Cuaderno Microbiología, Lucía

CUADERNO
MICROBIOLOGÍA
I.E.S MARTÍNEZ URIBARRI
2º Laboratorio Clínico y Biomédico
Lucía Morales Martín
I.E.S MARTÍNEZ URIBARRI Lucía Morales Martín
Profesor: Enrique García Merino 2º Laboratorio Clínico y Biomédico
BLOQUE I: OBSERVACIÓN
MICROSCÓPICA
PRACTICA 1: OBSERVACION EN FRESCO
OBJETIVOS
✓ Identificar la presencia de bacterias en una muestra.

✓ Observar la morfología y estructura de las bacterias.
✓ Determinar la movilidad de las bacterias.
FUNDAMENTO
El fundamento de la observación en fresco de bacterias se basa en la visualización directa de las bacterias

vivas en una muestra sin ningún tipo de tinción o fijación. Al observar las bacterias en fresco, es posible
analizar su morfología, tamaño, movilidad y otras características estructurales.
Esto permite obtener información sobre la viabilidad y el estado de las bacterias, así como estudiar sus
interacciones y realizar recuentos en tiempo real. La observación en fresco también permite detectar
características específicas, como flagelos o cápsulas, que pueden ser importantes para la identificación y
clasificación de las bacterias.
MATERIAL
✓ Cultivo puro
✓ Muestras: yogur, agua con tierra, agua estancada...
✓ Portaobjetos
✓ Cubreobjetos
✓ Microscopio
✓ Aceite de inmersión
PROCEDIMIENTO
Directamente desde la muestra:
Se deposita una gota de muestra de agua con tierra sobre un portaobjetos marcado con el tipo demuestra
que es.
La muestra se cogerá de la zona donde es más probable encontrar microorganismos y se pondrá una gota
en el medio del portaobjetos, a continuación, se tapa la muestra con un cubreobjetos sin que se desborde
la muestra y procurando no dejar burbujas.
Observar al microscopio la muestra con el objetivo adecuado, que en este caso será el de 40x.
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PRACTICA 2: FROTIS
OBJETIVOS
Aprender a realizar una extensión o frotis sobre una porta por el método de fijación por calor para su
posterior tinción
MATERIAL
• Portaobjetos
• Asa de siembra
• Mechero Bunsen
• Solución salina.
• Cultivos puros: Estafilococos, Estreptococos, Micrococos, Klebsiellas, E. coli, Bacillus,
Corynebacterium.
PROCEDIMIENTO
Según el cultivo de partida:
A) Cultivos sólidos:
o Disponemos una pequeña gota de agua/solución salina en el portaobjetos.
o Cargar el asa de siembra con una pequeña cantidad de bacterias de una colonia del
cultivo
o Resuspender la carga de bacterias en la gota de agua utilizada. Realizar el frotis
B) Cultivos líquidos:
No necesita utilizar diluyente. Agitar el cultivo, se carga el asa bacteriológica con una gota de
cultivo y se deposita en un portaobjetos limpio realizando una extensión de la muestra hasta
conseguir una capa fina (frotis).
En ambos casos el último paso es la fijación, para ello dejamos secar la extensión a temperatura ambiente,
luego llevamos a cabo la fijación acercando la preparación a la llama del mechero evitando que se caliente
demasiado, se hace pasar la preparación 3-4 veces por la llama del mechero (la llama debe tocar la parte
inferior del portaobjetos). A partir de este momento la preparación estará lista para teñir y el
procedimiento a seguir depende del tipo de tinción.
PRECAUCIÓN: No excederse en la fijación, ya que el calor daña la pared celular de las bacterias y por lo
tanto se altera la forma, la agrupación y la reacción tintorial al gram.
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ACTIVIDADES
1. Explica qué ocurriría si preparásemos un frotis con una cantidad excesiva de microorganismo.
¿Y si la cantidad fuera demasiado escasa?
Si preparamos un frotis con una cantidad excesiva de

microorganismos, al momento de la visualización se formarían
manchas y no podríamos diferenciar correctamente el tipo de
microorganismo con el que estamos trabajando.
Si preparamos un frotis con una cantidad

demasiado escasa ocurría esto, no
sabríamos tampoco diferenciar con que
clase de organismo estamos trabajando.
En esta imagen se puede visualizar un
estreptococo, un estafilococo y un
diplococo
2. ¿Por qué es importante rotular los portaobjetos por el lado contrario a la cara donde se realiza
el extendido?
Para que la tinta del marcador permanente no interfiera en la tinción de las bacterias al realizar los lavados
o por ejemplo en la tinción de Gram cuando echamos la acetona
3. ¿Por qué es importante que el extendido quede en la cara superior del portaobjetos (orientado
hacia arriba) cuando lo secamos por calor?
Lo primero porque las proteínas de las bacterias precipitan en contacto con el calor y se quedan fijadas, si
lo hacemos al revés no estaríamos fijando la muestra ya que no precipitan correctamente o no donde
realmente queremos. Lo segundo es porque las bacterias al estar en contacto directo con calor en ese
caso con la llama del mechero Bunsen pueden llegar a desnaturalizarse y morir o quemarse, cambiando
así el color del frotis y perjudicando a la estructura de las bacterias y a la posterior tinción de ellas.
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PRACTICA 3: TINCIÓN AZUL DE METILENO

FUNDAMENTO
DETERMINACION DE BACTERIAS LÁCTICAS DEL YOGUR
El yogur es un producto lácteo producido por la fermentación natural de la leche. A escala industrial se
realiza la fermentación añadiendo a la leche dosis del 3-4% de una asociación de dos cepas bacterianas:
el Streptococcus termophilus, poco productor de ácido, pero muy aromático, y el Lactobacillus bulgaricus,
muy acidificante.
Estas transforman el azúcar de la leche (lactosa) en ácido láctico, generando una textura más espesa y un
sabor ácido y concentrado
OBJETIVO
Observar las bacterias lácticas encontradas comúnmente en el yogur aplicando técnicas de microscopía
óptica y de esterilización
MATERIAL
• Mechero de Bunsen
• Microscopio óptico
• Asa de Siembra
• Portaobjetos
• Pinza de madera
• Alcohol 96%
• Colorante: Azul de metileno 1%
• Agua destilada Bacterias (Yogur)
PROCEDIMIENTO
Poner una gota de agua Esterilizar el asa de siembra Tomar una muestra del yogur
destilada en el porta con
ayuda de una pipeta
Pasteur
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Añadir el inoculo Tomar el portaobjetos

sobre el agua destilada y con una pinza y proceder a su fijación
mezclar uniformemente sobre por calor con el mechero Bunsen
el porta objetos
Colocar el portaobjetos en el soporte de tinción y cubrir con azul de metileno por 3-5 minutos
Por útlimo dejar secar y observar en el microscopio
ACTIVIDADES
1. ¿Qué tipo de célula posee una bacteria?
La bacteria en sí es una célula procariota, es un organismo unicelular, cuyo material genético se encuentra
disperso en el citoplasma
2. Dibuja lo observado al microscopio con el objetivo de mayor aumento. ¿Qué formas tienen las
bacterias?
Se observan cocos y bacilos, en concreto estreptococos
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PRACTICA 4: TINCIÓN DE NIGROSINA

