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NO. 4617 26 de U R 1199

abril de 1958NAT E
Los sistemas tratados de este modo mostrarían una reversión la ley de
inmediata. Lambert-Beer
(4) eleva la temperatura de envejecimiento, el aumento de la se obedece en
dureza es menor hasta que nodetectaun endurecimiento rápidoal el rango útil
envejecer a temperaturas de unos 45° C. o más. El de absorción.
envejecimiento a 100° C. durante periodos muy largos (unas 100 La
horas) produce una curva de endurecimiento muy similar a la absorción
encontrada en otros sistemas conocidos por endurecerse como óptica del a,a-
resultado de un proceso de precipitación. difenil-picril-
(5) Con solutos distintos del zinc (por ejemplo, cobre, plata, hidracilo es
silicio, etc.) no hay dificultad, con la ayuda del microscopio moderadament
electrónico, para seguir la precipitación que acompaña al e estable con
endurecimiento. En la facilidad de las aleaciones que contienen respecto a los
alrededor del 10% de zinc no se han detectado cambios cambios de
estructurales en las réplicas de óxido preparadas a partir de pH, excepto
00-2 0-4 0-6 0-8 1 0 1-2 1-4 1-0 1-8
muestras envejecidas hasta la máxima dureza a temperatura en las
Moles de clorhidrato de cisteína x 10"'
Fig. 1. Una curva de calibración típica que muestra la soluciones
N. GANE R. N. decoloración (a 517 m/p de una solución estándar de altamente
a,a-difenil-/S-picrilhidrazilo tras la adición de diversas
PARKINS cantidades de cisteína y la realización de un volumen alcalinas, pero
Departamento de Metalurgia, estándar se encuentra
King's College, que la absorción a 517 mg es independiente del pH desde 5-0
Universidad de Durham, hasta 6-5, y para obtener los mejores resultados encontramos
Newcastle upon Tyne 1. conveniente amortiguar las incógnitas (con tampones de acetato)
3 de febrero". en este rango.obtención de la estequiometría prevista se
1
Nishimura, H-, Mem. Coll. Eng. Kyoto Imp. Univ., 3, 133 (1924). demuestra mediante unacurva decalibración típica, la Fig. 1, para
* Perryman, E. C. W., y Blade, J. C,,J. Inst. Metals, 77, 203 (1950). la que se utilizó cisteína como donante de electrones.
* Geisler, A. H., Barrett, 0. S., y Mehl, It. F., Tram. Amer. Inst. Aunque el a,a-difenil-picrilhidrazilo se considera vagamente
Min. Met. Eng., 152, 201 (1943).
* Guinier, A., Mitaux, Corrosim, Usure, 18, 209 (1943). como un radical libre estable, sus soluciones se deterioran
ambiente. lentamente, y se considera conveniente almacenarlas bajo una
atmósfera de nitrógeno en un sistema que permite que el a, a -
difenil - (3 -picrilhidrazilo 1 sea aspirado en una bureta y
dispensado sin entrar previamente en contacto con el
Determinación de antioxidantes mediante aire.Además, la cristaleríadel sistema de almacenamiento está
el uso de un radical libre estable cubierta con papel de aluminio. En estas condiciones puede
Los MÉTODOS para medir los antioxidantes y valorarsu prepararse y almacenarse una solución patrón con una pérdida de
actividad parecen ser de dos tipos generales. Si se conoce la actividad de los radicales libres no superior al 2-4 por ciento por
naturaleza química del antioxidante, se puede intentar realizar semana.
una prueba específica para el compuesto o grupo de interés; por En su interacción con compuestos que tienen grupos
ejemplo, la prueba del nitroprusiato para los grupos reversiblemente oxidables, el a,a-difenil-(J-picrilhidrazilo da
sulfhidrilos.Otra posibilidades observar la inhibición de algún resultados consistentes con los mecanismos mostrados en la Fig.
