Tinte rojo picro-sirio, polarización y tejido colágeno

Vicki Kalscheur, HT(ASCP); Jessica Riehl, BA

Comparative Orthopaedic Research Laboratory
University of Wisconsin, School of Veterinary Medicine
Madison, WI
kalschev@svm.vetmed.wisc.edu

Hay un conocido Sirius Sunlight Glass Studio en Historic Mineral Point, WI, y Sirius es

una de las estrellas más brillantes del cielo nocturno. En nuestra especialidad de

histología, Sirius red F3BA es un colorante ácido complejo desarrollado en Alemania que

se puede adaptar para su uso en una técnica de tinción especial para demostrar el

colágeno, un componente del tejido conectivo.

El papel del tejido conectivo es, como su nombre lo indica, conectar las células dentro de

un tejido. También proporciona fuerza y soporte a órganos y tejidos musculares,

vasculares y nerviosos. El tejido conectivo está formado por células separadas por una

sustancia extracelular gelatinosa que se compone de sales, agua, proteínas y

carbohidratos. Es esta sustancia extracelular, que consiste en proteínas fibrilares

altamente organizadas (fibras proteicas), lo que nos interesa cuando empleamos tinciones

de tejido conectivo. Las fibras de tejido conectivo se pueden dividir en 3 tipos: colágeno,

elastina y fibras reticulares. De estos 3 tipos, el colágeno es la fibra dominante en la

mayoría de los tejidos conectivos. La función principal de las fibras de colágeno es

agregar resistencia mecánica al tejido conectivo. Esto se logra mediante el

empaquetamiento densa de las moléculas de colágeno.

Datos importantes sobre el tejido conectivo

• El tejido conectivo puede contener células fijas, como fibrocitos y células grasas,

que no pueden moverse libremente dentro del tejido, y células errantes, incluidos

macrófagos, linfocitos, mastocitos, eosinófilos y neutrófilos. Una célula

especializada, el fibroblasto, participa en la reparación del tejido después de que

se ha producido una lesión.

• El tejido conectivo suelto permite que los vasos sanguíneos lo atraviesen, lo que

ayuda en la nutrición de todos los tejidos.

• Los tendones y ligamentos se forman a partir de tejido conectivo denso

• Otros tejidos conectivos especializados incluyen adiposo, cartílago, hueso, sangre

y linfa.

Materiales y métodos

Sirius red (también conocido como rojo directo) F3BA es un colorante ácido que tiñe

selectivamente el colágeno y se puede usar para reemplazar la fucsina ácida en la

tinción de tejido conectivo de van Gieson. En la literatura científica, se puede

encontrar utilizado para teñir amiloide, membrana basal y retículo. Después de la

tinción con rojo picro-sirius (PSR), la clave es visualizarlo con microscopía de luz

polarizada, ya que la birrefringencia natural del colágeno aumenta en gran medida por

la unión de moléculas de fibra largas y alineadas teñidas con rojo sirius. Con luz

polarizada, la orientación de las fibrillas de colágeno muestra bandas anaranjadas /

rojas sobre un fondo oscuro.

Para ver todas las fibras con luz polarizada, el portaobjetos generalmente se gira en la

platina del microscopio para que se puedan visualizar todos los niveles; si se deja en

una sola orientación, se pueden perder áreas importantes. La rotación del portaobjetos

permite que la luz incidente se difunda a través del tejido, lo que permite que la

longitud de onda de emisión demuestre cambios en los componentes del tejido. Las

fibras de colágeno aparecen rojas cuando se observa el mismo portaobjetos con

microscopía de campo claro; otros elementos del tejido serán de un amarillo brillante.

Las diferentes combinaciones de filtros dan como resultado diferentes colores

polarizados; los investigadores experimentados seleccionan qué combinaciones son

óptimas para los resultados que esperan lograr.

El tipo y la organización del colágeno cambian a medida que el hueso se cura y

madura. Está muy organizado en hueso maduro, y menos durante el proceso de

cicatrización. En nuestro laboratorio de investigación musculoesquelética, utilizamos

PSR como colorante de tejido conectivo para el colágeno óseo (Tipo I), que tiene

fibras gruesas (tejido óseo) u osteoide, presente en las primeras etapas de la

cicatrización ósea. En fases posteriores, los componentes minerales, hidroxiapatita,

que consisten en iones de calcio, fosfato e hidroxilo (Tipo II, III) se depositan en la

matriz. Hemos encontrado que las propiedades birrefringentes de la tinción PSR son

útiles para tejidos dentales descalcificados, estudios de tendones, haces de colágeno

en la placa de crecimiento, tejidos de estudios de energía térmica y en aquellos con

anomalías oculares.
Tinción Picro-Sirius Red

Fijación: formalina tamponada neutra al 10%

Técnica: cortar secciones de parafina a 5 micrones

Soluciones:

Solución de Picro-sirius al 0,1%

Sirius red F3BA ……………………………………….… .. 1.0 g

Ácido pícrico saturado ……………………………….… 1000,0 mL

(Deje que la solución madure durante unos días)

Hematoxilina de Mayer

Cristales de hematoxilina …………………………………… .1.0 g

Agua destilada ……………………………………… ..1000.0 mL

Yodato de sodio ……………………………………………… 0.2 g

Alumbre de amonio o potasio ……………………. …… ..50.0 g

Ácido cítrico ……………………………………………… ..… 1.0 g

Hidrato de cloral ……………………………………….… ... 50,0 g

Disuelva el alumbre en agua. Agregue y disuelva los cristales de hematoxilina.

Agregue yodato, ácido cítrico e hidrato de cloral. Revuelva hasta que los componentes

estén en una solución completa. La mancha se mantiene bien durante meses.

Procedimiento de tinción

1. Agua corriente del grifo durante 15 minutos

2. Solución de picro-sirius al 0,1% durante 30 minutos

3. Lavar con agua

4. Hematoxilina de Mayer durante 15 minutos

5. Agua corriente del grifo durante 15 minutos

6. Deshidratar, cubreobjetos

Resultados

Microscopía óptica – Núcleos – Colágeno – Citoplasma - eritrocitos Amarillo - Negro

si se tiñe con hematoxilina de hierro Rojo

Microscopía polarizante

Grandes fibras de colágeno

Fibras de colágeno delgadas

Birrefringencia naranja o amarilla

Birrefringencia verde
La tinción PSR se usa ampliamente y es altamente interpretativa. Las imágenes de las

Figuras 2 y 3 son de tendón, teñidas con hematoxilina y eosina y muestran cómo la

microscopía óptica, mejorada con un filtro polarizado, puede mostrar más detalles.

Finalmente, en la Figura 4, vemos el tendón teñido con PSR y polarizado para mostrar

el mejor contraste de la fibra de colágeno en el tendón. Las Figuras 7 y 8 son de una

fisis canina de 3 semanas en la que el uso de la tinción PSR muestra haces de colágeno

teñidos en la placa de crecimiento. El tejido teñido con PSR con luz polarizada exhibe

un color que varía de verde a amarillo a través de rojo y tonos de naranja, dependiendo

de la reticulación del colágeno, y el colágeno más viejo y más grande está más

reticulado. La deposición de colágeno comienza como finas fibrillas que luego se

entrecruzan en fibras y haces más grandes. El patrón y el marco temporal de la

curación son de especial interés en estos estudios.

Los estudios de tejido conectivo que utilizan la tinción PSR se pueden realizar en

tejidos dentales, ortopédicos y de otro tipo que se hayan conservado suficientemente

antes del procesamiento. Fijamos nuestras muestras en formalina tamponada neutra

al 10% durante al menos 48 horas. Se prepararon y tiñeron secciones de cinco micras

según el procedimiento publicado por Sweat et al, 1964. Los portaobjetos teñidos se

examinaron con microscopía de campo claro. Los portaobjetos teñidos con PSR

también se examinaron usando microscopía de polarización con un analizador

ajustado a 60 ° con respecto al plano de la luz con una placa roja de primer orden

insertada en el analizador. Se evaluaron la morfología y los patrones de tinción, así

como la evidencia de birrefringencia. Otras tinciones de tejido conectivo que ofrecen

un buen contraste de colágeno son el tricrómico de Masson y el método del

pentacromo de Russell-Movat modificado. Ambos resultan en diferenciación de

fibras elásticas, colágeno, mucina y músculos.

La tinción inmunohistoquímica con anticuerpos contra colágeno III y colágeno I

puede proporcionar información adicional. Junto con la evaluación histológica de los

portaobjetos, las radiografías de detalles finos (Fig. 9A) ofrecen información

correlativa para la evaluación de anomalías tumorales o dentales en comparación con

los hallazgos microscópicos (Fig. 9B). Además, la Figura 9C y 9D muestran imágenes

de histología mandibular de hueso maduro anormal (naranja) con fibra elástica

(flechas verdes, blancas) bajo luz polarizada. El contraste ayuda a interpretar

anomalías dentales específicas.

Conclusión

Hay mucho que aprender al realizar evaluaciones de tejido conectivo para necesidades

patológicas y de investigación. La tinción PSR con microscopía polarizante puede

proporcionar información muy útil para el investigador y patólogo con respecto al

tipo y estructura del colágeno. La tinción PSR se puede utilizar en muchas áreas

relacionadas con el estudio de enfermedades del colágeno, y más. Tómese el tiempo

para mirar las estrellas, visitar las galerías y disfrutar de la belleza de Sirius,

cualquiera que sea su forma.