FUNDAMENTO
La tinción negativa con nigrosina es una tinción simple que usa un único colorante y que tiene como
finalidad visualizar el tamaño, morfología y tipo de agrupación celular.
La nigrosina es una sustancia oscura insoluble que tiñe el fondo de la preparación.
Los microorganismos se observan brillantes por el contraste sobre el fondo teñido.
OBJETIVOS
Poder visualizar bacterias con cápsulas, esporas o flagelos
MATERIAL
• Portaobjetos esmerilados
• Nigrosina
• Asa de siembra
• Muestra (E. coli)
PROCEDIMIENTO
1. Preparar el puesto de trabajo con los materiales necesarios. (Abrimos la llave del gas y
encendemos el mechero bunsen. Rotulamos el portaobjetos con la fecha y el microorganismo).
2. Colocamos dos gotas de nigrosina en un extremo del portaobjetos.
3. Tomamos una muestra de la bacteria que vamos a teñir y la mezclamos con la nigrosina
ayudándonos del asa de siembra y sin deformar la gota.
4. Realizar una extensión de la muestra con el portaobjetos esmerilado.
5. Fijar a la llama del mechero
6. Observar al microscopio.
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PRACTICA 5: TINCIÓN DE GRAM

FUNDAMENTO
Un Gram siempre se debe realizar a partir de cultivos que tengan 18-24 horas de incubación, pues de lo
contrario se pueden alterar las pruebas bioquímicas para la identificación de los mismos y obtener los
famosos Gram variables, esto es Gram de difícil interpretación ya que las células observadas a partir de
cultivos puros se verán grampositivas y gramnegativas al mismo tiempo y no se pueden reportar.
OBJETIVOS
• Aprender a confeccionar correctamente una extensión para su posterior tinción a partir de

cultivos puros o axénicos
• Conocer las diferentes morfologías y agrupaciones bacterianas su diferenciación en Gram
positivos o gramnegativas, según su capacidad para retener o no al cristal violeta
MATERIAL
• Portaobjetos con muestra fijada al calor

• Asa de siembra Cristalizador
• Puente de tinción
• Colorantes. Cristal-Violeta, Lugol y Safranina
• Solución de decoloración de Alcohol-Acetona
• Pinzas
• Cronómetro
• Microscopios.
• Solución salina.
• Aceite de inmersión.
• Muestra o Cultivos puros (Estafilococos, Estreptococos, Micrococos, klebsiellas, E. coli, Bacillus,
Corynebacterium.)
• Papel de filtro Mechero Bunsen
PROCEDIMIENTO
1. Sumergir el portaobjetos en cristal-violeta de genciana y mantener durante 1 minuto.

2. Lavar con agua y dejar escurrir
3. Sumergir en Lugol. Dejar actuar 1 minuto.
4. Lavar con agua y dejar escurrir
5. Decolorar con alcohol-acetona durante 10-15 segundos.
6. Sacarlo e inmediatamente sumergirlo en safranina para contrastar. Dejar actuar 45 seg - 1 minuto.
7. Lavar con agua y secar con papel de filtro.
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8. Seque a temperatura ambiente y visualice con objetivo de inmersión (100x), y con una gota de
aceite de inmersión.
9. Visualice la muestra y reporte la morfología, agrupación y la reacción tintorial al Gram
Se aprecian Estafilococos Gram + la mayoría, aunque también podemos observar Estreptococos

Gram – y Estafilococos Gram -
OBSERBVACIONES
En la primera tinción de todas empleamos una muestra faríngea y bucal, por lo tanto, a la hora de la
visualización no se veían apenas bacterias
ACTIVIDADES INVESTIGACIÓN
1. Los pasos que se deben realizar para confeccionar correctamente un frotis para colorear a partir
de: cultivos sólidos, cultivos líquidos y secreciones corporales.
Cultivos sólidos: poner una gota de agua destilada en el portaobjetos, cargar el asa de siembra
previamente esterilizada con el mechero Bunsen con una pequeña cantidad de bacterias de una colonia
del cultivo, resuspender la carga de bacterias en la gota de agua utilizada, extender en el portaobjetos y
seguir a su fijación
Cultivos líquidos: No necesita diluyente. Agitar el cultivo, cargar el asa de siembra con una gota de cultivo
y se deposita en un portaobjetos limpio realizando una extensión de la muestra hasta conseguir una capa
fina (frotis), seguir con la fijación
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Secreciones corporales: Coger una muestra se secreción con una torunda y directamente desde la torunda
realizar la extensión en el portaobjetos
2. Diga los pasos de la técnica de la coloración de Gram.

1- Fijar la muestra a un portaobjetos
2- Añadir cristal violeta y dejar actuar 1 minuto
3- Lavar con agua destilada
4- Añadir Lugol y dejar actuar 1 minuto
5- Lavar con agua destilada
6- Añadir alcohol o acetona y dejar actuar 15 segundos
7- Secar con papel de filtro
8- Inmediatamente echar Safranina y dejar actuar 45 segundos
9- Lavar con agua destilada y dejar secar
3. ¿Porque razón no debe sobrecalentarse el extendido en el proceso de su fijación?
Para evitar que la morfología de las bacterias varíe o se rompan
4. ¿Cuál es el paso más crítico en la coloración de Gram y por qué?
La aplicación de acetona para decolorar ya que si nos pasamos de tiempo la extensión podría decolorarse
por completo asi que al emplear posteriormente la safranina se vería todo rosa o rojo
5. Cuál es la morfología típica y la agrupación de las células bacterianas
La morfología típica son los cocos, bacilos, vibrios, espirilos y espiroquetas y las agrupaciones pueden ser
en racimo, en columna, empalizada.
6. Averigüe que bacterias no se tiñen con la coloración de Gram y porque
Las bacterias ácido-alcohol resistentes, debido a su alta concentración de lípidos en su pared celular lo
que impiden que retengan el colorante de Gram. Para estas bacterias se emplea la tinción de Ziehl-Neelsen
7. ¿Qué es una bacteria pleomórfica?
Es aquella bacteria que tiene la capacidad de variar en forma y tamaño durante su ciclo de vida
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PRACTICA 6: TINCIÓN DE ZIEHL NIELSEN

