas para tejido nervioso
a. Nissl
b. Impregnación argéntica: Cajal y Golgi f. Lucifer Yellow
c. Impregnación de oro sublimado de Cajal g. Proteína verde fluorescente
d. P/mielina: Weigert, tetróxido de osmio y kluver-barrera
e. Marcación retrógrada con peroxidasa
6- Técnicas inmunocitoquímicas
7- Radioautografía
8- Hibridización in situ

Desarrollo:

1- Fundamentos de la técnica histológica (conjunto de pasos que permiten la visualización de las células y
tejidos
al MO):
En caso de ser in vivo (fresco) el microscopio de contraste de fase permite verlos sin colorear agregándole soluciones
con sales para permitir la supervivencia. En células de cultivo se usa el microscopio de inversión equipado con
contraste de fase y una platina calefaccionada (36°c).
Para resaltar la luz se necesita una técnica histológica en los preparados. LA INCORPORACIÓN DE COLORANTES EN
TEJIDOS VIVOS SE LLAMA COLORACIÓN VITAL Y PUEDE REALIZARSE DE DOS MANERAS:
a) In vivo mediante la administración de colorantes a animales
b) In vitro mediante la administración de colorantes a células en cultivo o células vivas sobre un portaobjetos.
Otro tipo es post mortem con técnicas que conserven la composición y la estructura además de agregar diferentes
colores.

2- Técnicas histológicas para la MO:

a) Obtención de tejido/muestra: obtener un tejido mediante una biopsia (vivo), necropsia (post mortem)
previniendo el tiempo en el que se genera la autolisis (digestión propia lisosomal) mediante una rápida fijación. Las
muestras deben carecer de capsulas que impidan el ingreso del fijador y deben ser del tamaño de un cubo de 5mm
de lado para permitir la entrada del fijador hasta el centro.

B) Fijación: introducir la muestra en una relación de 10:1 con el fijador líquido (fijación por inmersión). El liquido
evita la autolisis frenando el metabolismo celular y preservando la estructura. La fijación por perfusión es para
órganos que se modifican antes de que el fijador de inmersión haga efecto. Esta consta de introducir el fijador en el
ventrículo izquierdo o la aorta abdominal para fijarlo antes de que muera. En caso de querer disecar parte del
sistema digestivo se inserta el fijador por perfusión en la cavidad peritoneal.
*Fundamentos de la fijación: preservar la estructura, ultraestructura y la composición química de las células o
tejidos. Impedir autólisis y evita la acción de gérmenes (putrefacción). Debe tener un pH cerca del neutro.
Osmolaridad similar a la del tejido que evite el colapso de estructuras. Debe penetrar hasta el centro de la muestra.
El fijador endurece la pieza y debe evaluarse si conviene.

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*Tipos de fijadores:
/Químicos:
Fijadores simples: más común en la MO mediante el formaldehído 4% P/V y en ME es el
glutaraldehído.
Su función se basa en que el grupo aldehído forma enlaces covalentes con grupos amino (-NH2) y carboxilo (-COOH)
de las proteínas creando puentes metilénicos entre ellas. El gluta es más energético debido a la presencia de dos
grupos aldehído en su composición. El formaldehído (formol) se lo debe diluir en agua 10 veces para alcanzar el
porcentaje 4 V/P. Las disoluciones se realizan con una solución buffer o amortiguadora de fosfato y a temperaturas
bajas que reduzcan la autólisis. Otros simples son el alcohol metílico (p/frotis celulares), bicloruro de mercurio
(buenas coloraciones nucleares), tetróxido de osmio (lípidos), bicromato de potasio y acido acético. El alcohol etílico
puede usarse, pero endurece mucho las piezas.
Fijadores complejos o mezclas fijadoras: en MO es mezcla de BOUIN (ácido píerico, formol y ácido
acético), liquido Zenker (bicromato, acético) y el líquido de Helly (bicromato, formol).
/Físicos:
El frio producido por la congelación a través de nitrógeno líquido o mezcla de hielo seco y acetona. Luego se
cortan los bloques usando criostato. La congelación no desnaturaliza las proteínas y sus propiedades reaparecen al
hidratarse junto con la autólisis. Por lo tanto, las secciones suelen posfijarse mediante inmersiones en formalina. La
congelación puede mantener en el tejido componentes químicos (que son extraídos en las técnicas normales),
también sirve para evitar alteraciones antígenas (por fijadores químicos y solventes orgánicos)
Está técnica se hace común en la inmunohistoquímica. Ofrece la posibilidad de preservar la función de las enzimas.