proceso oxidativo natural, como la (3-oxidación de las grasas, en 2. Parece ser decolorado molécula por molécula por la cisteína y
función del antioxidante añadido. en la proporción de dos por uno por el ácido ascórbico. En este
Dado que una de las funciones más interesantes de los último caso es interesante que el intermedio radical libre del
antioxidantes, tanto desde el punto de vista biológico como ácido ascórbico sea lo suficientemente estable como para esperar
tecnológico, es su interacción con los radicales libres oxidativos, una posterior colisión productiva con una segunda molécula de a-
pareció interesante llevar a cabo su determinación en un maimer a,difenil-(3- picrilhidrazilo sin, por ejemplo, sufrir un
similar. Para ello hemos utilizado el radical libre estable1 a,<x-
difenil-(3-picrilhidrazilo, que suele estar disponible en los
laboratorios en los que se realizan experimentos de resonancia de
espín electrónico, debido al paramagnetismo que le confiere su
electrón impar. De su estructura se desprende que, si bien este
compuesto puede aceptar un electrón o un radical de hidrógeno
para convertirse en una molécula estable y diamagnética, sólo
puede oxidarse con dificultad y, además, de forma
irreversible.Debido a su electrón impar, a, a - d
ipheny 1 - (1 - picry I - hydrazyl muestra una fuerte (a) (DPPH)- + ii-SH ->■ (DPPH) : H + R-S- R-S- + R-S-R-
banda de absorción a 517 mg (en etanol), sus
soluciones aparecenun color violeta intenso.Cuando S-R
este electrón se empareja, la absorción desaparece y OH
OHo-OH
la decoloración resultante es estequiométricacon
respecto al número de electrones captados.La fuerte (6) (DPPH)- f H- 0=C-R' - (DPPH) : H + 7i- C=(J-R'
absorción es afortunada porque la solubilidad del a,a- O-
di-fonv b (3-pierilhidrazilo no es grande ; sin OHOO
embargo, las soluciones alcohólicas que tienen I I I||I!
concentracionesde aproximadamente 5 X 10~4 M (DPPH)- + R~C=C-R' - (DPPH) : H + R-Q-C-R'
son sin embargo densamente coloreadas.En parte, sin (c) (DPPH)- + HO-.R-OH - (DPPH): H -f HO-R-O-
duda, debido a esta baja concentración, (DPPH)- + HO-R-O- (DPPH) : H + 0=R=0
Fig. 2. Esquema de las reacciones entre el radical a,a-difenil-0-picrilhidrazyI y
varios grupos oxidables, (a) grupos sulfhidrilos interactuando en la proporción
de 1 :1; (6) oxidación del grupo conjugado del ácido ascórbico a la forma
deshidratada (2:1); (c) oxidación de una hidroquinona (2 :1)

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- ALEZA
dimerización que estropearía la estequiometría.El radical similar
del diacetilo está estérilmente menos obstaculizado y sufre una
condensación, pero el ácido ascórbico parece, dentro de los
límites de laobservación experimental, reaccionar sólo como se
muestra en la Fig. 2. En su reacción con la vitamina E, el a,a-
difenil-|3- picrilhidrazilo se reduce en la proporción de dos por
uno, lo que indica que la apertura del anillo lateral se produce en
el tocoferol bajo las condiciones experimentales. La reacción
posterior con el a,a- difenil-(3-picrilhidrazilo es esencialmente la
de la toco-ferilhidroquinona. Este mecanismo se está estudiando
actualmente y se comunicará por separado.Utilizado como
reactivo, el a,a-difenil-picrilhidrazilo ofrece evidentemente un
método cómodo y preciso para valorar los grupos oxidables
deantioxidantes naturales o sintéticos.(Agradezco a la Sra. Lina
Taskowich, que realizó muchas de estas mediciones, y a la
Institución Carnegie, Stanford, California, por el uso del equipo
espectrofotométrico).
ha comprobado que el a,ct-difenil-picrilhidrazilooxida (y es
decolorado por) la cisteína, el glutatión, el ácido ascórbico, el
tocoferol, los compuestos polihidroxi aromáticos (hidroquinona,
pirogalol, etc.) y las aminas aromáticas (p-fenilendiamina, p-
amino-fenol, etc.). Los grupos SH de las proteínas se oxidan,
aunque probablemente no cuantitativamente, ya que las proteínas
son precipitadas por el reactivo en las condiciones empleadas.No
tiene un potencial redox lo suficientemente alto como para oxidar
la glucosa, y aparentemente no oxida en condiciones ordinarias
las purinas, pirimidinaso compuestos aromáticos con un solo
grupo hidroxilo, como en la tirosina, por ejemplo. Por supuesto,
los iones inorgánicos en estados de valencia inferiores pueden
interferir y deben eliminarse o determinarse por separado.
Debido a que mide los antioxidantes naturales más comunes,
pero no es interferido por la glucosa, encontramos que el método
del a,oc-difenil] -(3 -picrilhidrazil es conveniente para el ensayo
de antioxidantes de materiales biológicos. Si el antioxidante se
encuentra a 10"5 molar o más, no es necesario concentrar la
muestra.