FUNDAMENTO
Para realizar un diagnóstico microbiológico siempre se debe trabajar con cultivos puros o axénicos. La
coloración de Ziehl Nielsen es utilizada en los laboratorios de microbiología para visualizar bacterias acido
alcohol resistentes (BAAR) como son el Mycobacterium tuberculosis y el Mycobacterium leprae, agentes
infecciosos causantes de la tuberculosis y de la lepra.
OBJETIVOS
• Realizar la coloración de Z. Nielsen, conocer la importancia de la misma en los laboratorios de

microbiología y los reportes estandarizados para dicha coloración
• Conocer que es un gramvariable y su importancia en los laboratorios de microbiología
MATERIALES Y REACTIVOS
• Esputos traídos por los estudiantes.

• Coloración de Z. Nielsen.
• Microscopios y aceite de inmersión.
• KOH al 3% Cultivos de Estafilococos y Klebsiellas.
• Escobillones o baja lenguas estériles.
• Laminas.
• Alcohol y algodón.
• Asas bacteriológicas.
PROCEDIMIENTO
1. Realizar una extensión sobre un porta a partir de la muestra proporcionada.

2. Deje secar a temperatura ambiente, fijar por medio de calor
3. Disponer los portas sobre una rejilla y proceder a colorear:
o Cubrir con abundante fuscina fenicada.
o Calentar con una torunda impregnada en alcohol por debajo del porta hasta que emita
vapores (aprox 5 minutos). No dejar hervir. Si se seca el colorante echar más colorante
a la preparación
o Lavar con abundante agua
o Cubrir con alcohol ácido (alcohol-clorhídrico al 3-5%), y dejar el tiempo necesario a
temperatura ambiente hasta que la lámina quede totalmente decolorada: transparente
(aprox 2 min)
o Lavar con agua
o Cubrir con azul de metileno durante 2 minutos
o Lavar con agua, escurrir y dejar secar a temperatura ambiente
o Observar con objetivo de inmersión (100x).
4. Las bacterias acido alcoholes resistentes (BAAR) se observan como bacilos muy pequeños de
color rojo.
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INVESTIGAR
1. Técnica de la coloración de Z. Nielsen su aplicabilidad y fundamento.

2. Cuál es la importancia de los Gram variables y cuáles serían las implicaciones al obtener un
Gram variable en el laboratorio de microbiología.
3. Como se le hace el control de calidad a la coloración de Z. Nielsen y el control de calidad para
verificar si su procedimiento quedo bien realizado.
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BLOQUE II: SIEMBRA

PRACTICA 7: PREPARACIÓN MEDIOS DE CULTIVO
OBJETIVOS
• Preparar medios de cultivo como soporte y fuente de nutrientes para el desarrollo de los
microorganismos in vitro.
• Comprender la importancia del control de calidad de la fase pre-analítica en la preparación de
medios de cultivo.
• Manejar los instrumentos de uso rutinario, a la vez que imprescindibles, en el laboratorio de
microbiología, especialmente el uso del autoclave.
• Hacer un primer acercamiento a la manipulación de microorganismos. Adquirir la idea de la
importancia del trabajo en condiciones de esterilidad y las técnicas más comunes para realizarlo.
• Papel de filtro
• Probeta Erlenmeyer.
• Embudo
• Piseta con agua destilada.
• Medios de cultivo deshidratados.
• Placas de Petry.
• Estufa.
• Balanza.
• Vidrio de reloj
• Espátulas.
• Mechero Bunsen
• Agitadores de vidrio.
• Algodón y gasa.
• Cinta indicadora autoclave.
• Autoclave.
PROCEDIMIENTO
1. LEER la etiqueta del medio de cultivo deshidratado. Hacer los cálculos para la cantidad de medio
de cultivo que se necesita preparar teniendo en cuenta el número de placas de Petri/tubos de
ensayo que se necesiten preparar. Cada placa (diámetro de 10 mm) debemos echar aprox. 20-25
ml de medio de cultivo obteniendo un espesor de unos 4 mm. Existen distribuidores automáticos
de medios sólidos en placas de Petri.
2. Pesar la cantidad calculada de medio de cultivo deshidratado y medir la cantidad de agua
destilada necesaria
3. Elaboración:
A. Se hará poco a poco. Verter un poco de agua y de medio en el frasco, homogeneizar y
repetimos el proceso hasta obtener la total disolución su total disolución.
B. Calentar el medio elaborado: solo medios que lleven agar agar en su composición (Leer
etiqueta). En Medios líquidos NO es necesario calentar, únicamente se agita la mezcla hasta
la completa disolución de esta. OJO: Usar guantes antitérmicos para evitar quemaduras.
En la placa calefactora: con agitación constante para disolver el agar y evitar que este se
pegue en el fondo del frasco.
En microondas: Calentar hasta que el medio sea transparente, hasta ebullición. agitar de vez
en cuando. PRECAUCION: Si calentamos mucho tiempo se puede desbordar el frasco al llegar
a ebullición, ya que su crecimiento aumenta rápidamente.
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C. Esterilizar la disolución en el autoclave: 15-20 minutos, a121º C y 1 atm de presión. Al