C) Deshidratación: dado que en el siguiente paso (inclusión) el tejido es embebido en parafina, un medio
hidrofóbico, es necesario deshidratar la muestra para que se adapte a este. Se logra mediante el pasaje en alcoholes
de graduación creciente. Luego se sumerge el tejido en un solvente orgánico (XILENO o tolueno) que desplaza al
alcohol y es afín a la parafina. Se lo conoce como ACLARACIÓN ya que el tejido es translucido y SE LLEVA A LOS
LÍPIDOS DE LA MEMBRANA.

D) Inclusión: se calienta la parafina para que no sea sólida. Se sumerge la muestra en parafina/xilol que luego de
otros pasajes la parafina liquida pura desplazara al xilol. Luego se pasa el líquido con la muestra a un bloque donde
se solidificará la parafina.

E) Corte:
*MICRÓTOMO corta los bloques con diferencia de micrones (5um para MO). Se coloca la muestra en un baño
termostático a 40° para que se estire y luego al portaobjeto gelatinado o pretratado con albúmina para luego dejarlo
secar a temp ambiente hasta que se fije a este.
Otros equipos para realizar cortes:
*Vibrátomo: secciones de 40 a 50 um de espesor de un tejido fijado o no, pero sin ser incluido en parafina. Se realiza
en una capsula con un buffer (solución amortiguadora) y frio. Los cortes flotan luego de ser realizados y por eso se
llama procedimiento de los cortes en flotación. Al no tener parafina la preservación antígena es mejor que la de
técnicas histológicas convencionales. Esto conviene en la inmunocitoquímica.
*Crióstato y el micrótomo de congelación: cortes de 16 a 20 um de espesor congelado o fijado + congelado. Al no
ser deshidratados son preservados para inmunoenzimáticas o inmunofluorescentes.

F) Desparafinación e hidratación: los colorantes son acuosos y no debe haber parafina para que actúen. Se sumerge
la muestra con xilol en una recipiente (coplin) que remueve la parafina. Luego se rehidratan en alcoholes de
graduación decreciente para luego pasar por agua destilada.

G) Coloración: por rutina se tiñen con HEMATOXILINA Y EOSINA. La Hematoxilina es un colorante natura y la eosina
es uno artificial derivado de la fluoresceína. Primero hematoxilina, luego agua o sust. Alcalina débil donde el color
cambia del rojo al azul. Luego en eosina que le da color rojo. Los fundamentos de ambas se basan en principios
químicos. Conceptos:
*Sust. Base: capaz de aceptar protones y quedar con cargas positivas.
*Sust. Ácida: capaz de liberar o ceder protones y quedar con carga negativa.
LOS HIDRATOS DE CARBONO TIENEN CARGA NEUTRA POR LO QUE NO SE COLOREAN

