UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE QUÍMICA
BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL (0141)
Práctica 2. TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO II: TRANSFORMACIÓN
Elaborado por: Chagala García Gabriela. Grupo:04
RESUMEN:
La transformación es un proceso por el cual las células receptoras
competentes captan ADN exógeno que puede o no recombinarse con el
ADN bacteriano. En el laboratorio se induce el estado de competencia en
bacterias que no lo presentan de forma natural, mediante tratamientos
químicos o físicos. El siguiente experimento se realizó con el objetivo de
conocer el fundamento para transformar células bacterianas y aprender a
identificar células transformantes mediante su fenotipo. Se obtuvo una
eficiencia de transformación igual a 100.81 UFC transformantes/μg ADN
plasmídico, que se considera baja. Por lo tanto la eficiencia de
transformación en el laboratorio depende de que tanto se controlen las
variables que afectan directamente al experimento.
INTRODUCCIÓN:
La transformación es un proceso de transferencia horizontal de genes por
el cual el material genético es aceptado por una bacteria receptora y se
produce un cambio genético.
El origen del material genético es el ambiente externo, el ADN debe
encontrarse desnudo y al ser captado por la célula receptora el ADN
debe encontrar una zona de homología para llevar a cabo la
recombinación.
La capacidad de captar el ADN exógeno, conservarlo en forma estable e
interaccionar con él, se denomina competencia. Este fenómeno depende
de la presencia de un sistema de captación de ADN específico asociado
a la membrana que permite el procesamiento del ADN exógeno, el
sistema consiste en: una proteína de unión al ADN asociada a la
membrana, una autolisina de la pared celular y varias nucleasas.
Aunque la mayoría de las bacterias no presentan capacidad natural para
captar ADN, es posible inducir en el laboratorio la competencia por
distintas técnicas basadas en diversos tratamientos químicos o físicos
que producen microporos en la membrana celular, lo que permite la
introducción del ADN exógeno de manera eficiente; por ejemplo con
pulsos eléctricos (electroporación) o con cambios osmóticos y térmicos.
La electroporación es una técnica física que se utiliza para introducir ADN
en bacterias no competentes, las células se mezclan con ADN y se
exponen a breves pulsos eléctricos de alto voltaje, esto hace permeable a
la envoltura celular y permite la entrada de ADN plasmídico.
Las células tratadas mediante electroporación aceptan ADN de doble
cadena de modo que la transformación por ADN plasmídico es
relativamente eficiente.
Al realizar una transformación bacteriana por choque térmico, se permite
el aumento de la permeabilidad de la membrana bacteriana al ser
pretratadas con CaCl2, pues el Ca2+ recubre las cabezas polares de los
lípidos, lo que disminuye la repulsión de cargas eléctricas con los fosfatos
de los nucleótidos contenidos en el plásmido; facilitando la entrada del
plásmido al interior celular.
Una vez que se introduce el material genético a las células competentes,
se disminuye la temperatura y se enjuaga el calcio, con lo que se
restaura la permeabilidad de la membrana. Al colocar a las células en
condiciones óptimas de crecimiento se obtienen las células
transformantes.
El siguiente experimento se realizó con el objetivo de conocer el
fundamento para transformar células bacterianas, aprender a identificar
células transformantes mediante su fenotipo y conocer las aplicaciones
de la transformación bacteriana: beneficios y riesgos.
HIPÓTESIS:
Si las células competentes de E. coli introducen la información del vector
PET-TEM-1 y se expresa fenotípicamente entonces la bacteria tendrá la
capacidad de crecer en un medio que contiene kanamicina porque podrá
sintetizar enzimas que degradan el antibiótico.
METODOLOGÍA Y MATERIALES:
La metodología y materiales utilizados para el experimento se pueden
consultar en Colección de actividades de Bioquímica experimental
(0141), del Departamento de Bioquímica de la Facultad de Química,
UNAM.
RESULTADOS:
Figura 1. Caja Petri con las colonias obtenidas después del proceso
de transformación.
Se sembraron 100 μL de las bacterias transformadas en
Agar-LB-kanamicina, después de incubar a 37 °C por 24 horas se obtuvo
un crecimiento de 59 colonias.
Vol. de células competentes usado = 300 μL
Vol. sembrado en la placa = 100 μL
Vol. de plásmido añadido = 5 μL que contenía 8.94 µg de ADN plasmídico
Eficiencia de
59 𝑈𝐹𝐶 𝑡𝑟𝑎𝑛𝑠𝑓
la transformación= =100.81 UFC transf/μg plasmido
8.94 μ𝑔 𝐴𝐷𝑁 𝑝𝑙𝑎𝑠𝑚𝑖𝑑𝑖𝑐𝑜
ANÁLISIS DE RESULTADOS:
Al usar un método de choque térmico la eficiencia de la transformación,
dependerá del grado de competencia de las células utilizadas y del
tamaño del plásmido utilizado, siendo dicha eficiencia inversamente
proporcional al tamaño del mismo. Se espera que la eficiencia de
transformación con esta técnica sea entre un rango de 104-106 UFC
transformadas/μg ADN plasmídico, sin embargo en este caso se obtuvo
una eficiencia de transformación igual a 100.81 UFC transf/μg ADN
plasmídico que se considera baja.
Después del procedimiento es importante verificar que se obtuvieron
células transformantes para ello se utilizó un indicador para saber si el
procedimiento fue exitoso, en este caso el indicador fue la resistencia a
kanamicina.
En el vector pET-TEM-1 se insertó el gen que codifica para la
β-lactamasa en el sitio de clonación múltiple del vector pET24. El
transgene, ompA-βlac, contiene la secuencia completa de la proteína
TEM-1 β-lactamasa. Adicionalmente se colocó hacia la región 5’ del gen,
a la secuencia que codifica para la secuencia señal o de tránsito de una
proteína que se encuentra en la membrana externa de bacterias, en este
caso la ompA. A diferencia de la proteína OmpA, la β-lactamasa es una
enzima soluble, por lo que la secuencia señal permitirá que la bacteria
transformante secrete la enzima y por lo tanto se observó un desarrollo
de colonias bacterianas cuando se colocó la disolución transformante en
un medio que contenía kanamicina.
CONCLUSIONES:
La transformación en el laboratorio es una técnica rutinaria de gran
utilidad, que permite introducir plásmidos en su forma circular o
superenrollada en casi cualquier tipo de bacteria.
Es importante identificar a las células transformantes por su fenotipo pues
de esta manera se conocerá la eficiencia de transformación.
La eficiencia de transformación en el laboratorio depende de que tanto se
controlen las variables que afectan directamente al experimento, como
son la temperatura y la concentración de Ca2+, al igual que el tiempo
requerido para cada etapa del procedimiento.
Para mejorar la eficiencia de transformación se puede realizar una
dilución del volumen a sembrar.
BIBLIOGRAFÍA:
Sánchez S., (2020). Colección de actividades de Bioquímica experimental
(0141), del Departamento de Bioquímica de la Facultad de Química,
UNAM. Págs 50-52.
Temas de bacteriología y virología médica. Genética bacteriana.
Disponible en:
http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/GeneticaBacteriana.pdf consultado
el día 13 de Octubre de 2020 a las 10:26 h.