autoclavar poner un fragmento de cinta de autoclave.
Dependiendo de la forma en que vaya a utilizarse el medio, el procedimiento será diferente:
▪ Medios sólidos en placa: Tapar el matraz con tapón de algodón y cubrir con papel
de aluminio.
▪ Medios sólidos en tubo (agar inclinado): Una vez disuelto, repartir en tubos a razón
de unos 2-4 ml por tubo (la tercera parte del volumen del tubo), tapar con tapón de
aluminio
▪ Medios líquidos: Una vez disueltos los componentes repartir en tubos, tapar con el
tapón de aluminio correspondiente y autoclavar. Tambien pueden usarse otros
recipientes (tubos matraces o botes)
D. Distribución del medio de cultivo: tras finalizar la esterilización, sacar los frascos del
autoclave y dejar enfriar hasta una temperatura aprox de 50º C. Proceder a llenar las placas
de Petry estériles previamente rotuladas con una cantidad aprox de 20 ml por placa:
IMPORTANTE: la zona de envasado debe estar desinfectada, con los mecheros encendidos y
a la hora de verter el medio hemos de flamear la boca del frasco antes de vertir sobre la
placa, no debemos hablar ni pasar ningún objeto/mano por encima de las placas/tubos, ya
que debemos mantener unas condiciones de esterilidad.
E. Dejar enfriar y solidificar:
▪ Placas: dejar enfriar las placas destapadas y sin moverlas. Cuando haya gelificado,
invertimos las placas para evitar el agua de condensación, introducir las placas
invertidas en una bolsa de plástico o cubrir con papel de aluminio y guardar en la
nevera hasta su uso.
▪ Tubo inclinado: dejar enfriar los tubos tapados y apoyados sobre una gradilla.
Siempre debe hacerse un control de esterilidad a los medios preparados. Para esto
introducir un 5% del lote preparado en la estufa a 37º 18-24 horas.
ACTIVIDADES
1. Queremos preparar 28 placas del agar EMB (Agar con Eosina y Azul de Metileno). Si la etiqueta
del medio de cultivo deshidratado nos indica que se necesitan 28 grs. de agar para preparar un
litro. ¿Cuántos gramos habría que pesar para preparar las 28 placas? Justifique su respuesta.
Aproximadamente son 20 ml de medio de cultivo por cada placa. Multiplicamos 20ml * 28 placas que
queremos elaborar y nos da un resultado de 560ml que necesitamos. Ahora hay que hacer una regla de
tres si para 1000ml se necesitan 28 gramos de medio de cultivo, para 560ml se necesitaran 15,68 gramos
de medio de cultivo.
2. Necesitamos preparar 40 tubos medianos con agar tripticasa soya. A cada tubo debemos
echarle 5 ml de medio de cultivo. La etiqueta del medio dice que para elaborar un litro se deben
pesar 37,5 grs. ¿Cuántos gramos hemos de pesar para preparar los 40 tubos? Justifique su
respuesta.
Debemos echar 5 ml de medio de cultivo por cada tubo. Multiplicamos 5 ml * 40 tubos que queremos
elaborar y nos da un resultado de 200 ml que necesitamos. Ahora hay que hacer una regla de tres si para
1000ml se necesitan 37,5 gramos de medio de cultivo, para 200ml se necesitaran 7,5 gramos de medio
de cultivo
3. ¿Como verificarías que el medio de cultivo preparado quedo bien esterilizado y no lo contamino
cuando relleno el mismo en las Placas de Petry?
Metiendo una placa o dos sin cultivar en la estufa a la misma temperatura que las otras placas y observar
si hay crecimiento bacteriano. Si vemos colonias es porque el medio de cultivo ha sido contaminado
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4. ¿Qué es un cultivo mixto y que son cultivos axénicos? ¿Cuál crees que esa el paso más delicado
en la preparación de medios de cultivo y por qué?
El cultivo mixto es el que contiene dos o más especies o cepas del organismo; y cultivo puro (o axénico),
en el que todos los organismos son de la misma especie (o cepa).
La medición y la homogeneización de los medios de cultivo ya que si no se hace correctamente los cultivos
podrían no solidificar bien en las placas y echarse a perder.
5. La mayor parte de los medios de cultivos después de su preparación deben ser sometidos a
esterilización en el autoclave. Los medios de cultivo XLD, S. S, HEKTOEN nunca se esterilizan.
¿Por qué no se esterilizan estos medios?
Porque a muy elevadas temperaturas precipita el medio y no se homogeneiza correctamente
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PRACTICA 8: TÉCNICAS DE AISLAMIENTO. SIEMBRAS

• Medios de cultivo estériles en placas de Petri y tubos. (CLED, Mc Conckey, AGAR Nutritivo)
• Placas de Petri con cultivos microbianos.
• Asas de siembra bacteriológicas redondas y en punta.
• Muestras.
• Estufas.
• Mechero de Bunsen
• Rotulador permanente
PROCEDIMIENTO
A. SIEMBRA POR AGOTAMIENTO EN ESTRÍA

Es igual al del agotamiento de asa. Hay 2 técnicas de siembra, que básicamente se diferencian
únicamente en el número de pases
1. Rotular las placas que van a utilizarse (nombre, medio de cultivo, fecha, muestra)
2. Flamear el asa (si es de metal), dejar enfriar y tomar una colonia:
I. Tubo: quitar tapón sujetándolo con el dedo meñique de la mano dominante,
flamear la boca del tubo e introducir el asa de siembra (que también sujetamos con
mano dominante), sacar el asa y cerrar el tubo
II. Si es a partir de la placa, abrir y tomar con el asa.
3. Abrir la placa cogiéndola con la mano no dominante y realizar la primera descarga, cubrir
aprox. un tercio de la placa
4. Después de realizar la primera descarga, cerrar la placa de Petri y flamear el asa.
5. Sin cargarla de nuevo, se gira la placa unos 45º y arrastrando del final de las estrías realizamos
la segunda fase de las mismas
6. Se repite el procedimiento dos veces más hasta la última estría que finaliza con un pequeño
agotamiento en el centro de la superficie del medio de cultivo.
7. Cerrar la placa e invertirla
8. Tras la siembra flamear o eliminar el asa si es de un solo uso
9. Incubar a 37ºC, 24 h.
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BLOQUE IV: IDENTIFICACIÓN

BACTERIANA
Las bacterias toman del medio los nutrientes y por medio de distintas reacciones metabólicas (catalizadas
por enzimas) los trasforman en energía y en los distintos componentes celulares. Usando pruebas
bioquímicas podemos diferenciar los microorganismos atendiendo a sus vías metabólicas (reacciones de
oxidación-reducción, reacciones de las oxidasas, reacciones de la catalasa, reducción de nitratos, etc.)
Hemos de tener en cuenta que no es posible, generalmente, una correcta identificación bacteriana con
una única prueba bioquímica, pero combinándolas de forma adecuada (manual o con kits comerciales)
puede llegarse a una identificación junto a otros métodos de identificación (medios selectivos y tinciones)
PRÁCTICA 9: IDENTIFICACIÓN COCOS GRAM +

Como ya hemos estudiado en la unidad, uno de los grupos más importantes son los cocos, en esta práctica
nos vamos a centrar en la identificación de los G+. Recordad la clave dicotómica para la diferenciación/
identificación de los cocos:
La prueba principal para diferenciar los distintos cocos Gram positivos es la CATALASA, siendo por tanto la
primera prueba que llevaremos a cabo en la identificación de los mismos.
MATERIALES
• Microorganismos para testar en placa de agar sangre o BHI.

• Placas previamente preparadas de agar BHI.
• Placas previamente preparadas de agar medio hipersalino (medio Chapman].
• Portaobjetos o vidrio de reloj
• Agua oxigenada.
• Placas previamente preparadas de agar DNasa.
• HCI 1 N.
• Tubo previamente preparado de medio liquido bilis esculina
PROCEDIMIENTO
1. Rotular una placa/tubo de cada medio.