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En los tejidos hay sustancias anfóteras capaces de ser ácidos en bases o viceversa y para ello debemos saber el punto
isoeléctrico (pL). El pL es el pH del medio en el cual la sustancia anfótera se comporta tanto como ácido o como base.
Debajo de ese pH (pL) la sustancia será base captando protones, superior a ese pH (pL) será ácido liberando
protones.
Los ácidos nucleicos como proteínas son anfóteras. El Ac. Nucleico tiene un pL es bajo por lo que siempre tenderán a
liberar P+ y quedando negativos como ácidos por ionización de fosfatos, a diferencia de las proteínas que tienen un
pL próximo/superior al pH neutro y suelen comportarse como bases (carga positiva porque grupos amino aceptan
protones, carboxilo o sulfhídrilo los libera).
Los colorantes se clasifican en:
a) Básicos: hematoxilina. ACEPTAN PROTONES Y QUEDAN POSITIVOS, son catiónicos. Se unen a sustancias con
cargas negativas (ADN, ARN = AC. NUCLEICOS) Y RIBOSOMAS TMB POR ARNR EN EL RER. Si tienen afinidad se los
llama BASÓFILOS (color AZUL VIOLÁCEO). Eucromatina son basófilos leves y nucléolos o heterocromatina son
intensos basófilos. Un citoplasma con muchas actividad proteica (sistema de endomembranas + lisosomas) tendrá un
color basófilo, Ej: plasmocitos, páncreas, etc.
b) Ácidos: eosina. LIBERAN PROTONES Y QUEDAN NEGATIVOS. Se los denomina aniónicos y se unen a
sustancias
positivas en sus grupos AMINO (-NH2) DE LAS PROTEÍNAS por lo tanto el citoplasma tendrá un color rojizo, un color
ACIDÓFILO. Este color es mayor si la cantidad de MITOCONDRIAS citoplasmáticas crece (requieren alto nivel
energético) dado que sus membranas y matriz son ricas en proteínas. CITOESQUELETO

H) Deshidratación: antes del siguiente paso que es el montaje y se usa una sustancia hidrofóbica por lo que se pasa
la muestra por alcohol con graduación creciente y luego por xilol que remueve a este.

I) Montaje: se agrega una gota de bálsamo de Canadá (sust. Hidrofóbica) y luego se agrega una delgada lamina de
vidrio llamada cubreobjeto evitando la formación de burbujas de aire. Luego se solidifica y puede observarse.

3- Procesamiento para las muestras de MET:

A) Obtención: análoga a MO solo que las muestras para estudios de ultraestructuras deben tener un tamaño mas
pequeño, un cubo de 1/2mm por lado.
B) Fijación: se fijan con glutaraldehído que se diluye al 3% de V/V en soluciones buffer o amortiguadoras (fosfato o
cacodilato) y se posfijan en tetróxido de osmio que tiene gran afinidad por los lípidos y otorga contraste a las
membranas fosfolipídicas. Al igual que en MO los bloque se deshidratan con alcohol creciente y se los pasa a un
solvente orgánico (oxido de propileno).
C) Inclusión: en una resina epoxi de gran dureza. Tienen un color similar ambar miel. Una vez se seca, los tacos se
colocan en moldes de goma de gelatina con resina fresca donde se polimerizan en una estufa.
D) Corte: se utiliza un ultramicrótomo que da cortes de 1um de espesor hasta ultrafinos plateados de 70nm de
espesor. Esta maquina tiene gran precisión mediante navajas de diamante. Las muestras se colocan sobre una malla
fina de cobre que remplaza el portaobjeto de vidrio en la MO.
E) Contraste-coloración: las secciones se colorean apoyando las grillas sobre gotas de acetato de uranilo y citrato de
plomo (metales pesados) que se depositan en estructuras y aumentan su peso atómico que dispersan los electrones
de MET. Cuando secan ya se pueden observar.

4- Técnicas citoquímicas e histoquímicas: (conjunto de técnicas que permiten identificar y localizar de forma
específica componentes químicos de las células y los tejidos)
A) Metacromasia: propiedad del tejido de cambiar el color del colorante usado. Se da con colorantes catiónicos que
aportaran color azul. Reaccionan con GAGS y proteoglicanos. La distancia de los grupos aniónicos. Cambian de color
modificando la longitud de onda de azul a rojo. No es una técnica histoquímica, pero se puede manipular con
enzimas que degraden moléculas metacromáticas.

