UNIVERSIDAD NACIONAL INTERCULTURAL DE LA AMAZONIA

FACULTAD DE INGENIERÍA Y CIENCIAS AMBIENTALES

CARRERA PROFESIONAL INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

Informe N° 08

TEMA: “Aislamiento de bacterias y tinción de Gram ”

Asignatura : Microbiología Agroindustrial

Docente : Ing. Estacio Albornoz, Darwin Josué

Alumna : Zambrano Ojeda Judiryth

Código de Alumno 2011204029

Año y Semestre : 2022-2

Yarinacocha – Ucayali

Perú – 2023
I. INTRODUCCION

En esta práctica se realizó la identificación de microorganismos en el huevo y

pasamos a realizar la tinción de Gram para poder observar a que especie pertenece,
es complicado si no se realizan los pasos correctos del aislamiento y de la tinción de
Gram. Esta práctica nos enseña también como uno debe ser muy cuidadoso ya que
si hacemos una mala manipulación del medio de cultivo nuestras muestras pueden
ser invadidas por otros tipos de microrganismos no deseados que serán flejadas
cuando observamos en las placas Petri, por ende, tener un ambiente esterilizado
también es clave para que nuestros sembríos estén en óptimas condiciones y nos
den los resultados deseados que será identificar salmonella en el huevo.

II. OBJETIVOS

2.1. Objetivo general

➢ Aprender el aislamiento de bacterias y tinción de Gram

2.1. Objetivos específicos

➢ Identificación de salmonella en el huevo

➢ Examinar el uso correcto del medio de cultivo

➢ Diferenciar bacterias por tinción de Gram

III. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

3.1. Presencia de salmonella en huevo

En condiciones de reproducción saludables, el contenido de un huevo

generalmente es estéril justo después de la puesta. Sin embargo, pueden
estar contaminados por un microbiota diversificado que contiene
microorganismos que deterioran los alimentos y, a veces, bacterias
patógenas. Los huevos pueden contaminarse tanto externamente, en la
cáscara del huevo, como internamente, es decir, durante el desarrollo. Por lo
tanto, el huevo puede ser un vector de bacterias
que causan enfermedades transmitidas por los alimentos en humanos: este es
particularmente el caso de Salmonella (Baron 2011).
Existen múltiples formas en que los huevos pueden contaminarse con
microorganismos patógenos y existen varios patógenos transmitidos por los
 alimentos que poseen la capacidad de penetrar en el contenido interno del
huevo y persistir durante toda la vida útil (Sharaf 2019)
Hay dos rutas de contaminación microbiana del huevo, vertical y horizontal. La
contaminación vertical (transovárica) ocurre cuando los óvulos se infectan
durante su formación, ya sea en el ovario o en el oviducto. La transmisión
horizontal ocurre después de que el huevo ha sido puesto y expuesto a las
bacterias posteriores a la puesta, por lo que las bacterias ingresan a través de
la cáscara (Gast 2019)

3.2. Influencia de la contaminación ambiental

El crecimiento bacteriano en la clara de huevo y la migración a la yema no solo

depende del microorganismo, sino también de la calidad del huevo y, en
general, de las condiciones de almacenamiento tiempo y temperatura
(Duboccage 2001)
Demostraron que las condiciones en huevos de menos de 1 semana
almacenados a 20 °C pueden ser más favorables para el crecimiento
de Salmonella que las de huevos almacenados a esta temperatura después
de una puesta de 2 a 3 semanas. Después de tres semanas, las condiciones
también pueden favorecer a Salmonella probablemente debido a la alteración
de la membrana vitelina y a la disminución de la viscosidad del huevo, ambos
debidos a la disociación del complejo ovomucina-lisozima a pH alcalino (el pH
cambia de 7,6 a aproximadamente 9,3 tras la pérdida de dióxido de carbono
unos días después tendido). Estos dos factores favorecen la entrada de
nutrientes de la yema de huevo a la clara de huevo y la migración
de Salmonella a la yema (Baron 2011).