2. Crecimiento en agar usual: sembrar por agotamiento la muestra en agar BHI (Brain Heart
Infusion). Incubar a 37 ºC durante 24-48 horas y leer el resultado. La prueba es positiva si hay
crecimiento.
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3. Crecimiento en agar hipersalino y fermentación del manitol: sembrar por agotamiento la muestra
en una placa de agar Chapman o manitol hipersalino. Incubar a 37ºC durante 24-48 horas y leer
el resultado. La prueba es positiva
a. Al crecimiento en medio hipersalino: Si hay colonias
b. A la fermentación de manitol: si aparece un halo amarillo alrededor de las colonias o un
cambio en la coloración de todo el medio.
4. Hidrólisis de la esculina: tomar una colonia del microorganismo problema y resuspenderla en un

tubo con medio líquido bilis esculina. Incubar a 37 ºC durante 24-48 horas y leer el resultado. Esta
prueba se considerará positiva si el medio se ennegrece.(puede hacerse también en placa)
5. Prueba de la catalasa:
a. Rotular un portaobjetos.
b. Colocar en el portaobjetos una colonia bacteriana fresca crecida en el agar BHI. (OJO: tomar
siempre la colonia a partir de un medio SIN sangre, ya que los eritrocitos tienen actividad de
catalasa y pueden falsear los resultados)
c. Añadir encima una gota de agua oxigenada al 3 %.
d. Leer el resultado a los 10-20 segundos.
e. Prueba positiva si aparece gas /efervescencia.
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6. Prueba de la DNasa:
a. Inocular la placa de agar DNAsa con varias colonias: Puede hacerse una siembra en botón
(hasta 4 botones por placa) o sembrar en forma de línea.
b. Incubar a 37ºC durante 24-48 horas.
c. Inundar la placa con ácido clorhídrico de concentración 1 N, dejar que este penetre en la
superficie del medio durante 2 minutos y leer el resultado.
d. Resultado: positiva si aparece un halo transparente alrededor de las colonias, indica
presencia de DNAsa. S. aureus es positivo y S. epidermidis y S. saprophyticus son negativos
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ACTIVIDADES
1. Dibuja en tu cuaderno los resultados de las pruebas de la DNasa, la fermentación en manitol y

la hidrólisis de la esculina.
2. ¿Has podido identificar a nivel de género y especie todos los microorganismos problema?
Indica el género o especie de cada uno de ellos, explicando en qué te has basado.
Después de haber realizado la tinción de Gram y observar cocos Gram positivos. Empezamos con la prueba
de la catalasa para diferenciar el género, al ser positiva estamos tratando con un Staphylococcus.
Cultivamos una colonia en una placa de agar hipersalino, como hay fermentación se trataría de un S.aureus
pero puede tratarse de un error ya que la solidificación del medio no se realizó correctamente y por lo
tanto la elaboración tampoco. La prueba de la DNAsa es negativa así que se trata de un Staphylococcus
epidermididis. La prueba de la hidrólisis de esculina se realiza para la identificación de enterococos
3. ¿Es necesario realizar todas las pruebas a todos los microorganismos problema, o en función
de alguno de los resultados obtenidos podemos evitar la realización de alguna de las demás
pruebas?
Por ejemplo, se realiza primero que todo la prueba de la catalasa para diferenciarlos a nivel de género y a
partir de ahí elegir las pruebas convenientes para la identificación de especies. Si estamos trabajando con
un enterococo no vamos a realizar la prueba fermentación del manitol salado ya que eso es para
estafilococos
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4. Realiza un árbol de decisión que incluya las pruebas empleadas para la identificación de cocos
grampositivos.
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PRÁCTICA 10: IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS

Las enterobacterias son las responsables de numerosas infecciones y se aíslan con facilidad de diferentes
muestras clínicas. Hemos de tener una muestra en placa de agar sangre, que previamente debe haber sido
identificadas como bacilos gramnegativos mediante tinción de Gram. Para su identificación se llevarán a
cabo varias pruebas fenotípicas: crecimiento selectivo en agar McConkey, prueba de TSI, indol, rojo de
metilo, Voges-Proskauer, utilización de citrato y ureasa. Esta práctica está pensada para ser realizada en
tres sesiones.
• En la primera sesión se preparará el material necesario para las pruebas de identificación

• En la segunda sesión se realizarán las pruebas
• En la tercera, se analizarán los resultados obtenidos.
MATERIALES
- Muestra Placas previamente preparadas de agar McConkey Peptona. NaCl.

- Reactivo de Kovacs.
- Tubos para incubación en aerobiosis.
- Agar TSI
- Solución de alfa-naftol al 5 % en etanol.
- Hidróxido de potasio al 40 %.
- Solución de rojo de metilo.
- Agar citrato de Simons.
- Agar urea de Christensen.
PROCEDIMIENTO
• Parte I. Preparación del material

1. Preparación de tubos para la prueba de Indol:
Preparar 100 ml de caldo de cultivo líquido con triptófano al 1 %.
Para ello, disolver 1 g de peptona y 0,5 g de NaCI por cada 100 ml de agua destilada. Distribuir
con pipeta en tubos, tapar y preparar para su esterilización una vez que tengamos todo el
material.
2. Preparación de tubos para la prueba de Rojo de metilo y Voges-Proskauer:
Preparar 100 ml de agar MRVG siguiendo las instrucciones del fabricante y distribuir con
pipeta en tubos.
Tapar y preparar para su esterilización una vez que tengamos todo el material.
3. Preparación de tubos para la prueba de TSI:
Preparar 100 ml de agar TSI siguiendo las instrucciones del fabricante y distribuir con pipeta
en tubos, llenándolos aproximadamente hasta la tercera parte.
4. Preparación de tubos para la prueba de citrato: preparar 100 ml de agar citrato de Simons
siguiendo las instrucciones del fabricante y distribuir con pipeta en tubos, llenándolos
aproximadamente hasta la tercera parte.
Tapar y preparar para su esterilización una vez que tengamos toda la materia
5. Preparación de tubos para la prueba de ureasa:
Preparar 100 ml de agar urea de Christensen siguiendo las instrucciones del fabricante y
distribuir con pipeta en tubos, llenándolos aproximadamente hasta la tercera parte.
6. Esterilizar en autoclave a 120 ºC durante 15-20 minutos.
7. Una vez terminado el proceso de autoclavado, sacar los tubos de TSI, citrato y agar urea de
Christensen y colocarlos inclinados para que solidifiquen en pico de flauta.
21
• Parte II: Realización de las pruebas