B) Coloración con el reactivo de Schiff: es una fucsina básica que decolora la presencia de ácido sulfuroso. En
contacto con el aldehído toma color magenta. Permite la identificación de aldehídos libres y la reacción se conoce
como TECNICA PLASMAL o PAS. Este reactivo de usa en coloración de PAS para identificar GLÚCIDOS (HIDRATOS DE
CARBONO) de todo tipo (EJ: GLUCÓGENO Y GLUCOPROTEÍNAS, GLUCOCALIS, MEMBRANA BASAL, CÉLULAS
CALCIFORMES, ETC) QUE SE VERÁN MAGENTA. Se produce creando grupos aldehídos en los glúcidos que luego de
incuban en el reactivo Schiff. PUEDE ASOCIARSE Y SER HYE CON PAS LA TÉCNICA. PRINCIPIO QUÍMICO QUE ROMPE
LA ESTRUCTURA DE LAS HEXOSAS. LA MEMBRANA BASAL ES PEQUEÑA Y POR EL PODER RESOLUTIVO NO SE
APRECIA TAN BIEN.

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C) Coloración de Feulgen: permite la DEMOSTRACIÓN DE ADN en el núcleo de las células. Tiñe núcleos de color
MAGENTA durante INTERFASE Y CROMOSOMAS EN LA CÉLULA EN DIVISIÓN. Se hace hidrolizando el tejido con
ACIDO CLORHÍDRICO (HCL) QUE EXTRAE ARN Y BASES PÚRICAS, LUEGO ABRE LOS ANILLOS DE DESOXIRRIBOSAS Y
ORIGINA GRUPOS ALDEHÍDOS QUE SE TRATAN CON SCHIFF.

D) Coloración de Sudán: demostración de lípidos (triglicéridos, colesterol, fosfolípidos y todo tipo de esteroides) en
los tejidos. Los sudanes son más solubles en los LÍPIDOS que en los solventes y por ello tienden a unirse al tejido. En
la fijación se usan fijadores especiales (de lípidos) o hacer cortes por congelación. ESTOS LÍPIDOS SE PIERDEN EN LA
ACLARACIÓN Y SE MODIFICA LA FIJACIÓN, SE USA POR CONGELACIÓN ADEMÁS DE USAR OTROS COLORANTES
QUE NO SON HYE. COLOR MARRÓN. FUNDAMENTOS FÍSICOS, NO POR CARGAS. EN EL MEDIO SE MUEVE A DONDE
HAYA LÍPIDOS, COLORANTE LIPOSOLUBLE.

*DATO: ingresar tinta china negra de manera vital, por lo que los macrófagos la irán a atacar como un agente
extraño. Fagocita la tinta, no la puede enzimar y queda fija.

E) Tricrómico de Mallory: usa una fucsina ácida. Tiñe las fibras colágenas, reticulares, la matriz extracelular del
cartílago y el hueso de color azul. Citoplasmas, núcleos y músculos en diferentes rojos. Fibras elásticas y hematíes de
color amarillo.

F) Tricrómicos de Masson y Van Gieson: emplea hematoxilina y otros dos para teñir los nucléolos de azul,
citoplasmas rojos, fibras colágenas de celeste, glóbulos rojos y musculo de fucsia. VAN GIESON: Núcleos de marrón o
negro, fibras colágeno de rosado, citoplasma y musculo de amarillo.