3.3. Difusión bacteriana

Es una técnica que permite evaluar bacterias heterotróficas, aerobias totales

(BAT), bacterias reductoras de sulfato (BRS), anaerobias heterotróficas totales
(BAnT). La técnica de dilución consiste en inocular una serie de frascos tipo
antibiótico que contienen 9 mililitros del medio de cultivo apropiado según el tipo
de bacteria que se quiere evaluar.Se obtiene un mililitro de la muestra usando
una jeringa descartable, estéril de 1 o 2 mililitros, de capacidad. Se inocula el
primer frasco, sin retirar la aguja del mismo, se invierte y se retira 1 mililitro que
se inocula en el 2do frasco. Con una nueva jeringa se retira 1 ml del frasco no.
 2, previamente agitado y se inocula el frasco No. 3, y así sucesivamente
utilizando una nueva jeringa para cada frasco. Mediante el uso de esta técnica
de simple ejecución y fácil interpretación, se pueden evaluar diferentes grupos
bacterianos según el medio de cultivo que contenga el frasco (Ramírez 2014)

3.4. Medio de cultivos

3.4.1. ¿Qué es un medio de cultivo?

Un medio de cultivo es una técnica de laboratorio que consta de una

solución con los nutrientes necesarios para permitir, en condiciones
favorables de pH y temperatura, el crecimiento de virus, microorganismos,
células, tejidos vegetales Actualmente existen más de 10.000 medios de
cultivo diferentes, cada uno con nutrientes y factores de crecimiento
necesarios, que aunque tengan muchas y diferentes condiciones, como
humedad, temperatura, oxigeno, aislamiento, alcalinidad y más, tienen
como objetivo principal, el desarrollo y crecimiento de las bacterias
(Worrich 2017).

3.4.2. Agar Salmonella Shigella

El agar Salmonella-Shigella también conocido como agar SS, es un

medio moderadamente selectivo y diferencial, especialmente diseñado
para el aislamiento de bacterias enteropatógenos de los géneros
Salmonella y Shigella, tanto de muestras ambientales como clínicas. El
agar SS tiene una composición compleja; está constituido por extracto de
carne, peptona, lactosa, sales biliares, citrato de sodio, tiosulfato de sodio,
citrato férrico, agar, rojo neutro, verde brillante y agua destilada. Dada su
gran selectividad se pueden sembrar muestras con abundante flora mixta.
En los laboratorios de microbiología el medio Salmonella-Shigella es muy
utilizado para investigar la presencia de Salmonella y Shigella en muestras
de heces diarreicas, aguas residuales, agua potable y alimentos y El agar-
agar es el encargado de brindar la consistencia sólida al medio (Worrich
2017).
 3.4.3. Peptona

La peptona es un medio no selectivo para el enriquecimiento previo de

varias bacterias en muestras de alimentos. También es utilizada para la
dilución primaria, y diluciones decimales, en la preparativa de muestras
(Teran 2019)

3.4.4. Método de siembra

El método de sembrado es muy importante para poder distribuir el inoculo

de tal manera que las bacterias presentes queden dispersas y puedan
desarrollar colonias debidamente aisladas. Las colonias obtenidas en el
medio de cultivo sólido es la consecuencia de la proliferación del
microorganismo que fue sembrado. Cada colonia parte de una sola
bacteria, que puede multiplicarse de forma exponencial hasta formar una
población macroscópicamente visible (Solís 2017)