1. Crecimiento en agar McConkey:
a. Rotular una placa de agar McConkey
b. Sembrar los microorganismos problema en sus respectivas placas.
c. Incubar a 37ºC durante 24 horas.
Todas las enterobacterias crecen en este medio selectivo. Aquellas que fermentan la lactosa con
producción de ácidos producirán un cambio de color del medio a rojo
2. Prueba TSI:
a. Rotular un tubo de TSI .
b. Sembrar los tubos de TSI en dos zonas
Zona anaerobia: tomar una colonia con un asa acabada en punta e introducirla
verticalmente en el agar por la zona inferior del pico.
Zona aerobia: una vez realizada la punción del agar, sacar el asa nuevamente hasta la
superficie del agar y sembrar el pico estriando la superficie.
c. Poner el tapón e incubar los tubos a 37 °C durante 24 horas.
d. Leer los resultados anotando el color del fondo, superficie, si se ha producido gas y si
aparece coloración negra.
Fondo y superficie rojos: negativo para glucosa, lactosa y sacarosa.
Fondo amarillo y superficie roja: positivo solo para la glucosa.
Fondo y superficie amarillos: positivo para glucosa, lactosa o sacarosa. Aparición de
burbujas: positivo para la producción de gas. Aparición de coloración negra: positivo
para la producción de H2S
3. Prueba del indol:
a. Rotular un tubo de indol
b. Inocular los tubos de indol con una colonia fresca crecida en medio sólido, poner el
tapón e incubar a 37 ºC en aerobiosis durante 24-40 horas.
c. Añadir 0,5 ml del reactivo de Kovacs al caldo de cultivo y leer los resultados.
d. Esta prueba se considerará positiva si aparece un anillo de color rosado en la parte
superior del medio.
4. Prueba del rojo de metilo y Voges-Proskauer:
a. Rotular dos tubos de caldo MRVP.
b. Inocular los tubos con cultivo fresco e incubar 24-48 horas a 37 ºC en aerobiosis.
c. Obtener los resultados para Voges-Proskauer Añadir a 1 ml del cultivo 12 gotas de
solución de alfa-naftol al 5 % en etanol y 4 gotas de hidróxido de potasio al 40 %. Agitar
bien y leer a los 5-10 minutos. Esta prueba se considerará positiva si aparece color rojo.
d. Obtener los resultados para el rojo de metilo. Añadir a 5 ml del cultivo 5 o 5 gotas de la
solución de rojo de metilo y leer la reacción de inmediato.
e. Esta prueba se considerará positiva si aparece un color rojo brillante.
5. Prueba de la utilización de citrato:
a. Rotular un tubo de citrato.
b. Inocular los tubos estriando la superficie, poner el tapón e incubar a 37 ºC en aerobiosis
durante 24-48 horas.
c. Leer los resultados.
d. Esta prueba se considerará positiva si aparece crecimiento bacteriano con cambio del
medio a color azul intenso.
6. Prueba de la ureasa:
a. Rotular un tubo de agar urea de Christensen .
b. Inocular los tubos estriando la superficie, poner el tapón e incubar a 37 ºC en aerobiosis
durante 24-48 horas.
c. Leer los resultados.
d. Esta prueba se considerará positiva si aparece color entre naranja pálido y rosa fucsia.
22
ACTIVIDADES
1. Describe la apariencia y color de cada microorganismo en las placas de agar McConkey.
Se observan colonias incoloras de Bacilos G-, por lo tanto, no fermentan lactosa
2. Dibuja en tu cuaderno y pinta con sus respectivos colores los tubos obtenidos en cada prueba
para cada uno de los microorganismos problema.
Citrato, Indol, Ureasa, VP/RM, TSI
3. Completa la tabla siguiente con los resultados positivos y negativos obtenidos en cada una de
las pruebas para cada uno de los microorganismos problema.
TSI INDOL ROJO VP CITRATO UREASA

DE
Microorganismo PRODUCCIÓN GLUCOSA LACTOSA H2S METILO
DE GAS O
SACAROSA
A
- - - - - - - + +
23
Según la Tabla siguiente, identifica, atendiendo a los resultados obtenidos, cada uno de los
microorganismos problema
Observaciones: nuestras pruebas salieron mal ya que el profesor sabía que microorganismos nos había
dado a cada grupo para la identificación y las pruebas no salieron correctamente para ese microorganismo
en concreto
24
PRÁCTICA 11: ANTIBIOGRAMA

En esta práctica vamos a llevar a cabo un antibiograma por el procedimiento de las pruebas con disco para
valorar la sensibilidad de distintos antibióticos frente a las bacterias presentes en una muestra.
MATERIAL
- Pinzas estériles
- Hisopo de algodón
- Mechero Bunsen
- Estufa de cultivo
- Regla
- Placas de Mueller-Hinton
- Patrones de MacFarland
- Suero fisiológico estéril
- Cuatro discos para antibiograma (Vancomicina, Eritrornicina, Clinclamicina, Amoxicilinalácido
clavulánico, Ciprofloxacino...)
PROCEDIMIENTO
1. Preparar un tubo con 5 ml de suero fisiológico estéril e introducir en él 3 o 4 colonias del cultivo,
este debe ser un cultivo puro de 24 h.
2. Ajustar a una turbidez de 0,5 en la escala de McFarland
3. Inocular toda la superficie de una placa con Mueller Hinton con la suspensión obtenida utilizando
el hisopo y dejad secar unos 5 min. Para garantizar una siembra uniforme, primero pintamos un
aspa, luego extendemos en las 3 direcciones del espacio y terminamos sembrando en circulo
alrededor de la placa
4. Con unas pinzas estériles (o con un dispensador automático), colocar los cuatro discos de
antibiótico sobre la placa y esperad unos 15 min para que el antibiótico difunda en el gel.
5. Poner a incubar la placa unas 18-24 horas a 37 °C. 5.
6. Una vez completada la incubación, medir el diámetro del halo formado alrededor de cada disco
usando una regla o calibre y estimar si la cepa es S, R o l a cada antibiótica
7. Utilizando la siguiente tabla de patrones estándar del halo de inhibición y punto de corte
equivalente a la CMI para E. coli que reproducimos a continuación:
En nuestro caso el microorganismo es resistente a todos los antibióticos, por lo que no calculamos
25
PRÁCTICA 12: API 20E

FUNDAMENTO
Permite la identificación de enterobacterias y otros bacilos gramnegativos no exigentes y consta de 20

pruebas miniaturizadas.
MATERIALES
- Microorganismos problema crecidos en medio sólido