G) Técnicas enzimáticas: visualizar la localización de enzimas en células y tejidos. Un proceso de fijación que
preserve la localización y la actividad de estas. PUEDEN EMPLEARSE CORTES POR CONGELACIÓN O EVALUAR AL
FORMALDEHIDO para cada caso. Para esta técnica se necesita que un SUSTRATO (REACTIVO DE CAPTURA, QUE
PUEDE SER UN METAL PESADO O UN COLORANTE) DE LA ENZIMA QUE PUEDA: PRECIPITAR O QUE TENGA COLOR
VISIBLE. LE DÁ ESPECIFICIDAD EL SUBSTRATO MODIFICADO DE FORMA QUE EL PRODUCTO DE COLOR. ESTA ES
UNA TÉCNICA HISTOQUÍMICA Y PUEDEN APRECIARSE:
*FOSFATASAS: RdeC es plomo o calcio que en segunda instancia reacciona con sulfuro de amonio dando color.
*NADPH DIAFORASA: basada en oxidorreducción. Cuando se fija en formaldehido la enzima NOS conserva actividad
reaccionando con NADPH. Para demostrar la presencia de NOS, se incuba el tejido con NADPH y el colorante NBT
que en última instancia se reduce por la enzima y precipita dando un color azul oscuro.

5- Técnicas clásicas para el estudio del sistema nervioso

A) NISSL: técnica de basofilia que emplea color en neuronas y células gliales. Los colorantes catiónicos se unen a
ácidos nucleicos.
Las neuronas muestran cromatina laxa, nucléolo prominente y basofilia citoplasmática debida a los cuerpos de Nissl,
áreas donde el RER y polirribosomas son muy afines por los colorantes catiónicos.
Las células gliales solamente muestras sus núcleos. Los astrocitos tienen núcleos ovales de cromatina laza; los
oligodendrocitos tienen núcleos ovales mas pequeños de cromatina densa, los microgliocitos poseen núcleos
alargados de cromatina densa.

B) Impregnación argéntica. MÉTODOS DE GOLGI Y CAJAL:

Emplean sales de plata que se reduce y precipita en las células del tejido. Son para el sistema nervioso, pero tmb
permiten teñir las fibras reticulares del tejido conectivo o mitocondrias.
La técnica Golgi tiñe de negro el 10% de las neuronas unciformes. A diferencia de Nissl estas tiñen el soma y todas las
prolongaciones neuronales (dentritas y axones).
La técnica Cajal el precipitado de la plata ocurre sobre los neurofilamentos que son filamentos intermedios de las
neuronas. Las neuronas se tiñen de color marrón. El soma y prolongaciones neuronales también se tiñen (Color?). El
núcleo no se tiñe y se visualiza como una imagen negativa amarillenta cuando el corte pasa por él.
CAJAL  PARTE EXTERNA MS IMPREGNADA. IMPREGNA LAS PROTEÍNAS DEL CITOESQUELETO DE AXONES DE
COLOR NEGRA HACIENDO LA SUSTANCIA BLANCA NEGRA. Y EL RESTO MARRÓN.

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C) Impregnación de oro sublimado de Cajal para astrocitos: el oro reducido se precipita sobre los paquetes de
gliofilamentos de los astrocitos. La técnica tiñe los astrocitos de color negro sobre un fondo violeta.

D) Técnicas para la mielina: Weigert, tetróxido de osmio y Klüver-Barrera:

W= TIÑE LA MIELINA (colorante sobre las lipoproteínas). Emplea hematoxilina y un mordiente que permite la tinción
de la mielina por la hematoxilina. Solo se tiñen las vainas de mielina de color negro/violeta.
T= sust. Lipofílica que se usa como fijador en la ME. Otorga color negro a los lípidos y tiñe las vainas de mielina.
K= combinación de basofilia con un colorante para la mielina. Usa un colorante básico y un colorante de mielina.
Tiñe neuronas con núcleo de cromatina laxa, nucléolo prominente y citoplasma basófilo; se observan lo núcleos
gliales y las prolongaciones mielínicas de las neuronas de color azul.
Fundamento: liposolubilidad.

E) Marcación retrógrada con peroxidasa: para vías de conexión del sistema nervioso. Granos de peroxidasa se
incorporan en los terminales neuronales por vesículas de endocitosis y son transportadas en forma retrograda al
soma neuronal a través de neurotúbulos utilizando dineínas. Su presencia se revela por reacción enzimática. La
forma de emplearlas en inyectándolas en la zona inervada y evaluando la reacción de la peroxidasa en el SNC.