3.5. Tinción de Gram

Es definida como una tinción diferencial, ya que utiliza dos colorantes y clasifica
las bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram negativas y Gram
positivas. Fue desarrollada por el científico danés Hans Christian Gram en
1884, hoy en día sigue siendo una de las tinciones más utilizadas
universalmente. Se basa en las características de la pared celular de las
bacterias, la cual le confiere propiedades determinantes a cada
microorganismo La tinción de Gram se basa en colocar como colorante
primario cristal violeta, el cual tiene afinidad con el peptidoglicano de la pared
bacteriana. Posteriormente, se coloca lugol, el cual sirve como mordiente e
impide la salida del cristal violeta por la formación de un complejo cristal violeta-
yodo que satura los espacios del peptidoglicano de la pared bacteriana. En
seguida, se coloca una mezcla de alcohol-acetona, la cual deshidrata la pared
bacteriana y cierra los poros de la misma, también destruye la membrana
externa de las bacterias Gram negativas debido a que ésta es soluble a la
acción de solventes orgánicos, como la mezcla de alcoholacetona. Las
bacterias Gram positivas, al contener una gran cantidad de peptidoglicano,
retienen con mayor fuerza este complejo, mientras que las Gram negativas no
lo pueden retener por tener menos cantidad de peptidoglicano. Por último, se
coloca safranina, la cual funciona como un colorante secundario o de contra
tinción y sirve para teñir las bacterias que no pudieron retener el complejo
cristal violeta-yodo (Hernández 2014)
 3.5.1. Bacterias Gram negativas
Son todas aquellas que, por la tinción de Gram, se tiñen de un color
rosado tenue. Esta característica está íntimamente ligada a la
estructura di dérmica dada por la envoltura celular, ya que presenta
doble membrana celular (una es externa y la otra citoplasmática) entre
las que se localiza una fina pared de peptidoglucano lo que refleja un
tipo natural de organización bacteriana (Hernández 2014)

3.5.2. Bacterias Gram positivos

En microbiología, se denominan bacterias Gram positivas aquellas que
aparecen de color azul oscuro o violeta por la tinción de Gram. Esta
característica química está íntimamente ligada a la estructura de la
envoltura celular, por lo que refleja un tipo natural de organización
bacteriana. La envoltura celular de las bacterias Gram positivas
comprende la membrana citoplasmática y una pared celular
compuesta por una gruesa capa de peptidoglucano, que rodea a la
anterior. La capa de peptidoglicano confiere una gran resistencia a
estas bacterias y es la responsable de retener el tinte durante la tinción
de Gram (Hernández 2014).

IV. MATERIALES Y MÉTODOS

4.1. Materiales
✓ vasos precipitados
✓ matras
✓ tubos de ensayo
✓ Gradillas
✓ asa de siembra
✓ 12 placas Petri
✓ Micropipeta
✓ Algodón
✓ Hilo pabilo
✓ Ron de quemar
✓ Luna de reloj
✓ Papel craf
✓ Probeta
✓ Papel aluminio
✓ Plumón indeleble
 ✓ Huevo
✓ Porta objeto
✓ Microscopio
✓ Vortex
✓ Incubadora
✓ Autoclave
✓ Estufa de esterilización
✓ Cocinilla
✓ Mechero de bums
✓ Agar salmonella shigella
✓ Peptona
✓ Cristal violeta
✓ Colorante Lugol
✓ Alcohol acetato
✓ Safranina

4.2. Métodos

a. Se procedió a realizar los cálculos exactos para saber cuánto de peptona y

agar salmonella se utilizará en aislamiento de bacterias.

b. Luego comenzamos realizar el método de lavado del huevo para obtener

muestra.
c. Se comenzó hacer nuestro medio de cultivo con la peptona con el proceso
de dilución.

d. Después pasamos a realizar nuestros sembríos en el agar salmonella-

Shigela.

d. Lo dejamos en la incubadora por más de 42horas y luego paso la hora

estimada se pudo observar el crecimiento de salmonella.
V. RESULTADOS Y DISCUSIONES

5.1. Resultados
Tabla N°01: Resultados cualitativa y cuantitativa de bacterias en huevo
N° Dilución Descripción
1 10−1 Demasiada turbidez
2 10−2 Buena turbidez
3 10−3 Poca turbidez
Cualitativa
4 10−4 Muy poca turbidez
5 10−5 Turbidez tenue
6 10−6 No hay turbidez
N° Dilución Colonia UFC
1 10−1 14 140
2 10−2 9 900
Cuantitativa 3 10−3 4 4000

4 10−4 --- ---

5 10−5 --- ---

6 10−6 ---- ----

Tabla N° 2 : Resultados de la tinción de Gram

N° Muestra Forma Coloración Grupo
1 Colonia de Estafilococos Rosado Gran
bacteria de negativa
Salmonella-
Shigella

5.2. Discusiones

➢ Según Solís (2017) El método de estría es el más fácil y el más usado para
obtener cultivos axénicos. Efectivamente cuando realizamos la primera vez
los métodos de siembra puede darme cuenta que el método de dispersión
era uno de los más fáciles a la hora de sembrar.