- Tubos con solución salina.
- Tiras de la galería API 20E.
- Asa de siembra.
- Pipeta estéril
- Parafina
PROCEDIMEINTO
1. Realizar la prueba de la oxidasa a los microorganismos problema. Si son oxidasa negativa

entonces llevaremos a cabo la API 20E
2. Rotular los tubos de solución salina con la identificación de los microorganismos problema.
3. Resuspender una colonia aislada de forma homogénea en 5 mL de solución salina (1% de NaCl)
o 5 mL de agua estéril.
4. Rotular las tiras API en la solapa
5. Llenar tubos con una pipeta estéril, llenar con la suspensión de cada microorganismo todos los
pocillos de la tira API. Al llenarlos. NO sobrepasar la zona cubierta del pocillo. Salvo en el caso de
los pocillos CIT VP y GEL que deberán llenarse por completo. es decir, la parte cubierta por plástico
y la cúpula. Evitar dejar burbujas en la zona inferior.
6. Cubrir con parafina los pocillos ADH. LDC. ODC, URE y HA.
7. Añadir 5 ml de agua estéril en los alvéolos de la cámara de incubación de la tira para proporcionar
una atmósfera húmeda e introducimos la tira API en la estufa a 37 °C durante 24 h.
LECTURA
Observar la coloración de cada pocillo comparar con la tabla de referencia.
26
Realizar el revelado de las pruebas que sean necesarias.
- TDA: añadir una gota de FeCl3 al 10 %. P

- VP: añadir una gota del reactivo 1 (KOH al 40 %) y una gota del reactivo 2 (C2HSOH).
- IND: añadir una gota de reactivo de Kovacs (esta prueba debe realizarse la última).
- Oxidasa: añadir una gota de reactivo tetrafenilendiamina recién preparado
Interpretación de los resultados
El microorganismo proporcionado fue una Pseudomona pero el código obtenido no coincide (es el
mismo microorganismo que empleamos para la identificación de la práctica anterior)
27
ACTIVIDADES
1. ¿Para qué se utiliza la parafina?

Para generar un ambiente de anaerobiosis, para aquellos microorganismos que no necesitan oxigeno
2. ¿Para la identificación de qué grupo bacteriano se utiliza la galera multiprueba API 20E?
Para la identificación de enterobacterias y otros bacilos gramnegativos no exigentes
3. Escribe correctamente la especie bacteriana de cada uno de los m.o problemas

Pseudomona aeruginosa y Escherichia coli
4. ¿De cuantas pruebas miniaturizadas se compone la galería API 20E?
De 20 micropocillos
5. ¿Para qué sirve la galería API 20 Strep?

Para la identificación de microorganismos pertenecientes al género Streptococcus sp. y enterococos
28
DIARIO DE TRABAJO EN LABORATORIO

Todas estas prácticas están explicadas arriba, tanto el procedimiento como el resultado, Si
alguna práctica no está del todo explicada se detallará aquí abajo.
04/10/2023. TINCIÓN CON NIGROSINA
(PÁGINA 6. PRÁCTICA 4)
04/10/2023. TINCIÓN CON AZUL DE METILENO
05/10/2023. OBSERVACION EN FRESCO
12/10/2023. TINCIÓN DE GRAM
16/10/2023. SIEMBRA POR AGOTAMIENTO EN ESTRÍA
(PÁGINA 15. PRÁCTICA 8.A)
Estas siembras se realizaron en 3 medios de cultivo:
• Agar Nutritivo
• Agar McConckey
• Agar CLED
Los resultados fueron:
29
En la McC no creció nada
18/10/2023. TINCIÓN DE GRAM A PARTIR DEL CULTIVO ANTERIOR, PRUEBA DE LA OXIDASA Y

CATALASA
En la tinción de Gram que se realizó a partir de una colonia sembrada en el agar nutritivo, se
observaron cocos en forma de racimo Gram positivos, es decir, estafilococos
Posteriormente se realizaron las pruebas:
• Catalasa: Añadir una gota de peróxido de

hidrógeno en un portaobjetos y posteriormente
con un asa de siembra añadir una colonia de
bacterias. Observar presencia de burbujas.
POSITIVA. Staphylococcus spp.
• Oxidasa. Añadir una gota de Reactivo de
Kovacs a un papel de filtro y mezclar con un asa
de siembra una colonia de bacterias. Observar
cambio de color del reactivo. NEGATIVO
30
23/10/2023.
PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO
En esta práctica se prepararon 500 mL de cada medio de cultivo:
• Agar Chapman
• Agar ADNasa
• Agar Chocolate
En mi caso, fue una preparación de placas con medio BHI (Brain-Heart Infussion) el
procedimiento fue el siguiente:
1- Nombrar las placas con fecha y medio de cultivo

2- Sacar cultivo del autoclave con cuidado de no quemarse
3- Dejar templar y rellenar las placas alrededor de un Mechero Bunsen o en la Cabina de
Bioseguridad
4- Dejar enfriar los medios de cultivo
En estas placas sembramos una colonia de los microorganismos que teníamos en una placa con
agar nutritivo
OBSERVACION MICROSCOPICA DE HONGOS
Este día mientras algunos compañeros preparábamos los medios de cultivo y las placas con el
agar BHI, otros compañeros realizaron una observación de los hongos que nos había aportado
el profesor (posteriormente, los compañeros que hicieron los medios de cultivo también
hicieron esa práctica)
Materiales
- Portaobjetos
- Cinta adhesiva
- Muestra incubada de placa
- Azul de metileno
- Microscopio
- Mechero Bunsen
Procedimiento
1- Encender el mechero Bunsen y colocar el material alrededor de esa zona

2- Cortar un pedazo de celo, cogiéndolo con unas pinzas para evitar marcar la huella del
guante o que se contamine
3- Extender sobre la placa con los hongos
4- Añadir 1 gota de azul de metileno en un portaobjetos
5- Despegar la cita de la placa con los hongos y pegar sobre el portaobjetos con el azul de
metileno evitando la formación de burbujas
6- Observar en microscopio
31
25/10/2023 (PRACTICA 9)
VISUALIZACION AGAR BHI
25/10/2023. RESULTADOS DEL CULTIVO EN AGAR NUTRITIVO
Se observan cocos Gram+. Prueba de la catalasa positiva y prueba de la oxidasa negativa
25/10/2023-26/10/2023. IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM+. RESULTADOS
25/10/2023-26/10/2023. SIEMBRA EN AGAR PSEUDOMONA
06/11/2023.
TINCION GRAM BACTERIAS EN ORINA.
HACER ESCALA DE MCFARLAND 0,5 CON ORINA
Y DILUCION SERIADA DE ORINA 9:1 A PARTIR DE LA ESCALA MCFARLAND 0,5
SIEMBRA EN CULTIVOS
TINCIÓN ZIEHL-NEELSEN
08/11/2023-09/11/2023
RESULTADOS Y PRUEBAS EN DISTINTOS AGARES Y CALDOS DE CULTIVO PARA IDENTIFICACION