Esta investigación contó con la ayuda de una subvención de
la Sociedad Americana del Cáncer.
MAJRSDEN S. BLOIS
Laboratorio de Biofísica,
W. W. Hansen Laboratories of Physics,
Universidad de Stanford,
Stanford, California.
1 Goldschmidt, S., y Renn, K., Ghent. Ber., 55, 628 (1922). Poirier, R. H., bidimensional
Kahler, E. J., y Benington, F., J. Org. Ghent., 17, 1437 (1952).
Braude, E. A., Brook, A. G., y Linsfcead, It. P., J. Ghent. Soc. f 3574
(1954).
Blois, M. S., Biochim. Biophys. Acta, 18, 165 (1955).
Ácido gamma-amino-butírico en el
tejidoocular
LA existencia del ácido y-aminobutírico en el tejido cerebral
fue confirmada por Awapara1, y Roberts y Frankel2'*, y se ha
identificado como un principio activo en la sustancia inhibidora
que puede extraerse del cerebro de los mamíferos4Hasta ahora
no se ha establecidosu presencia en el tejido ocular. Sin embargo,
la retina puede considerarse anatómicamente como una parte del
cerebro, y desde este punto de vista se ha examinado la retina, la
coroides, el iris y el cuerpo ciliar para detectar la presencia de
ácido y-aminobutírico.
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26 de abril de VOL. 181
1958
En este estudio se aplicó el método de Sanger5 al
microanálisis cualitativo de mezclas de aminoácidos. El ácido
dinitrofenil y-aminobutírico se preparó mediante una forma
modificada del método de Koch y Weidel*. Se agitó 1 gm. de
ácido y-aminobutírico y un ligero exceso de l-fluoro-2 : 4-
dinitrobenceno con un agitador magnético a un pH de 9-0
(mantenido por un tampón de bicarbonato-carbonato de 1-0) y a
40° C. durante 80 min. El exceso de fluorodinitrobenceno se
extrajo con éter, la solución se acidificó con ácido clorhídrico 4
N y los derivados del dinitrofenol se extrajeron con acetato de
etilo y se condensaron.El dinitrofenol, que es un subproducto de
este proceso,sublimó a 40-50° C. en vacío durante 5 minutos. El
residuo tras la sublimación se disolvió en acetato de etilo a 40°
C., y tras la filtración y condensación de esta solución se repitió
la recristalización. Se obtuvieron cristales amarillos de ácido
dinitrofenil y-aminobutírico (punto de fusión 80° C.).
El ácido dinitrofenil y-aminobutírico mostró una única
mancha en el cromatograma del papel incluso con varios
disolventes (Tabla 1), y espectrofotométricamente - aliado
mostró Amax. 360mp frente a un blanco de agua.Además, la
posicióny-aminobutíricosintetizadoen un cromatograma
bidimensional no coincidía con la de los demás aminoácidos
dinitrofenil, sino que aparecía en la intersección de las dos líneas,
una de las cuales estaba entre el dinitrofenol y el ácido glutámico
y la otra entre la alanina y la glicina (Fig. 1).
Tabla 1. VALORES Rp o del ÁCIDO
DINITROFENIL
Y-AMINOBUTÍRICOCON VARIOS DISOLVENTES
Valor del disolventeRp
(1) n-
Butanol saturado de amoníaco0-40
(2) n-
Butanol: agua: etanol (4 :2 :1)0-90
(3) n-
Butanol: ácido acético: agua (4:1:5)0-95
(4)
Tampón fosfato 0-1 M0-66
Se extirpó la retina de un perro o de un buey, se trató con
alcohol absoluto y se calentó en agua hirviendo durante 5
minutos.Tras la coagulación, la muestra se homogeneizóy se
centrifugó a 3.000 r.p.m. durante 10 minutos, se lavó con alcohol
absoluto y se volvió a centrifugar. Del sobrenadante, que
contiene los aminoácidos libres presentes, se evaporó el alcohol
etílico a 50° C. a presión reducida; del residuo se extrajeron las
sustancias grasas con éter. El residuo se sometió a papel
Butanol/1 por ciento de amoníaco
---------------- >
DNP-OH
Ala
Asp ''
-+Glu
Fig. X. Cromatograma bidimensional de una mezcla sintética
de aminoácidos de dinitrofenilo, especialmente de ácido y-aminobutírico
(GAB) y sustancias afines