➢ Según Lozano (2019) Para la elaboración de un medio de cultivo hay que

seguir las instrucciones dadas. Efectivamente es muy importante seguir todas
las instrucciones que dice para tener buenos resultados y no tener
complicaciones.
 ➢ Según Hernández, 2014 La tinción de Gram es un método de valiosa
utilidad en cualquier laboratorio de bacteriología, ya que permite revelar
detalles referentes a la forma de las bacterias. Efectivamente, la tinción de
Gram, específicamente los colorantes utilizados en el proceso; tiñen la
superficie permitiendo cambiar de color a las bacterias revelando de esta
manera las formas, esto ayuda a tener una definición clara al momento de
observar en el microscopio donde podemos clasificarles por la coloración
observada si son Gram negativa o Gram positiva.

➢ Según Baron, 2011 Los huevos pueden contaminarse durante su

formación en el oviducto. Claro que, si puede contaminarse ya que la
portadora de esta bacteria es la gallina y según Sharaf, 2019 Los huevos
pueden contaminarse durante su formación en el ovario o en el oviducto
de las gallinas infectadas.

➢ Según Baron, 2011 Incluso si la superficie del huevo está contaminada, la

cutícula, la cáscara y las membranas de la cáscara son barreras que
impiden la penetración de microorganismos. Efectivamente el huevo tiene
las barreras de protección, pero esto se llega a perder cuando hay una
ruptura de cascara ahí se llega a contaminar con microorganismos.

VI. CONCLUSIONES

✓ Se logró aprender el aislamiento de bacterias y tinción de Gram con esto se llegó a

concretar nuestro objetivo general, así llegando a terminar con éxito esta práctica.

✓ En esta práctica se llegó a realizar la identificación de salmonella en el huevo

cumpliendo así con el objetivo específico.
✓ Se examino el uso correcto del medio de cultivo así cumpliendo de esta manera los
objetivos planteados para la práctica, cabe recalcar que este proceso es muy
impórtate para que nuestro medio sea óptimo para la variedad de bacteria que se
pasara a sembrar.
✓ Por último, llegamos a diferenciar bacterias por tinción de Gram como paso final se
concluyó realizando este objetivo que nos ayuda a dividir las bacterias por los os
tipos que hay Gran negativa y Gran positiva.
VII. BIBLIOGRAFÍA

▪ Baron, F 2011 Microbiología del huevo y ovoproductos [En Línea]:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9781845697549500140#bb014
5
▪ Sharaf, E 2019. Calidad y seguridad del huevo con una descripción general de la
aplicación de recubrimiento comestible para la conservación del huevo [En Línea]
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814619309951
▪ Gast , P 2019. Contaminación de los huevos por Salmonella Enteritidis en
gallinas ponedoras infectadas experimentalmente de cuatro líneas genéticas
comerciales en jaulas convencionales y alojamiento en colonia enri quecida
[En Línea]: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S003257911948022X
▪ Duboccage, M 2001 Crecimiento de Salmonella en clara de huevo [En línea]:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9781845697549500140#bb0130
▪ Ramirez, J 2014 Dilución bacteriana [En Línea]:
http://microbiologia3bequipo5.blogspot.com/2014/10/dilucion-bacteriana.html
▪ Worrich,J 2017 Medio de cultivo [En Línea]
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0325754118301160
▪ Teran, R. 2019. Control Microbiológico. [En Línea]: Control microbiológico |
Identificar microorganismos | Bioser

▪ Solís, G. 2017. Métodos de sembríos en placa y tubo [En Línea]:

labdemicrobiologia.wixsite.com/scientist-site/t-cnicas-y-tipos-de-sembrado

▪ Hernández, D. 2014. Tinción y observación de microorganismos. [En Línea]

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0213005X183
▪ Lozano, A. 2019 Microbiología clínica. medio de cultivos [En línea]
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0213005X183
 VIII. Anexos
Imagen 1 Imagen 2

Medio de cultivo Pecton y Salmonella Homogenización de la dilución

Imagen 3 Imagen 4

Crecimiento de bacteria en medio liquido Crecimiento de bacterias en medi