DE BACILOS GRAM NEGATIVOS
API20E
ANTIBIOGRAMA
32
22/11/2023-23/11/2023
IDENTIFICACION DE BACTERIAS PROBIOTICAS (MORFOLOGÍA Y METABOLISMO)
Materiales
- Portaobjetos
- Asa de Siembra
- Pinzas de madera
- Frasco lavador con agua destilada
- Aceite de inmersión
- Papel de filtro
Equipos
- Microscopio
- Estufa de cultivo
- Microscopio
Reactivos
- Colorantes de Tinción de Gram

- Alcohol-Acetona
- Reactivo de Kovacs
- Peróxido de hidrógeno
Muestras
- Tubo de probióticos
- Placas de Agar sangre y Metkoen
Procedimiento
1- Realizar una tinción de Gram para saber con que tipo de microorganismo estamos
trabajando
2- Siembra por agotamiento en agar Metkoen y agar sangre y llevar a incubar a la estufa a
37 ºC
3- Realizar al día siguiente una tinción de Gram del agar sangre y las pruebas de oxidasa y
catalasa
RESULTADOS
Bacilos gram – y Cocos Gram +
- Catalasa +
- Oxidasa –
33
29/11/2023-30/11/2023
IDENTIFICACION DE BACTERIAS PUERTA ENTRADA INSTITUTO
Se recogió una muestra con un Hisopo estéril, la cual se sembró en un medio de cultivo y
posteriormente a incubarlo observamos el crecimiento de colonias bacterianas e incluso hongos.
Las colonias bacterianas después de su identificación resultaron ser Staphylococcus epidermidis:
- Tinción de Gram: Cocos en forma de racimo Gram +

- Prueba de catalasa: Positiva
- Prueba de oxidasa: Negativa
- Siembra en agar sangre para saber que tipo de estafilococo es: Colonias pequeñas,
blanquecinas y sin hemólisis
-
34

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CUADERNO

✓ Identificar la presencia de bacterias en una muestra.

El fundamento de la observación en fresco de bacterias se basa en la visualización directa de las bacterias

Directamente desde la muestra:

Según el cultivo de partida:

Si preparamos un frotis con una cantidad excesiva de

Si preparamos un frotis con una cantidad

PRACTICA 3: TINCIÓN AZUL DE METILENO

DETERMINACION DE BACTERIAS LÁCTICAS DEL YOGUR

Añadir el inoculo Tomar el portaobjetos

Por útlimo dejar secar y observar en el microscopio

1. ¿Qué tipo de célula posee una bacteria?

Se observan cocos y bacilos, en concreto estreptococos

PRACTICA 4: TINCIÓN DE NIGROSINA

La nigrosina es una sustancia oscura insoluble que tiñe el fondo de la preparación.

Los microorganismos se observan brillantes por el contraste sobre el fondo teñido.

Poder visualizar bacterias con cápsulas, esporas o flagelos

PRACTICA 5: TINCIÓN DE GRAM

• Aprender a confeccionar correctamente una extensión para su posterior tinción a partir de

• Portaobjetos con muestra fijada al calor

1. Sumergir el portaobjetos en cristal-violeta de genciana y mantener durante 1 minuto.

Se aprecian Estafilococos Gram + la mayoría, aunque también podemos observar Estreptococos

2. Diga los pasos de la técnica de la coloración de Gram.

Para evitar que la morfología de las bacterias varíe o se rompan

4. ¿Cuál es el paso más crítico en la coloración de Gram y por qué?

5. Cuál es la morfología típica y la agrupación de las células bacterianas

6. Averigüe que bacterias no se tiñen con la coloración de Gram y porque

7. ¿Qué es una bacteria pleomórfica?

PRACTICA 6: TINCIÓN DE ZIEHL NIELSEN

• Realizar la coloración de Z. Nielsen, conocer la importancia de la misma en los laboratorios de

• Esputos traídos por los estudiantes.

1. Realizar una extensión sobre un porta a partir de la muestra proporcionada.

1. Técnica de la coloración de Z. Nielsen su aplicabilidad y fundamento.

BLOQUE II: SIEMBRA

C. Esterilizar la disolución en el autoclave: 15-20 minutos, a121º C y 1 atm de presión. Al

Porque a muy elevadas temperaturas precipita el medio y no se homogeneiza correctamente

PRACTICA 8: TÉCNICAS DE AISLAMIENTO. SIEMBRAS

A. SIEMBRA POR AGOTAMIENTO EN ESTRÍA

BLOQUE IV: IDENTIFICACIÓN

PRÁCTICA 9: IDENTIFICACIÓN COCOS GRAM +

• Microorganismos para testar en placa de agar sangre o BHI.

1. Rotular una placa/tubo de cada medio.

4. Hidrólisis de la esculina: tomar una colonia del microorganismo problema y resuspenderla en un

1. Dibuja en tu cuaderno los resultados de las pruebas de la DNasa, la fermentación en manitol y

PRÁCTICA 10: IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS

• En la primera sesión se preparará el material necesario para las pruebas de identificación

- Muestra Placas previamente preparadas de agar McConkey Peptona. NaCl.

• Parte I. Preparación del material

• Parte II: Realización de las pruebas

1. Describe la apariencia y color de cada microorganismo en las placas de agar McConkey.

Se observan colonias incoloras de Bacilos G-, por lo tanto, no fermentan lactosa

Citrato, Indol, Ureasa, VP/RM, TSI

TSI INDOL ROJO VP CITRATO UREASA

PRÁCTICA 11: ANTIBIOGRAMA

PRÁCTICA 12: API 20E

Permite la identificación de enterobacterias y otros bacilos gramnegativos no exigentes y consta de 20

- Microorganismos problema crecidos en medio sólido

1. Realizar la prueba de la oxidasa a los microorganismos problema. Si son oxidasa negativa

Observar la coloración de cada pocillo comparar con la tabla de referencia.

Realizar el revelado de las pruebas que sean necesarias.

- TDA: añadir una gota de FeCl3 al 10 %. P

Interpretación de los resultados

1. ¿Para qué se utiliza la parafina?