F) Lucifer Yellow-intracelular filling: para evaluar funcionalmente el sistema nervioso y no morfológicamente

mediante la caracterización electrofisiológica de las neuronas. Se inyecta un colorante fluorescente amarillo previo a
tratar con electrodos la neurona, que se expandirá por el interior de la neurona y sus prolongaciones tiñendo de
amarillo. Técnica similar a Golgi.

G) Proteína verde fluorescente: (GFP) de origen animal (medusa) no es toxica para la célula y su gen se usa como
reportero acoplándolo a genes de estudio. Se usa microscopio de fluorescencia y no hace falta más pasos.

6- Técnicas inmunocitoquímicas:
PERMITE LOCALIZAR COMPONENTES QUÍMICOS MEDIANTE EL USO DE ANTICUERPOS ESPECÍFICOS. Podes
encontrar cualquier tipo de proteína y en cualquier localización celular gracias a la especificación de lo anticuerpos.
Para que se origine un anticuerpo la molécula debe ser heteróloga (extraña al organismo) y poseer un alto peso
molecular. Las moléculas pequeñas heterólogas (neurotransmisores) se les debe agregar peso molecular mediante
proteínas asociadas. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales. LA TÉCNICA SE DIVIDE EN
INMUNOENZIMÁTICA PARA LUEGO USAR LA TECNICA ENZIMATICA O INMUNOFLUORESCENCIA A TRAVÉS DE M.F .
También pueden ser directas marcando el anticuerpo con un colorante de cualquier tipo; o indirecta utilizando
anticuerpos secundarios (marcado con fluorocromo o enzima) que reconozcan al anticuerpo primario asociado al
antígeno. LA INDIRECTA DA MAS COLOR QUE LA DIRECTA.

A) Inmunoperoxidasa indirecta: las secciones de tejido se incuban con el anticuerpo primario (Ej: anticuerpo de
conejo contra X). Luego se incuban con un anticuerpo secundario (Ej: de cabra contra el de conejo) unido con
peroxidasa. La presencia se revela mediante el cultivo en DAB que es oxidado por la peroxidasa originando un
precipitado color marrón del citoplasma donde se encuentra la molécula que buscábamos.

B) Inmunofluorescencia: igual que arriba solo que se utiliza un microscopio de fluorescencia para detectar el
anticuerpo secundario marcado con fluorocromo verde.

C) Inmuno-oro e inmunoferritina: los anticuerpos secundarios son marcados con estas partículas que la ser
electrodensas son observables por el ME. Permite ver dos antígenos distintos dado el tamaño de particulas de oro
que utilices.

7- Radioautografía:
Permite estudiar dinámicamente preparados añadiéndole isotopos (Hidrógeno, azufre y fósforo) del tipo nucleótidos
o aminoácidos que harán un marca particular observable dada la precipitación de cristales de bromuro. Se inyecta en
el animal el componente radioactivo como timidina (precursor del ADN para evaluar mitosis) marcada con isótopo
de Hidrógeno. Luego se diseca el animal, se prepara el tejido como se debe y se analiza en ausencia de luz en una
placa radiográfica para determinar si hubo división celular o no (faraona). Específicamente en células se hace lo
mismo a escala mas pequeña y se colorean al final para la observación en microscopio.

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Otra función es la localización de receptores o sitios de unión de péptidos o neurotransmisores. Esto no solo será
cuantitativo sino calificará la unión del ligando al receptor mediante la densidad de la marca en un film posterior a la
fijación.

8- Hibridización in situ:
Permiten identificar ARNm y genes en cortes histológicos mediante sondas de ADN o ARN monocaternario, ADN bicaternario u
oligonucleótidos que se unen al ARNm por complementariedad de bases formando híbridos estables y específicos. La sonda debe estar
previamente marcada con fluorocromos o isótopos. Se requiere elevar la temperatura de la muestra para romper puentes de hidrógeno y
exponer sus bases a las sondas.